Prácticas de Microbiología

Objetivos
• Reforzar conocimientos teóricos.
• Adquirir habilidades.
• Motivación.

Seguridad en el Laboratorio
• Reducción a un nivel aceptable, del riesgo
inherente a la manipulación de material
infeccioso.
• El equipamiento y el diseño contribuyen a
la seguridad sólo si las personas que
trabajan en el laboratorio conocen las
normas y las aplican.

Clasificación de agentes
biológicos
• Grupo 1: Poco probable que cause
enfermedad en el ser humano.

Clasificación de agentes
biológicos
• Grupo 1: Poco probable que cause
enfermedad en el ser humano.
• Grupo 2: Puede causar enfermedad al ser
humano, pero es poco probable que se
propague a la colectividad, y existe
tratamiento o profilaxis eficaz.

Clasificación de agentes
biológicos
• Grupo 1: Poco probable que cause enfermedad en
el ser humano.
• Grupo 2: Puede causar enfermedad al ser humano,
pero es poco probable que se propague a la
colectividad, y existe tratamiento o profilaxis
eficaz.
• Grupo 3: Puede causar enfermedad grave, con
riesgo de que se propague, pero existe profilaxis o
tratamiento eficaz.

Clasificación de agentes
biológicos
• Grupo 1: Poco probable que cause enfermedad en
el ser humano.
• Grupo 2: Puede causar enfermedad al ser humano,
pero es poco probable que se propague a la , y
existe tratamiento o profilaxis eficaz.
• Grupo 3: Puede causar enfermedad grave, con
riesgo de que se propague, pero existe profilaxis o
tratamiento eficaz.
• Grupo 4: Causa enfermedad grave, con muchas
probabilidades de que se propague y sin profilaxis
o tratamiento eficaz.

Seguridad biológica
• Equipo de seguridad (barreras
primarias): Aparatos y dispositivos
(cabinas de seguridad) y prendas de
protección personal (batas, guantes).

Seguridad biológica
• Equipo de seguridad (barreras
primarias): Aparatos y dispositivos
(cabinas de seguridad) y prendas de
protección personal (batas, guantes).
• Diseño y construcción (barreras
secundarias): Filtrado de aire,
superficies impermeables.

Seguridad biológica
• Equipo de seguridad (barreras primarias):
Aparatos y dispositivos (cabinas de
seguridad, extractores de gases) y prendas
de protección personal (batas, guantes).
• Diseño y construcción (barreras
secundarias): Filtrado de aire, superficies
impermeables.
• Técnicas de laboratorio: Conocimiento y
control de riesgos.

Niveles de contención
• Nivel 1: Cuando se emplean cepas no
patógenas. Ej. Microbiología de alimentos.
• Nivel 2: Para agentes tipo 2. Prácticas de
laboratorio en Universidades.
• Nivel 3: Agentes tipo 3. Peligro mas
frecuente: transmisión por aerosoles o
fluidos biológicos (Brucella, Coxiella..).
• Nivel 4: Agentes tipo 4, patógenos muy
contagiosos y sin tratamiento eficaz.

Normas básicas de seguridad
• Acceso limitado al personal autorizado.
• Limpiar las superficies de trabajo diariamente y
siempre que se produzca un derrame.
• No dejar objetos en los pasillos ni en lugares
donde interfieran con el trabajo.
• Usar SIEMPRE bata de laboratorio. No usar ropa
de trabajo que aumente la superficie corporal
expuesta (pantalón corto, sandalias).
• Si se tiene el cabello largo, llevarlo recogido.

Normas básicas de seguridad
• No colocar papeles ni libros en la zona de trabajo.
• PROHIBIDO comer, beber, fumar o llevarse
objetos a la boca. Evitar tocarse los ojos o la boca.
No pipetear con la boca.
• Lavarse bien la manos al final de la sesión o
siempre que se ensucien.
• Desechar agujas y jeringas usadas en los
contenedores apropiados.
• Si se usan guantes, desecharlos antes de salir del
laboratorio y lavarse las manos. No tocar con ellos
papeles, teléfono, etc.

