Tesis de grado requisito para optar al título de Magister en Biotecnología en la Universidad de Córdoba, Colombia

1. BIODEGRADACIÓN DE NAFTALENO POR Achromobacter sp. EN MEDIO
ACUOSO
Ponente: Ubaldo Bedoya Menco
Director: Luis Oviedo Zumaque M. Sc.
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
MAESTRÍA EN BIOTECNOLOGÍA
MONTERÍA - CÓRDOBA
2013

2. Contenido
Introducción
Marco teórico
Objetivos
Materialesymétodos
Resultadosydiscusión
Conclusiones
Recomendaciones
Bibliografía
Agradecimientos

3. Introducción
La contaminación de suelos, aguas superficiales, subterráneas y el aire con
sustancias tóxicas y peligrosas es uno de los mayores problemas ambientales que
afronta el mundo de hoy. Dentro de estas, la contaminación ambiental por
hidrocarburos ha tomado gran interés en los últimos años debido a los efectos de
sus compuestos potencialmente nocivos para la salud humana (Kanaly and
Harayama,2000).
Muchos de los hidrocarburos que componen el petróleo están clasificados por la
Agencia de Protección Ambiental estadounidense (EPA) como contaminantes
ambientales prioritarios, lo que coloca este problema en un foco de atención
debido a su impacto ambiental negativo.

4. Objetivos
GENERAL
 Evaluar la capacidad de biodegradación del naftaleno por la bacteria
Achromobacter s.p. en medio acuoso.
ESPECÍFICOS
 Determinar la tolerancia a diferentes concentraciones del naftaleno
de la especie Achromobacter s.p.
 Evaluar el efecto del pH, concentración inicial y adición de salicilato
en la biodegradación del naftaleno.
 Determinar el porcentaje de biodegradación de naftaleno a
condiciones específicas seleccionadas.

5. Marco teórico
 Los hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPA´s) son compuestos químicos
formados por 2 o más anillos bencénicos en disposiciones lineales,
angulares o en racimos. Son ampliamente usados en pinturas, pesticidas y
otros productos industriales (Nigam et. al., 1998)
 Entre los mayores contaminantes ambientales los HPA´s son los de mayor
interés debido a su fácil absorción a la materia orgánica y baja
hidrosolubilidad lo que les permite acumularse en el ambiente causando
efectos tóxicos, mutagénicos y carcinogénicos (Grosser et. al., 2000; Bogen
et. al., 2008).

6. Marco teórico
La degradación de HPA´s de dos o tres anillos aromáticos (naftaleno,
fluoreno y fenantreno) mediante cepas puras o consorcios se encuentra bien
documentada en la literatura (Šepič et al., 2003)
Este potencial es el que se pretende explotar para beneficio del medio
ambiente o de sitios contaminados llegando incluso a degradar compuestos
químicos completamente a agua (H2O) y dióxido de carbono(CO2) (Daugulis
y Littlejohns, 2008)

7. Marco teórico
Biodegradación microbiana: proceso mediante el cual los
microorganismos transforman sustancias toxicas en otras menos complejas
como agua y dióxido de carbono.
Biodegradación de contaminantes en el ambiente es un proceso complejo
que dependen de la naturaleza y cantidad del contaminante, de las
condiciones ambientales locales, y de la composición de la población
microbiana nativa (Atlas, 1981; Leahy and Colwell, 1990a; Hinchee and
Olfenbuttel, 1994)
Es necesario profundizar en el conocimiento de los procesos de biodegradación.

8. Marco teórico
El naftaleno (C10H8) es el hidrocarburo policíclico de menor tamaño y mayor
solubilidad, de bajo peso molecular (128.17 g/mol) está formado por dos
anillos bencénicos. Es moderadamente volátil, su punto de ebullición es de
218°C y una solubilidad en agua de 31,7 mg/L a 25° C(Preuss et al., 2003).
 Se ha usado ampliamente como modelo para entender las rutas
metabólicas de degradación de los HPA´s más complejos

