Tesis para optar el título de Biólogo acuicultor. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional del Santa

1. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL
BIOLOGIA EN ACUICULTURA
RENDIMIENTO DE BIOMASA Y CONTENIDO DE
LÍPIDOS DE Tetraselmis suecica UTILIZANDO
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE EFLUENTES DE
BODEGAS DE EMBARCACIONES ANCHOVETERAS
INDUSTRIALES EN CONDICIONES DE LABORATORIO
BACH. JOSÉ ARTURO GONZÁLEZ FERRER
BACH. LINCOL ROLLER POLO BORDONABE

2. Microalgas
INTRODUCCIÓN
Tratamiento de las
aguas residuales
(Romero et al., 2009)
Alimentación humana y
animal investigaciones
genéticas, morfológicas,
fisiológicas, nutricionales
y bioquímicas (Blanco,
1991; Alveal et al., 1995;
Bertoldo et al., 2006).
Contienen proteínas,
vitaminas y ácidos grasos
poliinsaturados (Quevedo et
al., 2008).
Puede utilizar diferentes fuentes
nitrogenadas inorgánicas (urea, fosfato
diamónico, nitratos, nitritos, etc.)
En cultivos heterotróficos utilizando
residuos orgánicos, puede metabolizar
diversos aminoácidos y vitaminas
produciendo cambios importantes en
su crecimiento y composición
bioquímica (Merino et al., 2003).
Indicadores biológicos
de contaminación
respecto a la calidad de
las aguas (Gómez &
Ramírez, 2004).
Tetraselmis suecica
microalga marina unicelular
4 flagelos isodinámicos
10 um de diámetro (Ulloa,
2011).

3. Industria Pesquera
0,05 a 2 TM de sanguaza por
TM de pescado crudo
(Cabrera, 2002; TASA, 2013).
Desechos sólidos y líquidos
ambiente marino
Chimbote
Líquidos orgánicos (sangre,
escamas, vísceras y agua marina de
faena, que al verterse en el mar
ocasionarán problemas de
contaminación.

4. Chlorella sp. con residuos
industriales líquidos orgánicos
pesqueros DBO 85 %
Romero (2011)
Méndez et al. (2010)
Biorremediación utilizando la
clorofita Scenedesmus quadricauda
en efluentes cloacales diluidos al 25,
50 y 75 %
94, 40, 94 y 94 % amoníaco (63,7 mg
L-1), nitrato (2,5 mg L-1), fosfato
(16,725 mg L-1), fósforo total (5,464
mg L-1)
sulfuros disminuyeron un 99%
respecto al valor inicial (1,645 mg L-1)
Zhang (2012)
Demostró la efectividad de
Chlorella para eliminar
completamente el amonio y
fostatos presentes en los
efluentes domésticos
secundarios.
Silva et al. (2011)
concentraciones de sanguaza
entre el 2 y 9 % como medio de
cultivo para T. suecica,
encontrando que un 3,5 % y
4,56 % presentan los
crecimientos máximos.

5. Lípidos en microalgas
(Alsull & Wan, 2012)
Composición
Nitrógeno
Contenido lipídico
Adición o restricción
1 - 90 % peso seco
ESTRÉS
alteraciones en la composición de los
lípidos y ácidos grasos.
síntesis y acumulación de triglicéridos,
Biomasa microalgal
Biocombustible
Lípidos
(Donohue & Codgell, 2006; Meng et
al., 2009; Rodolfi et al., 2009).

6. Crece exitosamente en diferentes
medios de cultivo y metabolizar
diversas fuentes nitrogenadas
orgánicas e inorgánicas (Fernández &
Paredes, 2006; Ipanaqué & Paredes,
2010).
T. suecica
Biomasa
microalgal
y lípidos
Ensayos realizados con residuos
pesqueros (Fernández & Paredes,
2007)
Efluentes bodegas de embarcaciones
Biotransformación
Contaminación marina

7. ¿Cuál es el rendimiento de biomasa y contenido de lípidos
de Tetraselmis suecica utilizando diferentes concentraciones
de efluentes de bodegas de embarcaciones anchoveteras
industriales en condiciones de laboratorio?

8. Objetivos
Objetivo general
Evaluar el rendimiento de biomasa y contenido de lípidos de
Tetraselmis suecica utilizando diferentes concentraciones de
efluentes de bodegas de embarcaciones anchoveteras industriales en
condiciones de laboratorio.
Objetivos específicos
- Determinar el rendimiento de biomasa y velocidad de crecimiento de T. suecica
utilizando diferentes concentraciones de efluentes de bodegas de embarcaciones
anchoveteras industriales (EEA) en condiciones de laboratorio;
- Determinar el contenido de lípidos de T. suecica utilizando diferentes
concentraciones de EEA en condiciones de laboratorio.