Trabajo en el laboratorio
• Puntualidad. Bata de laboratorio.
• Lectura y comprensión previa del trabajo a
realizar.
• Orden: Se realizan varios experimentos a la
vez.
• Evitar movimientos bruscos.
• Identificar claramente placas y tubos
(rotulador impermeable al agua). Placas
boca abajo.

Trabajo en el laboratorio
• Flamear asa de siembra antes y después de usarla,
poniéndola al rojo vivo.
• Material contaminado de un solo uso: Bolsas de
polipropileno y autoclave. Los objetos punzantes
(agujas, portaobjetos etc.) deben depositarse en
contenedores especiales.
• Material de vidrio contaminado: doce horas en
desinfectante, luego se autoclava, se lava y se
seca.

Equipamiento de laboratorio
• Microscopio: Observar
objetos >2micras no
visibles a simple vista.
• Lentes: objetivos y
oculares.
• Fuente de iluminación
y diafragma.
• Micrométrico y
macrométrico.

Equipamiento de laboratorio
• Estufa: temperatura
adecuada para
crecimiento de
microorganismos.
Temperaturas
selectivas.
• Nevera: Conservación
de muestras, reactivos,

Equipamiento de laboratorio
• Autoclave:
Preparación de
medios, esterilización
de material e
instrumental,
esterilización de
basura.

Equipamiento de laboratorio
• Material de vidrio:
Vidrio borosilicado
(Pyrex). Volumétrico y
no volumétrico.
• Material plástico: Un
solo uso.

Equipamiento de laboratorio
• Mechero Bunsen: Base
sólida y tubo vertical.
Abrir el regulador de aire
se produce llama azul.
Parte mas calurosa de la
llama justo encima del
cono azul interno.
• Usos: flamear el asa,
calentar medios, esterilizar
el aire de la zona de
trabajo .

Diagnóstico microbiológico
• El microbiólogo clínico veterinario debe
colaborar con los veterinarios clínicos y con
otros miembros del equipo de salud para
proporcionar el diagnóstico y manejo
óptimo de los animales con enfermedades
infecciosas y para prevenir la diseminación
de la enfermedad. Es importante:
documentar la presencia de una infección,
determinar su naturaleza y administrar la
terapia adecuada.

Funciones del laboratorio
• Aislar e identificar microorganismos.
• Estudiar su sensibilidad.
• Determinar la naturaleza de las infecciones.
• Formar a los clínicos en técnica de toma de
muestras y transporte.
• Informar al personal responsable y a las
autoridades sanitarias sobre la aparición de
determinadas infecciones.
• Colaborar en la prevención y control de las
infecciones.

Diagnóstico de infecciones
• Información a través de la historia clínica
(dueño, visitas previas) y el examen clínico.

Diagnóstico de infecciones
• Información a través de la historia clínica
(dueño, visitas previas) y el examen clínico.
• Pruebas complementarias: Radiografías,
ecografías, electrocardiogramas, RMN,

Diagnóstico de infecciones
• Información a través de la historia clínica
(dueño, visitas previas) y el examen clínico.
• Pruebas complementarias: Radiografías,
ecografías, electrocardiogramas, RMN,
• Análisis clínicos: bioquímica, hematología,
MICROBIOLOGÍA.

Utilidad de los análisis
microbiológicos
• Diagnóstico de infecciones.
• Seguir la evolución de la enfermedad: curva
de aparición y desaparición de Ag y Ak en
serología; cultivos de control.
• Determinar la eficacia de un tratamiento
cuando los síntomas de mejora no sean
claros (ej. Infección urinaria).

Diagnóstico microbiológico
• Diagnóstico directo: Poner de manifiesto la
presencia del microorganismo (tinción,
cultivo).
• Diagnóstico indirecto: Demostrar la huella
que el microorganismo deja en el enfermo
(serología, técnicas genéticas).