9. Marco teórico
Diversas estrategias se han implementado para mejorar la
biodegradación de HPA´s, entre ellas, el uso de nutrientes
como el fosforo y el nitrógeno, el uso de solventes orgánicos
como el etanol y la acetona que reducen el tiempo necesario
para degradar ciertos componentes (Lee et al., 2001), la
adición de biosurfactantes que mejoran la biodisponibilidad
de los contaminantes (Mulligan, 2005), la adición de
metabolitos intermediarios como el salicilato que actúa como
inductor de las enzimas de las vías de oxidación del naftaleno
(Barnsley, 1975)

10. Materiales y
métodos

11. MICROORGANISMO
A c h r o m o b a c t e r d e n i t r i f i c a n s - Bacilo gram
negativo . API 20NE :98% - Mezquida (2010)
Inoculo: 0,5 mL de suspensión con Abs 600 nm 1,0 = 6,3 x108 cel
TOLERANCIA
50 –100 –200–300–400–600–800 p.p.m. x 7 días
CINETICA
Naftaleno 50 p.p.m. - 150 r.p.m. Cada 24 h – Abs 600 nm
x duplicado
CURVA PATRÓN
Diluciones a partir de sln .madre de células – Abs 600 nm 1,0
Abs. vs Biomasa
PREANALITICA

12. BIODEGRADACIÓN
Microcosmos. pH, [naftaleno] y salicilato
0,5 mL de inóculo 6,2 –Twin 80% -Tº amb. – sin
luz, agitación 150 r.p.m. 120 h. Ctrl. Abiótico.
Determinación de biomasa por Abs. a 600 nm
ANÁLISIS QUIMICO
Naftaleno residual por GC – FID – Lab. de análisis
instrumental . U. Nacional, Medellín
ANALITICA

13. Materiales y métodos
Diseño experimental: DCA con tres factores:
3 x 2 x 2 = 12 tratamientos x triplicado = 36 u/e
Tratamiento pH Concentración de
naftaleno(ppm)
Salicilato
1 6.0 [100] Sin adición
2 7.0 [100] Sin adición
3 8.0 [100] Sin adición
4 6.0 [350] Sin adición
5 7.0 [350] Sin adición
6 8.0 [350] Sin adición
7 6.0 [100] Con adición
8 7.0 [100] Con adición
9 8.0 [100] Con adición
10 6.0 [350] Con adición
11 7.0 [350] Con adición
12 8.0 [350] Con adición

14. Materiales y métodos
Análisis estadístico
Software Design Expert
Versión 6.0.1 (Stat-Ease, Inc. Minneapolis, USA)
Análisis deVarianza - ANOVA
Hipótesis nula: no hay diferencias significativas entre los diferentes
tratamientos de biodegradación de naftaleno.
Hipótesis alternativa: al menos uno de los tratamientos es
significativamente diferente a los demás.

15. Resultados
Tolerancia Cinética de crecimiento
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0 24 48 72 96 120 144 168
absorbancia600
tiempo (horas)
Naftaleno en
p.p.m.
Crecimiento
50 +
100 +
200 +
300 +
400 +
600 -
800 -

16. Resultados
y = 1,8333x + 8,3125
R² = 0,9257
8
8,5
9
9,5
10
10,5
11
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
A b s o r b a n c i a 600 nm
Biomasag/L
Curva patrón
Mediciones por duplicado en espectrofotómetro Genesys 20 Thermo Scientific ®

17. Resultados
Source Sum of squares DF Mean Square F -Value Prob > F Significance
Model 0,631 11 0,057 26,585 < 0.0001 Si
A 0,526 2 0,263 121,722 < 0.0001 Si
B 0,010 1 0,010 4,572 0.0429 No
C 0,004 1 0,004 1,653 0.2108 No
AB 0,040 2 0,020 9,183 0.0011 Si
AC 0,006 2 0,003 1,305 0.2896 No
BC 0,006 1 0,006 2,693 0.1138 No
ABC 0,041 2 0,021 9,549 0.0009 Si
Pure Error 0,052 24 0,002
Cor Total 0,683 35
Análisis de varianza
A= pH; B= concentración de naftaleno; C= Adición de salicilato
Y = 8,44 – 0,038 x A – 0,13 x A2 + 0,26 x A x B + 0,021 x A2 x B + 3,521 x 10-3 – 0,013 A2
x C + 0,034 A x B x C + 0,012 x A2 donde Y = biomasa en mg/L