9. Hipótesis de investigación
Si utilizamos concentraciones de 1, 2 y 5 % de efluentes de bodegas
de embarcaciones anchoveteras industriales (EEA) se obtendrá
mayor rendimiento de biomasa y contenido de lípidos de Tetraselmis
suecica con la concentración de 2 % de EEA.
- Variable independiente (Vi)
Concentraciones de EEA (1, 2 y 5 % ).
- Variables dependientes (Vd)
Producción de biomasa.
Concentración de lípidos totales.
- Variable condicional (Vc)
Condiciones de Laboratorio (luz, temperatura, aireación).

10. Materiales y métodos
Material biológico
Laboratorio
Cultivos
20 mL
suspensión
Luz 40 w
Guillard f/2
Agitación constante
T. suecica
Tratamiento del agua de cultivo
agua de mar
“El Dorado”
Transporte
2 recipientes 100 L c/u
Sedimentado
48 h
Hipoclorito de sodio
(5,25 %) 1 ml x L de
agua de mar x 24 h
Filtrado
10 µm - malla de Nytal
Neutralizado
abundante aireación (5 L min-1) x 1 h
Tiosulfato de sodio (15 % )
1 mL x L de agua de mar

11. Preparación de los inóculos de T. suecica
1
100 mL cultivo
Inóculos
microalgales
iluminación constante
x 5 días (2000 lux)
agua de mar esterilizada
250 mL
2
iluminación (2000 lux)
aireación constante
(50 mL min-1)
Volumen efectivo 600 mL
Inóculos
agitación manual
2 veces x día.

12. Preparación de los medios de cultivo
Medio Guillard f/2
COMPUESTO
Nutrientes Mayores
NaNO3
NaH2PO4H2O
CONCENTRACIÓN
(mg L-1)
75,0
5,0
Micronutrientes
Na2EDTA
FeCl3.6H2O
CuSO4.5H2O
ZnSO4.7H2O
CoCl2.6H2O
MnCl2.4H2O
Na2MnO4.2H2O
4,36
3,15
0,01
0,022
0,01
0,18
0,006
Vitaminas
Tiamina
Biotina
Cianocobalamina
0,1
0,5
0,5

13. Flujo de la preparación de los efluentes para el cultivo de T. suecica.
Obtención de
EEA
Homogenizar
(licuadora) y
filtrar a 20 um
malla de nytal
Autoclave 121 C
x 15', licuar y
filtrar -papel
Whatman 41
Realizar las
diluciones
Neutralizar a pH
7, con NaOH o
HCl
Almacenar a 5 C
en las botellas
hasta el inicio del
experimento

14. Acondicionamiento de las Unidades Experimentales

15. Tratamientos utilizados en los cultivos de T. suecica.
Tratamientos
Especificaciones
T0
Cultivo de T. suecica con medio de cultivo Giullard f/2
(Control).
T1
Cultivo de T. suecica con efluentes de bodegas de
embarcaciones anchoveteras industriales con una
concentración de 1 % de EEA.
T2
Cultivo de T. suecica con efluentes de bodegas de
embarcaciones anchoveteras industriales con una
concentración de 2 % de EEA.
T3
Cultivo de T. suecica con efluentes de bodegas de
embarcaciones anchoveteras industriales con una
concentración de 5 % de EEA.

16. Valores de las concentraciones de los principales
parámetros de los efluentes de las embarcaciones
anchoveteras industriales (EEA).
PARÁMETROS
CONCENTRACIÓN
Humedad (%)
91,26
Proteínas (%)
3,71
Lípidos (%)
0,14
Cenizas (%)
3,38
Sólidos Totales (g L-1)
87,44
Nitratos (mg L-1)
1,52
Nitritos (mg L-1)
0,02
Fosfatos (mg L-1)
1,17
Amonio (mg L-1)
8,23
Analizado en el Laboratorio de Biología y Ecología de la Universidad Nacional del Santa.

17. Determinación del crecimiento poblacional de T. suecica
microscopio
binocular
Olympus
conteos diarios
suspensión
microalgal
alícuotas
Cámara Neubauer
velocidad de crecimiento
poblacional por día (µ)
tiempo de duplicación
diaria (TD) al quinto día de
cultivo
N0 y Nf corresponden al número de
células por mL al inicio y al quinto
día (T0 y Tf ), respectivamente.