Servicio de
Microbiología
Solicitud de análisis
Datos del paciente
Especie:
Raza:
Edad:
Sexo:
Propietario (nombre y teléfono):
Solicitado por:
Orientación diagnóstica:
Tratamiento previo:
Petición:
 Tinción  Cultivo  Anaerobios  Micobacterias  Hongos  Serología  Otros:
Muestra:
 Orina  Heces  Sangre  Exudado  Sangre  LCR  Esputo  Otros:
Fecha y hora de la obtención:
Observaciones:
Resultados:
Observaciones:
Fecha y hora de entrada:
Fecha de informe:
Firma:

Toma de muestras: Normas
generales
• Enviarlas por separado, bien empaquetadas
y correctamente identificadas.
• Acompañadas de volante de petición.
• Tomarlas lo mas pronto posible en relación
a la aparición de síntomas.
• Antes de iniciar tratamiento.
• Toma aséptica.

Toma de muestras: Normas
generales II
• Evitar la desecación (especialmente
hisopos).
• Tomar la muestra de los bordes de las
lesiones (zona de replicación).
• Conservación según el tipo de muestra. En
general, refrigeradas pero no congeladas.
Sueros congelados. Sangre, LCR, etc. A
temperatura ambiente o en estufa.

Toma de muestras: Orina
• Teóricamente líquido estéril.
• Evitar contaminación durante su recogida.
• Usar frascos estériles de poliestireno.
• Tiempo mas breve posible entre recogida y
procesamiento.
• Si es mas de 1 hora, refrigerar pero no
congelar.

Toma de muestras: Orina II
• Tres métodos de
recogida: directa,
sondaje y punción
suprapúbica..
• Preferible directo.
Necesidad de controlar
al animal y de que éste
coopere. Descartar la
primera parte de la
micción, recoger la parte
central y descartar el
resto.

Toma de muestras: Orina III
• Sondaje: Riesgos. Podemos provocar una
infeccción si la sonda no está estéril.
Descartar la primera parte de la micción
(flora de arrastre).
• Punción suprapúbica o cistocentesis:
Extraer la orina directamente de la vejiga
con aguja y jeringa estériles. No hay flora
de arrastre. Riesgos.

Toma de muestras: Heces
• Recogida en frasco limpio, no imprescindible que
sea estéril.
• Tienen flora habitual. Buscamos patógenos o
desequilibrios.
• Recoger en suelo limpio. Evitar la contaminación
con otros materiales: serrín, tierra.... Asegurarse de
que sea el animal correcto.
• Dificultad para obtener la muestra: Hisopos
rectales.
• Si hay demora, refrigerar, pero es mejor evitarlo.

Toma de muestras: Sangre
• Cortar el pelo y desinfectar la zona de la punción.
Evitar su contaminación posterior.
• Aguja y jeringa estériles; inyectar a frascos que
contengan medio de cultivo (aerobios y
anaerobios).
• Conservar en estufa o tª ambiente.
• Varias muestras a lo largo de 24 h ya que la
bacteriemia suele ser intermitente.
• Perros y gatos, venas de las patas (safena lateral,
cefálica).

Toma de muestras: Líquidos
corporales
• Afeitar y desinfectar la zona.
• Punción aséptica con aguja y jeringa
estériles.
• Conservar en estufa o a temperatura
ambiente.
• Ej.: LCR, líquido pleural, articular, etc.

Toma de muestras con hisopo
• Hisopo: pequeño trozo de algodón enrrollado
alrededor del extremo de una varilla de madera.
Estériles y empaquetados en un tubo.
• Alginato cálcico: no inhibe el crecimiento
bacteriano, no interfiere en la acción de
antibióticos y no irrita los tejidos.
• Muestras: piel (heridas, pústulas, abcesos);
secreciones (vulva, prepucio); exudados (ojos,
oídos, nasales); hisopos rectales.

Toma de muestras: Pus
• Si no se puede tomar con hisopo, se aspira
con aguja y jeringa estéril.
• Si se sospechan anaerobios, evitar la entrada
de oxígeno en la muestra.

Examen y cultivo de las
muestras: bacteriología
• Tinciones: Gram, Ziehl-Nielsen, Azul de
algodón,..
• Cultivo en diversos medios.

Tinción de Gram
• Fijar la preparación: poner una gota de la
muestra en el centro de un portaobjetos y
extender con el asa de siembra. Dejar secar
al aire y FIJAR haciendo cortes a la llama
del mechero.
• Si lo que teñimos es una colonia que está en
un medio sólido, poner una gota de agua en
el portaobjetos y disolver en ella la colonia.