18. Resultados
Tratamiento
Condiciones
experimentales Biomasa*
T1
b 6.0 - 100 -Sin salic. 8,42
T2
b 7.0 - 100 - Sin salic 8,43
T3
b 8.0 - 100 - Sin salic 8,64
T4
b 6.0 - 350 - Sin salic. 8,4
T5
b 7.0 - 350 - Sin salic. 8,32
T6
b 8.0 - 350 - Sin salic. 8,63
T7
b 6.0 - 100 - Con salic. 8,36
T8
b 7.0 - 100 - Con salic. 8,34
T9
a 8.0 - 100 - Con salic. 8,7
T10
b 6.0 - 350 - Con salic. 8,43
T11
b 7.0 - 350 - Con salic 8,32
T12
b 8.0 - 350 - Con salic. 8,54
*Valores promedio por triplicado

19. Resultados
Efecto del pH: El pH influyó en la biodegradación de naftaleno de
manera altamente significativa (P< 0.01), mostrando diferencias con
las otras variables

20. Resultados y discusión
Se observó, que el pH al que se obtuvo la mayor cantidad de
biomasa está dentro de los valores reportados en estudios
anteriores de degradación de naftaleno donde se evaluaron rangos
de pH entre 5.5 y 9.5 encontrando degradaciones con valores
óptimos que van de 6.0 a 8.0 (Chen et al., 2006; Lin et al., 2010)
En un estudio con la bacteria Pseudomonas H0B1 se encontró
que la biodegradación de naftaleno fue efectiva a pH’s entre 7.5 y
8.5 a temperaturas de 35 a 37ºC (Pathak et al., 2009)
La mayoría d estudios sugieren el pH de 7,0 como optimo para la
biodegradación de naftaleno, en nuestro caso un pH alcalino
favoreció el crecimiento.

21. Resultados
Efecto de la concentración del naftaleno en la producción de biomasa. a: pH 6.0 sin
salicilato, b: pH 6.0 con salicilato; c: pH 7.0 sin salicilato, d: pH 7.0 con salicilato; e: pH
8.0 sin salicilato, f: pH 8.0 con salicilato.

22. Resultados y discusión
Aunque el microorganismo degradó naftaleno en todas las
unidades experimentales, no se observaron diferencias
significativas en la biodegradación a 100 o 350 p.p.m. y solo se
vio afectada a una concentración de 350 p.p.m. en presencia de
salicilato, lo que podría explicarse debido a un efecto tóxico
combinado entre la concentración de naftaleno y la adición de
salicilato (Lin et al., 2010)

23. Resultados y discusión
InteracciónABC
La interacción entre estos tres factores afectó significativamente la
producción de biomasa y por lo tanto la biodegradación de
naftaleno (P < 0,01) .

24. Resultados y discusión
Efecto de la adición de salicilato en la biodegradación de naftaleno.
a: 100 p.p. m. a pH 6.0; b: 350 p.p.m. a pH 6.0; c:100 p.p.m. a pH 7.0; d: 350 p.p.m.
a pH 7.0; e: 100 p.p.m. a pH 8.0; f: 350 p.p.m. a pH 8.0.

25. Resultados y discusión
 Achromobacter s.p. no fue inducido por el salicilato debido a
que el microorganismo en presencia de dos fuentes de
carbono experimentó un crecimiento diáuxico (Monod, 1958;
Nigam et al., 1998)
 Achromobacter s.p. no fue inducido por salicilato y este fue
hidrolizado a gentisato como lo sugieren estudios previos
(Grund et al., 1992)
 Uz y col., Encontraron que Rhodococus opacus cepa M213
creció en naftaleno como única fuente de carbono en la cual el
salicilato no parece ser un metabolito intermediario, lo que
sugiere una vía de degradación diferente (Uz et al. 2000)

26. Resultados
Determinación del porcentaje de biodegradación de naftaleno en el
tratamientoT9
Naftaleno residual por análisis cromatográfico: Cromatógrafo Agilent
123-5536 , columna capilar 50 um, gas Helio, 1.6 mL/min, 40 min.