18. Determinación de la biomasa de T. suecica
Pesado papel filtro
Whatman N° 42
Embudo Büchner
matraz Kitasato
Bomba de vacío
50 mL de suspensión microalgal
x c/ unidad experimental
Biomasa (mg L-1)
Filtrado
((P2 – P1) / 50) x 1000
Secado
estufa a 60° C por 8 h
105° C por 10 min
Enfriado
secador de campana por 1 h
Pesado
P1: Peso inicial (papel) mg
P2: Peso final (papel + muestra) mg.

19. Flujograma para determinar los lípidos totales de T. suecica en todos los
tratamientos. Metodología de Blight & Dyer (1959) y Marsh & Weinsteinn (1966).
Muestra centrifugada (10 mL)
Agregar 3 mL de metanol:cloroformo (2:1)
Dejar reposar por 24 horas a 5 ºC
Centrifugar 10000 rpm por 10 min.
Agregar 3 mL de agua y extraer la
capa superior
Evaporación de gases y secado con
calor
Agregar 2 mL de H2SO4
concentrado
Calentar a 200 ºC x 60´
Enfriar a temperatura ambiente
Lectura espectrofotométrica a 375 nm
(longitud de onda)

20. 1,0
A
B
0,9
Lineal (A)
Absorbancia
0,8
Lineal (B)
0,6
y = 1,7635x
R² = 0,9982
0,5
y = 1,6876x
R² = 0,9934
0,4
Donde:
V: Volumen final de muestra analizada
(ml).
M: Peso equivalente al peso seco (mg)
en 10 mL de cultivo.
(Blight & Dyer, 1959;
Marsh & Weinsteinn,
1966)
0,3
0,1
0,0
0,0
0,1
0,2
0,3
Lípidos (mg mL-1)
0,4
0,5
Curvas de calibración para la determinación de lípidos
en T. suecica.

21. Contenido de lípidos (LT) en biomasa
Donde:
L: Porcentaje de lípidos (%).
B: Biomasa seca total por litro (mg).
Análisis estadístico de los datos
Análisis de varianza (ANOVA)
Prueba de Tukey HSD
Nivel de significancia de 0,05
Diferencias ÷ promedios
para establecer el mejor promedio
Microsoft Office Excel 2010 y SPSS 20.0
para Microsoft Windows 7

22. Resultados
Parámetros del cultivo de T. suecica
22,1 - 24,3 C
Δ 2,2 ºC
Variación de la temperatura promedio (°C) en los cultivos de T. suecica
de los tratamientos con medio EEA y Guillard f/2 (control).

23. Variación del pH promedio en los cultivos de T. suecica de
los tratamientos con medio EEA y Guillard f/2 (control).
Δ 7,81 al inicio del experimento, y 9,26 en el cuarto
y quinto día de cultivo.

24. Crecimiento poblacional de T. suecica
Densidad poblacional promedio (x106 cél. mL-1) de T. suecica
cultivados con medio EEA y Guillard f/2 (control).
EEA (%)
DÍA DE
CULTIVO
CONTROL
1
2
5
0
0,18 ±0,00a
0,18 ±0,00a
0,18 ±0,00a
0,18 ±0,00a
1
0,26 ±0,01a
0,21 ±0,01b
0,20 ±0,01b
0,20 ±0,01b
2
0,42 ±0,02a
0,34 ±0,03b
0,31 ±0,02b
0,32 ±0,02b
3
0,94 ±0,04a
0,82 ±0,02b
0,77 ±0,02b
0,80 ±0,02b
4
1,75 ±0,10ab
1,64 ±0,09b
1,88 ±0,10a
1,93 ±0,05a
5
2,33 ±0,13b
2,13 ±0,11b
2,65 ±0,08a
2,78 ±0,09a
6
2,70 ±0,07b
2,16 ±0,09c
2,91 ±0,09ab
3,05 ±0,09a
7
2,72 ±0,12b
2,04 ±0,09c
3,24 ±0,16a
3,44 ±0,15a
8
2,59 ±0,12c
1,90 ±0,13d
3,22 ±0,15b
3,61 ±0,08a
9
2,40 ±0,09b
1,75 ±0,09c
3,15 ±0,10a
3,34 ±0,11a
10
2,36 ±0,10b
1,40 ±0,11c
3,18 ±0,16a
3,42 ±0,10a
11
1,89 ±0,12c
1,13 ±0,07d
3,07 ±0,14b
3,38 ±0,12a
Letras diferentes en una misma fila indica diferencia significativa (α=0,05).