Tinción de Gram II
• Cubrir la preparación con cristal violeta (1 min).
• Decantar y lavar con agua.
• Cubrir la preparación con lugol (1 min)
• Decantar y lavar con agua.
• Decolorar con alcohol-acetona (30 sg.).
• Decantar y lavar con agua.
• Cubrir con safranina (15 seg).
• Decantar, lavar y dejar secar al aire.

Tinción de Gram III
• Observar al
microscopio con
objetivo de inmersión
tras añadir una gota de
aceite.
• Divide a las bacterias
con pared en Gram
positivas (violeta) y
Gram negativas (rosa).

Ejemplos de Gram

Tinción de Ziehl-Neelsen
• Fijar la preparación.
• Carbolfucsina 20 min. Flamear cada 8 min.
hasta desprender vapor.
• Decolorar con alcohol- Ac. Clorhídrico, 2
min.
• Azul de metileno 1 min.
• Decantar y lavar en cada paso.

Ejemplos de tinción de ZN

Tinción de ZN

Medios de cultivo
• Por su consistencia: Líquidos (nutrientes + sol.
Tampón), sólidos (líquido + agar).
• Por su origen: sintéticos (químicamente
definidos), semisintéticos (sintético + extracto
orgánico), naturales (composición
inconstante).
• Por su composición: comunes (bacterias poco
exigentes), enriquecidos (añadir factores de
crecimiento, para bacterias exigentes).

Medios de cultivo II
• De enriquecimiento: Medio LIQUIDO que
favorece el desarrollo de unas bacterias e inhibe a
otras.
• Selectivo: Medio SOLIDO que favorece el
desarrollo de unas bacterias e inhibe a otras (pH,
tª, Pr. Osmótica, antisépticos, atbs.)
• Diferenciales: las bacterias actúan sobre uno o
varios de sus componentes poniendo de manifiesto
sus características.

Cultivo de muestras
• Placas de Petri (medios sólidos) o tubos
(medios sólidos o líquidos).
• Siembra con asa. A veces con hisopo.
• Asa: mango + filamento (platino o nicrom)
• Asas: de picadura (recta) o de bucle
(calibrada).
• Flamear siempre el asa antes y después de
usarla.

Técnicas de siembra en placa
• Recuento, aislamiento, césped.
• Flamear el asa antes y después de usarla.
• Recuento: contar el nº de bacterias.
• Aislamiento: separarlas para ver cuantos
tipos hay, hacerles pruebas etc.
• Césped: Antibiograma.

Aislamiento

Recuento

Siembra en césped

Siembra en tubo
• Medios líquidos:
inclinar el tubo,
depositar la muestra en
la pared, y mezclar
moviendo suavemente.
• No generar aerosoles.
• Flamear la boca del
tubo y mantener el
tapón en la mano.

Siembra en tubo
• Medios sólidos: rectos
o en pico de flauta
(plano inclinado).
• Flamear la boca del
tubo y mantener el
tapón en la mano.
• No tocar con el mango
del asa el medio.

Análisis de orina
• Examen físico (aspecto, color, olor) y químico
(pH, glucosa, nitritos).
• Sedimento urinario: 10 a 15 mL de orina en un
tubo cónico, centrifugar a 1000 rpm 5-10 min,
eliminar sobrenadante y poner una gota del
sedimento entre porta y cubre. Observar a
microscopio.
• Indicación de lo que podemos obtener en el
cultivo y otros datos (cristales, levaduras, células).

Cultivo de orina
• Sembrar en un medio en el que crezcan
Gram +, Gram – y levaduras (ej. CLED,
Agar sangre); y en un medio selectivo para
Gram – (ej. Agar McConkey).
• La mayoría de las infecciones urinarias las
causan enterobacterias y Pseudomonas.
• Recuento en el medio rico (CLED) y
aislamiento en el selectivo (McConkey).

