1. 19 OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
ESPAÑA
11 Número de publicación: 2 243 005
51 Int. Cl.7
: A61K 35/78
A61P 15/12
A61P 35/00
A61P 25/32
12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3
86 Número de solicitud europea: 98942659 .8
86 Fecha de presentación : 30.07.1998
87 Número de publicación de la solicitud: 1001797
87 Fecha de publicación de la solicitud: 24.05.2000
54 Título: Extracto de soja, proceso para su preparación y composición farmacéutica.
30 Prioridad: 30.07.1997 DE 197 32 866
30.07.1997 DE 197 32 855
30.07.1997 DE 197 32 822
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
16.11.2005
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
16.11.2005
73 Titular/es: INDENA S.p.A.
Viale Ortles, 12
20139 Milano, IT
72 Inventor/es: Bombardelli, Ezio y
Gabetta, Bruno
74 Agente: Isern Jara, Jorge
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
ES2243005T3
Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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DESCRIPCIÓN
Extracto de soja, proceso para su preparación y composición farmacéutica.
La invención se refiere a nuevos extractos obtenidos por extracción de judías de soja completas maduras o a partir
de harina de soja libre de aceite (Glycine max (L.) MERRIL, familia Leguminosae), su producción y formulaciones
que contienen estos extractos. Los nuevos extractos se caracterizan por su contenido de isoflavonas y saponinas en
proporciones definidas.
Se sabe que la soja contiene saponinas e isoflavonas además de sacáridos y aminoácidos, así como proteínas y
sales minerales en cantidades las cuales dependen de su origen geográfico y de las condiciones bajo que se cultivó y
se cosechó la planta.
Los contenidos en saponinas han sido divididas en tres clases dependiendo de la estructura química de sus compo-
nentes triterpénicos: saponinas de soja de los grupos A, B y E (Okubo K. et al., ACS Symp., Ser. 546, 330, 1994).
R1 R2 R3
Grupo A Cadena de sacárido Cadena de sacárido OH
Grupo B Cadena de sacárido OH H
Grupo E Cadena de sacárido -O H
Los componentes de isoflavona consisten en glicósidos de isoflavona (daidzina, genistina y glicitina) que pueden
contener radicales acilo, por ejemplo radicales malonilo, unidos a la cadena de sacárido.
R1 R2 R3
Daidzina H H D-Glucosa
Glicitina OCH3 H D-Glucosa
Genistina H OH D-Glucosa
Daizdeina H H H
Gliciteína OCH3 H H
Genisteína H OH H
De acuerdo con la literatura biomédica y la información epidemiológica publicadas en los últimos años, princi-
palmente en relación a poblaciones del Este, las cuales consumen alimentos basados en la soja en mayor proporción,
el uso de estos alimentos en una alta proporción reduce los síntomas pre-menopáusicos y post-menopáusicos en las
mujeres (A. Cassidy, Proceedings of the Nutrition Society, 1996, 55, 339-417). Estos hechos, que aún carecen de bases
claramente científicas, se atribuyen a menudo a las isoflavonas agliconas genisteína, daidzeína y gliciteína, las cuales
están presentes en varios alimentos basados en la soja.
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Las isoflavonas se consideran a menudo estrógenos de plantas, y numerosos estudios in-vitro han mostrado que
estas sustancias actúan mediante un mecanismo de competición con estrógenos de mamíferos con una actividad de
inferior evaluación con un factor de 500 a 1000 que la del estradiol (D.A. Shutt and R. I. Cox, Journal of Endocrinology,
1972, 52, 299-310).
De acuerdo con la literatura biomédica y la información epidemiológica publicadas en los últimos años, princi-
palmente en relación a poblaciones del Este, que consumen alimentos basados en la soja en mayor proporción, el uso
de estos alimentos hace disminuir en una alta proporción el cáncer de mama en mujeres y el cáncer de próstata en
hombres (A. Nomura, B.E., Henderson J. Lee, American Journal of Clinical Nutrition, 1978, 31, 2020-2025; T. Hira-
yama in Diet, Nutrition and Cancer, 1986 pp. 41-53, Y. Hayashi, M. Nagao, T. Sugimura, S. Takayama, L. Tomatis,
L.W. Wattenberg y G.N. Wogan eds. Tokyo: Japanese Scientific Society Press; R.K. Severson, A.M.Y. Nomura, J.S.