27. Resultados y discusión
El naftaleno fue mineralizado hasta un 86,6 % dentro de las
primeras 120 horas de incubación, lo que sugiere que existe
actividad degradativa por Achromobacter s.p.
Estudios anteriores encontraron una degradación del 90 % a las 140
horas de incubación (San Miguel et al., 2009) y otros investigadores
usando Bacillus fusiformis lograron una tasa de biodegradación del
100% en 108 horas de incubación (Lin et al., 2010)
Mycobacterium sp. cepa BB1 degradó fenantreno en un 76 % a las
130 horas de incubación (500 p.p.m.), Este valor es inferior al
porcentaje encontrado en este estudio a pesar de que este
compuesto es mucho mas soluble (1,22 mg/L) (Boldrin et al., 1993)

28. Conclusiones
 Bajo condiciones controladas es posible biodegradar naftaleno
en medio acuoso con altas tasas de degradación.
 La bacteria nativa Achromobacter s.p. tiene potencial
biodegradador de naftaleno en medio acuoso dada su tolerancia
a este tóxico.
 El pH es un parámetro importante en la biodegradación de
naftaleno por Achromobacter s.p. en medio acuoso.

29. Recomendaciones
Se recomienda hacer pruebas a escala piloto con Achromobacter
s.p. en estudios de biodegradación de HPA’s para conocer la
eficacia de esta alternativa en condiciones de campo.

30. Bibliografía
 Chen, H.-J., Guo, G.-L., Tseng, D.-H., Cheng, C.-L., and Huang, S.-L. (2006) Growth
factors, kinetics and biodegradation mechanism associated with Pseudomonas
nitroreducens TX1 grown on octylphenol polyethoxylates. Journal of Environmental
Management 80: 279-286.
 Lin, C., Gan, L., and Chen, Z.-L. (2010) Biodegradation of naphthalene by strain Bacillus
fusiformis (BFN). Journal of Hazardous Materials 182: 771-777.
 San Miguel, V., Peinado, C., Catalina, F., and Abrusci, C. (2009) Bioremediation of
naphthalene in water by< i> Sphingomonas paucimobilis</i> using new biodegradable
surfactants based on poly (É›-caprolactone). International biodeterioration &
biodegradation 63: 217-223.
 Feijoo-Siota, L., Rosa-Dos-Santos, F., de Miguel, T., and Villa, T. (2008) Biodegradation of
Naphthalene by Pseudomonas stutzeri in Marine Environments: Testing Cells
Entrapment in Calcium Alginate for Use in Water Detoxification. Bioremediation Journal
12: 185-192.
 Boldrin, B., Tiehm, A., and Fritzsche, C. (1993) Degradation of phenanthrene, fluorene,
fluoranthene, and pyrene by a Mycobacterium sp. Applied and environmental
microbiology 59: 1927-1930.

31. Bibliografía
 Pathak, H., Kantharia, D., Malpani, A., and Madamwar, D. (2009) Naphthalene
degradation by Pseudomonas sp. HOB1: In vitro studies and assessment of
naphthalene degradation efficiency in simulated microcosms. Journal of Hazardous
Materials 166: 1466-1473.
 Nigam, P., Banat, I.M., Marchant, R., and Singh, D. (1998) Degradation of
naphthalene by bacterial cultures. Environment International 24: 671-677.
 Šepič, E., Bricelj, M., and Leskovšek, H. (2003) Biodegradation studies of
polyaromatic hydrocarbons in aqueous media. Journal of applied microbiology 83:
561-568.
 Grosser, R.J., Friedrich, M., Ward, D.M., and Inskeep, W.P. (2000) Effect of Model
Sorptive Phases on Phenanthrene Biodegradation: Different Enrichment Conditions
Influence Bioavailability and Selection of Phenanthrene-Degrading Isolates. Appl
Environ Microbiol 66: 2695-2702.
 Uz, I., Duan, Y., and Ogram, A. (2000) Characterization of the naphthalene degrading
bacterium, Rhodococcus opacus M213. FEMS Microbiology Letters 185: 231-238.

32. Agradecimientos
 Grupo Grubiodeq.
 Laboratorio de análisis instrumental de la Universidad Nacional
de Colombia – Sede Medellín
 Comité de la Maestría en Biotecnología
 Robert Day – “Como escribir y publicar trabajos científicos” .OPS
 Cada uno de los que colaboraron de alguna forma con este
trabajo.