Resultados de cultivo de orina
• Valorar la presencia de bacterias en función del
número y del tipo.
• Punción suprapúbica: cualquier nº de bacterias
indica infección.
• Sondaje y recogida directa: flora de arrastre.
Infección si hay >100000 ufc/mL; entre 10000 y
100000, repetir y menos de 1000, contaminación.
En la mayoría de los casos 1 solo tipo de bacterias;
en un 10%, 2 tipos.

Casos especiales
• Levaduras y algunos Gram positivos:
infección con menos de 100000 ufc/mL.
• Considerar el estado general del animal:
diabéticos, tratados con inmunosupresores,
etc.

Lectura de resultados
Cultivo de orina

Recuento
• CLED: Fermentadores
de lactosa (amarillos)
no fermentadores de
lactosa (de su color).
• Crecen Gram +, Gram
– y levaduras.
• Asa calibrada: calcular
el nº de ufc/mL

Aislamiento
• Separar las colonias
para ver cuantos tipos
y poder hacer
separadamente las
pruebas.
• Agar McConkey:
Fermentan lactosa
(rojo-rosado); no la
fermentan (de su
color).

Protocolo básico para cultivo
de heces
• Medio de enriquecimiento para Salmonella.
Ej. Caldo de selenito. Incubar a 37ºC, 24 h y
resembrar en medio sólido (Agar SS).
• Medios sólidos: Sembrar por aislamiento.
Detección de patógenos mas frecuentes.
Agar McConkey, Agar Salmonella-Shigella,
Agar Verde Brillante, Agar con sal y
manitol, Agar Sabouraud.

Agar McConkey
• Observar el equilibrio
de la flora.
• Solo crecen Gram
negativos.
• Fermentan la lactosa,
de color rojo. No la
fermentan, de su color.
• Normal: varios tipos.

Agar Salmonella-Shigella (SS)
• Moderadamente selectivo
para Salmonella y
Shigella.
• Fermentan la lac, rojas-
rosadas; no la fermentan,
de su color.
• Producción de SH2,
precipitados negros.
• Sospecha de Salmonella:
transparentes con
precipitados negros.
Colonias en ojo de
muñeca.

Producción de SH2

Agar Verde Brillante (BG)
• Muy selectivo para
Salmonella.
• Fermentan lactosa,
color diverso
(amarillas, verdosas);
no la fermentan, rojo.
• Sospechas de
Salmonella, coloración
rojiza.

Agar con sal y manitol (MSA)
• Alta concentración
salina.
• Selectivo para
Staphylococcus.
• Sospecha de
Staphylococcus
aureus, color amarillo
(fermentación de
manitol).

Agar Sabouraud
• Favorece el desarrollo de levaduras.
• Pueden crecer otros microorganismos.
• Incubar 48 horas a 37ºC.
• Colonias sospechosas de levaduras: blancas
nacaradas con olor a pan. Tipo Candida,
mas frecuentes en intestino.

Heces
• Existe flora normal. Buscamos patógenos.
• Presencia/ausencia. No importa el número
• Disbacteriosis: desequilibrio de la flora
habitual del intestino (ej. Excesivo consumo
de antibióticos).
• Importancia de la orientación diagnóstica
para elegir los medios.

Exudados
• La flora habitual y los patógenos mas frecuentes
varían según la zona del cuerpo que se estudie, y
según la especie animal.
• Normalmente sembramos en un medio rico (Cled,
Agar Sangre) y en un medio selectivo para Gram
neg. (McConkey). Se puede añadir un medio para
hongos y levaduras, un medio para anaerobios etc.
• Sembramos por aislamiento.

Anaerobios
• Examen directo (ej. Gram), cultivo,
identificación y antibiograma. Pero todo en
ausencia de oxígeno, desde la recogida de
muestra hasta la identificación y los
antibiogramas.
• Morfología típica en los Gram.
• Siembra en medios prerreducidos. Añadir atb
que inhiban la flora aerobia (ej aminoglicósidos).

Anaerobios
• Cultivo en jarras para anaerobios. Generar
anaerobiosis por medios químicos
(reactivos que al añadir agua genera
hidrógeno que se combina con el oxígeno).
Vela que consume el oxígeno.
• Identificación por Gram, sensibilidad a
atb, aspecto de las colonias...