Grove, G.N. Stemmerman, Cancer Research, 1989, 49, 1857-1860. También, estos hechos, que aún carecen de bases
claramente científicas, se atribuyen a menudo a las isoflavonas agliconas genisteína, daidzeína y gliciteína, las cuales
están presentes en varios alimentos basados en la soja.
Estas isoflavonas se han estudiado en modelos in-vitro en consideración a su capacidad de interactuar con proteínas
quinasas, particularmente con tirosina quinasa, enzimas que parecen jugar un papel en la proliferación de células
tumorales.
Recientemente se han hecho numerosos ensayos para preparar fármacos con extractos de soja para el tratamiento
preventivo de síntomas pre-menopáusicos y post-menopáusicos y también para el tratamiento preventivo del cáncer.
Algunas patentes o solicitudes de patentes describen composiciones de nuevos extractos de soja obtenidos por hi-
drólisis química o enzimática de los glucósidos presentes en las judías de soja o brotes de judía de soja (Kikkoman
Corp. J-08291191; Kikkoman Corp. J-07173148; Kelly GE WO-9323069; Kikkoman Corp. J-0511707566). Todas
estas publicaciones se refieren exclusivamente en la preparación de isoflavonas de alta concentración y actividades en
consideración al control de trastornos pre-menopáusicos y post-menopáusicos y a la actividad antitumoral.
Se ha encontrado ahora, que contrariamente a lo que se ha descrito previamente, los extractos que contienen glu-
cósidos de isoflavonas y saponinas de soja del grupo B en proporciones definidas se consideran más activos que las
isoflavonas aisladas en cuanto a ambas, la prevención o tratamiento de síntomas pre-menopáusicos y post-menopáusi-
cos y la prevención o el tratamiento de cáncer.
Otro aspecto relacionado con el extracto de la invención tiene que ver con el abuso de alcohol y dependencia
del alcohol o adicción al alcohol. Éstos son fenómenos que pueden ser resumidos bajo el término “alcoholismo” y
forman un serio problema de toda la sociedad moderna (Gessa G.L., “Bisogno compulsivo di bere e principio del
piacere” [La compulsión de beber y el principio del placer] en Medicina delle tossicodipendenze [Medicina de la
drogodependencia] II, 5 (1994)). En Italia, por ejemplo, más del 9% de la población (unos 5 millones) son bebedores
asiduos y más de un millón son alcohol-dependientes (Calmo-Spechhia F.P., “Epidemiologia dell’alcolismo in Italia”
[Epidemiología del alcoholismo en Italia] en Atti del VII Congresso Nazionale della S.I.A.[Informes del séptimo
congreso nacional de la S.I.A.] Mediserve, Roma, 295-301 (1991)). Estos números se incrementan cuando países como
USA se tienen en cuenta, dónde más de 13 millones son alcohol-dependientes. El abuso de alcohol y la dependencia
de alcohol actuales inducen a un gasto público muy alto (desde 1991, en USA se han gastado alrededor de 200 mil
millones de dólares al año)y son causas de un gran daño social y psicológico a estos afectados.
Ensayos existentes para tratar el alcoholismo además de aquellos de naturaleza psicológica (terapia de grupo etc.)
consisten en administrar fármacos tales como disulfiram y carbamida de calcio, los cuales actúan en el metabolismo del
alcohol, la aldehído deshidrogenada hepática se inhibe y por consiguiente el nivel de acetaldehido emético incrementa,
junto con todos los fenómenos indeseables que tienen lugar en el curso de la toma de alcohol.