25. Variación de la densidad poblacional (x106 cél. mL-1) en
los cultivos de T. suecica de los tratamientos con medio
EEA y Guillard f/2 (control).

26. Promedios de la Tasa de crecimiento (µ) y Tiempo de duplicación
diaria (TD) poblacional de T. suecica en los tratamientos cultivados
con medio de cultivo EEA y Guillard f/2 (control).
EEA (%)
PARÁMETRO
CONTROL
1
2
5
µ (día-1)
0,51 ±0,01b
0,49 ±0,01b
0,54 ±0,01a
0,55 ±0,01a
TD (día)
1,35 ±0,03b
1,40 ±0,03b
1,29 ±0,01a
1,27 ±0,02a
Letras diferentes en una misma fila indica diferencia significativa (α=0,05).

27. Inicio del
experimento
Al quinto día de
cultivo

28. Contenido de lípidos en T. suecica
a
b
b
c
Contenido de lípidos en porcentaje de T. suecica en los tratamientos con medio de
cultivo EEA y Guillard f/2 (control). Letras diferentes indican diferencia significativa
(α=0,05).

29. Rendimiento de biomasa total y lípidos en T. suecica
Promedios del rendimiento en biomasa total y de lípidos de T. suecica,
en los tratamientos cultivados con 2 y 3 % de EEA.
EEA (%)
PARÁMETROS
1
2
5
Biomasa Total (BT)
(mg L-1)
434,66 ±22,85b 569,49 ±22,63a 607,13 ±18,18a
Biomasa Lípidos (BL)
(mg L-1)
116,09 ±4,12b
133,09 ±2,17a
140,63 ±2,61a
Letras diferentes en una misma fila indica diferencia significativa (α=0,05).

30. Rendimiento de biomasa total y lípidos de T. suecica en los tratamientos
dosificados con EEA.
BIOMASA TOTAL
BIOMASA LÍPIDOS
700
a
a
600
500
607,13
569,49
b
434,66
mg L-1
400
300
200
b
116,09
a
133,09
a
140,63
100
0
10 (1 %)
20 (2 %)
EEA (mL L-1)
50 (5 %)
Letras diferentes entre tratamientos indica diferencia significativa (α=0,05).

31. Promedios del rendimiento en biomasa total y de lípidos de T. suecica, en relación a
la dosificación de EEA, en los tratamientos cultivados con 2 y 5 % de EEA.
EEA (%)
PARÁMETROS
2
5
Rendimiento BT
(g / L de EEA)
28,47
1,13a
12,14
0,36b
Rendimiento BL
(g / L de EEA)
6,65
0,11a
2,81
0,05b
Letras diferentes en una misma fila indica diferencia significativa (α=0,05).

32. R BIOMASA TOTAL
R BIOMASA LÍPIDOS
40
Rendimiento (g / L de EEA)
30
20
R² = 0,9954
10
R² = 0,9989
0
0
10
20
(2 %)
30
EEA (mL
40
L-1)
50
60
(5 %)
Rendimiento de biomasa total y de lípidos en relación a la dosificación de
EEA para T. suecica en los tratamientos con medio de cultivo EEA.

33. DISCUSIÓN
(Laing & Helm, 1981; Richmond & Becker,
1986; Millán-Núñez et al., 2010)
cultivos microalgales
características
ambientales
composición
química
pH
nutrientes
luminosidad
Abalde et al. (1995)
Laing & Helm (1981)
Rango T°
microalgas
cultivadas
36 °C
especie
Rango T°
18 y 22 °C
T. suecica
productividad no
es afectada
Hasta 25 °C
Δ T° 22,1 - 24,3 °C,
significativamente iguales en cada día de
cultivo, por lo que no serían condicionantes
para la obtención de los resultados.

34. (Richmond & Becker, 1986)
pH
7-8
Millán-Núñez et al. (2010)
cultivan T. suecica
7,3 y 8,5
cultivan T. suecica
7,13 y 8,69
Rango óptimo
pH entre 7,81 y 9,26, no
determinante en los resultados.
Alsull & Wan (2012)
crecimiento
poblacional
Densidades
microalgales
Loera-Quezada & Olguín (2010)
asimilación
nutrientes,
Nitrógeno
Tiempo de duplicación diaria (TD)
1,50 día
Silva et al. (2011)
Sheehan et al. (1998)
T. suecica
crecimiento
limitación de
nutrientes
acumulación
de lípidos
el doble (Thompson 1996)
Inhibición x
saturación N
Fábregas et al. (1996)

35. CONCLUSIONES
Las mayores densidades poblacionales de T. suecica al quinto día de cultivo
se obtuvieron en los tratamientos dosificados con 2 y 5 % EEA, con 2,65 y
2,78 x106 cél. mL-1, respectivamente; mientras que el menor se encontró con
el dosificado con 1 % de EEA con 2,13 x106 cél. mL-1.
Los mayores valores de µ para T. suecica al quinto de cultivo se
presentaron en los tratamientos dosificados con 2 y 5 % de EEA, con 0,54 y
0,55 día-1, respectivamente; y el menor valor se presentó en el tratamiento
dosificado con 1 % de EEA, con 0,49 día-1.
El mayor valor de TD para T. suecica en el quinto día de cultivo, se obtuvo
en el tratamiento con 1 % de EEA, con 1,40 día; mientras que los menores
valores se presentaron en los tratamientos con 2 y 5 % de EEA, con 1,29 y
1,27 día, respectivamente.

36. El mayor contenido en porcentaje de lípidos para T. suecica al quinto día de
cultivo, se obtuvo en el tratamiento dosificado con 1 % de EEA con 26,73 %;
y con dosificaciones de 2 y 5 % de EEA se obtuvieron menores porcentajes
con el 23,39 y 23,18 %, respectivamente.
Los mayores rendimientos en biomasa de lípidos para T. suecica al quinto
día de cultivo, se obtuvieron en los tratamientos dosificados con 2 y 5 % de
EEA, con 133,1 y 140,6 mg L-1, respectivamente; y con el 1 % de EEA se
obtuvo una menor biomasa de lípidos con 116,1 mg L-1.
Al comparar el rendimiento de biomasa total (BT) y lípidos (BL) de los
tratamientos con 2 y 5 % de EEA, se obtuvo que el dosificado con 2 % de EEA
presentó un mayor rendimiento para BT y BL con 28,47 y 6,65 g / L de EEA,
respectivamente; mientras que con 5 % de EEA, se obtuvieron 12,14 y 2,81 g /
L de EEA, para BT y BL, respectivamente.

37. RECOMENDACIONES
Evaluar el contenido de carbohidratos y proteínas de los cultivos de T.
suecica con diferentes concentraciones de EEA.
Evaluar el efecto del número de dosificaciones en el crecimiento y
contenido de lípidos, carbohidratos y proteínas de T. suecica cultivado
con diferentes concentraciones de EEA.
Determinar el efecto de diferentes concentraciones de EEA en el
crecimiento poblacional y contenido de lípidos en cultivos masivos
de T. suecica cultivados en tanques de 100 L.
Evaluar con diferentes concentraciones de EEA, los costos de
producción de biomasa y lípidos a escala piloto de T. suecica.

44. Valores de la Tasa de crecimiento (µ) y Tiempo de duplicación diaria (TD)
poblacional de T. suecica en las unidades experimentales de los tratamientos
cultivados con medio de cultivo EEA y Guillard f/2 (control).
EEA (%)
CONTROL
PARÁMETRO
1
2
5
R1
R2
R3
R1
R2
R3
R1
R2
R3
R1
R2
R3
N0 (x106 cél.
mL-1)
0,18
0,18
0,18
0,18
0,18
0,18
0,18
0,18
0,18
0,18
0,18
0,18
Nf (x106 cél.
mL-1)
2,46
2,33
2,21
2,03
2,11
2,24
2,56
2,66
2,72
2,68
2,79
2,86
Día
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
µ (día-1)
0,52
0,51
0,50
0,48
0,49
0,50
0,53
0,54
0,54
0,54
0,55
0,55
TD (día)
1,33
1,35
1,38
1,43
1,41
1,37
1,31
1,29
1,28
1,28
1,26
1,25

45. Valores de la Biomasa, Absorbancia, Porcentaje de lípidos y Biomasa de
lípidos de T. suecica en las unidades experimentales de los tratamientos
cultivados con medio de cultivo EEA y Guillard f/2 (control).
EEA (%)
PARÁMETROS
CONTROL
1
2
5
Biomasa (mg L-1)
507,5 480,2 460,6
412,7 433,0 458,3
545,5 572,4 590,5
587,7 609,9 623,8
Absorbancia (λ)
0,355 0,360 0,338
0,391 0,394 0,417
0,452 0,459 0,467
0,494 0,476 0,486
Lípidos (%)
20,27 21,72 21,26
27,45 26,37 26,36
24,01 23,23 22,91
24,35 22,61 22,58
Lípidos (mg L-1)
102,9 104,3
113,3
131,0
143,1
97,9
114,2
120,8
133,0
135,3
137,9 140,8