De acuerdo con el artículo anterior, las únicas plantas de las que sus derivados se usan para el tratamiento del
alcoholismo son Pueraria lobata (Radix puerarie) y Salvia miltiorrhiza, las cuales se usan ampliamente en la medicina
china tradicional y forman el contenido de las solicitudes de patentes WO 93/00896 y WO 96/35441. Además del uso
de los extractos, estas solicitudes de patente reivindican el uso de sustancias puras tales como la daidzeína y sus
derivados semisintéticos en WO 93/00896, o diterpenoides, como tanshinona y miltirona en WO 96/3544l. Un efecto
en la alcohol deshidrogenasa con la ocurrencia del efecto descrito anteriormente se ha descrito para los derivados de
isoflavona, mientras que el mismo mecanismo se ha excluido para los componentes diterpenoides. Además, la solicitud
de Patente WO 96/36332 revela el efecto de la forskolina en la reducción del consumo de alcohol.
Sorprendentemente, se ha descubierto que los extractos que contienen isoflavonas glucosídicas y saponinas del
grupo B de la soja en proporciones definidas pueden ser utilizados con éxito para reducir el consumo deliberado de
alcohol. Estos extractos son significativamente más efectivos que las isoflavonas solas y actúan mediante un mecanis-
mo que es distinto del de la inhibición de la alcohol deshidrogenasa, pues el nivel plasmático de alcohol permanece
invariable.
Además de lo mencionado el artículo anterior Wo 96/10341 revela alimentos o productos para la salud que con-
tienen hipocotilos de semillas de soja sustancialmente puros. No se hace ninguna referencia al procedimiento de
extracción ni a la proporción entre isoflavonas y saponinas de acuerdo con la presente invención.
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US 4.428.876 revela un proceso para aislar saponinas y flavonoides a partir de plantas leguminosas. La allí expuesta
extracción de soja con hidróxido sódico acuoso 0,4% hace el extracto final diferente del de la presente invención. Una
vez más, no se hace referencia a la proporción entre isoflavonas y saponinas de acuerdo con esta invención.
JP 59088064 se dirige al aislamiento y el uso de sólo saponinas. Lo mismo es aplicable a DE 34 00 258. De forma
similar JP 61036225 se dirige al aislamiento y purificación de saponinas y JP 62005917 a la preparación de saponinas
puras completamente libres de isoflavonas. JP 4036242 concierne la preparación de saponina pura o de un extracto
con una elevada proporción saponina/isoflavona cómo un compuesto antiinflamatorio.
EP-A-426 998 expone la preparación de isoflavonas a partir de soja y en particular de genistina y malonato de
daidzina. No se hace referencia a la extracción de saponinas y a la proporción entre isoflavonas y saponinas.
JP 63245648 se dirige a la preparación de material alimenticio de soja libre de saponinas e isoflavonas las cuales
son consideradas los componentes ásperos dejando el alimento incomible.
Mark Messina et al., Journal of the National Cancer Institute, Vol. 83, No. 8, April 17,1991, páginas 541-546 se
dirige al papel de los productos de soja en la reducción del riesgo de cáncer ya descrito en la literatura científica.
Ni este documento ni la literatura, sin embargo, se refieren a un extracto que contiene saponinas e isoflavonas en la
proporción de esta invención, dejando sólo en efecto farmacológico obtenible por un extracto tan específico.
La presente invención consecuentemente se refiere a un extracto que contiene 0,6 a 1,5 partes en peso, preferible-
mente 1 parte en peso de saponinas del grupo B de soja por 1 parte en peso de isoflavonas glucosidas, el contenido de
isoflavonas glucósidas del extracto siendo como mínimo el 13% en peso.
Como se muestra por análisis HPLC-MS, las saponinas del grupo B de soja que tienen un efecto beneficioso en la
actividad de los componentes isoflavona tienen las siguientes estructuras:
R1 R2
Saponina de soja V CH2OH Glucosa
Isómero de saponina de soja CH3 Arabinosa
Isómero saponina de soja CH2OH Ramnosa
Saponina de soja II H Ramnosa
Saponina de soja III CH2OH H
Saponina de soja IV H H
La invención además se refiere a un proceso para producir el extracto antes descrito, que se caracteriza en que
comprende las siguientes etapas:
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a) la extracción de judías de soja enteras y maduras o harina de soja libre de aceite que contiene saponinas de soja
del grupo B e isoflavonas glucósidas en la proporción recíproca de 3:2 a 2:3, con alcoholes alifáticos o una mezcla de
estos alcoholes con agua;
b) concentración del extracto de la etapa a);
c) purificación del extracto concentrado de la etapa b) de sustancias oleosas y lipofílicas por tratamiento con
hidrocarburos alifáticos;
d) extracción del componente activo con alcoholes alifáticos inmiscibles en agua;
e) concentración del extracto de la etapa d) y su secado.
En particular, los extractos de acuerdo con la invención pueden ser producidos extrayendo judías de soja enteras y
maduras o harina de soja libre de aceite que contiene saponinas de soja del grupo B y glucósidos de isoflavonas en la
proporción recíproca de 3:2 a 2:3 con alcoholes alifáticos solos o en una mezcla con agua - preferiblemente con una
mezcla etanol/agua, tal como etanol puro al 95%. Después de la concentración del extracto y purificación de sustancias
oleosas y lipofílicas por tratamiento con hidrocarburos alifáticos (pej, n-hexano o n-heptano), los componentes activos
son extraídos con alcoholes alifáticos inmiscibles en agua tales como n-butanol, isobutanol e isoamil alcohol. Después
de concentrar a un volumen reducido, la fase orgánica se seca bajo presión reducida. La invención además se refiere
a la modificación del proceso anterior, en el que, después de la etapa b) o c), el extracto alcohólico concentrado se
somete a la siguiente etapa d’), que continúa con la etapa e):
d’) adsorción de los componentes activos en una resina de adsorción basada en poliestireno; enjuagar la resina con
agua; elución de los constituyentes activos con etanol.
De acuerdo con esta modificación, un extracto típico de la invención se puede producir por adsorción de los
componentes activos (isoflavonas y saponinas) que están presentes en el extracto concentrado alcohólico del material
vegetal, en una resina de adsorción de poli-estireno tal como una duolite o cualquier XAD, en particular la XAD1180
dado su pH ligeramente ácido; y elución de la mezcla de isoflavonas y saponinas de soja del grupo B a su vez con
etanol después de enjuagar con cuidado la columna de resina con agua para retirar sales y otros componentes inactivos.
El extracto obtenido bajo estas condiciones contiene del 13 al 17% en peso de isoflavonas y de 0,6 a 1,5 partes en
peso de saponinas de soja del grupo B, según la calidad del material de la planta utilizada, por 1 parte en peso de glu-
cósidos de isoflavonas. Este extracto también contiene una gran cantidad de sustancias polifenólicas que demostraron
ser esenciales para la actividad inherente del extracto.
Una realización del proceso antes mencionado y su modificación comprenden las siguientes etapas:
f) suspender el extracto de la etapa e) en una mezcla de alcohol miscible en agua y diluir éste con un disolvente
aprótico inmiscible en agua.
g) calentar la mezcla de la etapa f) para completar la disolución y dejarla a temperatura ambiente;
h) recoger por filtración las saponinas de la soja del grupo B precipitadas;
i) separar la fase orgánica de la fase acuosa; y concentrar la fase orgánica y secarla para producir los componentes
isoflavona; y
j) mezclar las saponinas de la etapa h) y las isoflavonas de la etapa i) para formar el extracto.
En consecuencia, los extractos de acuerdo con la invención puede ser preferiblemente, incluso aquellos caracteri-
zados por un muy elevado contenido de isoflavonas glucósidas y saponinas de soja del grupo B en la proporción antes
descrita, también producido a partir del extracto obtenido de acuerdo con el proceso arriba descrito y su modificación.
Para este propósito el procedimiento se puede seguir como sigue: dicho extracto se suspende en alcohol miscible en
agua, tal como metanol o etanol, teniendo un componente en agua del 10 al 50% en volumen, y se diluye con un di-
solvente aprótico inmiscible en agua, tal como cloruro de metileno o acetato de etilo. La mezcla heterogénea obtenida
se calienta para completar la disolución del extracto y se deja a temperatura ambiente, de forma que las saponinas de
soja del grupo B pueden precipitar. Las saponinas que tienen una pureza superior al 90% son recogidas por filtración.
Los componentes isoflavona que tienen una pureza superior al 80% se obtienen a partir de la tintura madre acuosa se-
parando la fase orgánica y evaporando y secando la última. Las isoflavonas y saponinas pueden luego mezclarse para
obtener un extracto que tenga el máximo contenido de glucósidos de isoflavonas y tenga un contenido de saponinas
de soja del grupo B de 0,6 a 1,5 partes en peso por 1 parte en peso de glucósidos de isoflavonas.
Las condiciones preferidas para llevar a cabo las etapas individuales del proceso del proceso de acuerdo con la
invención son las que siguen. En este caso las unidades de medida de partes en volumen son l (litros) y aquellas para
partes en peso son kg (kilogramos).
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Etapa a
El material vegetal es preferiblemente extraído con 12 a 17 volúmenes de disolvente por 1 parte (peso) de biomasa.
La temperatura de extracción es expedientemente por encima de 55ºC. Cada extracción es expedientemente llevada a
cabo en el curso de menos de 4 horas. Disolventes adecuados además del etanol son, entre otros, metanol, propanol e
isopropanol. Estos disolventes pueden contener agua hasta un 10%.
Etapa b
El extracto es expedientemente concentrado a temperatura inferior a 50ºC bajo presión reducida. El extracto es
expedientemente concentrado a un contenido alcohólico de 55 a 75%.
Etapa c
La purificación es expedientemente realizada utilizando 0,3 a 0,6 volúmenes de hidrocarburos alifáticos por 1 parte
(en peso) de material vegetal. Un procedimiento adecuado es el de extraer las sustancias oleosas y lipofílicas.
Etapa d
Los componentes activos son expedientemente extraídos con 0,2 a 0,4 volúmenes de disolvente alcohólico inmis-
cible en agua por extracción, calculado en 1 parte (en peso) de material vegetal; preferiblemente, se llevan a cabo tres
extracciones.
Etapa e
El extracto de la etapa d es expedientemente concentrado a temperatura inferior a 50ºC y bajo presión reducida.
Etapa f
El extracto de la etapa e) se suspende expedientemente en 5 a 10 volúmenes (por una parte de extracto) de al-
cohol soluble en agua, usando una proporción alcohol/agua en el rango desde 2:8 a 3:7 vol/vol. El solvente aprótico
inmiscible en agua se usa en una cantidad de 2 a 5 volúmenes, basados en una parte (por peso) del extracto de la
etapa e.
Etapa g
Para conseguir disolución completa, la mezcla se calienta expedientemente y se mantiene bajo reflujo. La mezcla
luego se mantiene preferiblemente a temperatura ambiente durante 15 a 24h.
Etapa i
La fase orgánica se concentra expedientemente por evaporación a una temperatura por debajo de 30ºC bajo presión
reducida.
Etapa j
Preferiblemente, las saponinas de la etapa h y los glucósidos de isoflavonas de la etapa g se usan para preparar una
solución alcohólica que contiene las saponinas y los glucósidos de isoflavonas en una proporción 1:1, la cual luego se
concentra para secarla a una temperatura por debajo de 50ºC bajo presión reducida.
Las cantidades de isoflavonas y saponinas de soja del grupo B se determinan por análisis HPLC usando una
columna Supelco-Sil LC-ABZ (250 mm x 4,6 mm), 5 µm, y un medio de elución ternario usando un gradiente, com-
prendiendo A) H2O (CF3COOH 0,01%), B) acetonitrilo (CF3COOH 0,01%) y C)alcohol metílico (CF3COOH 0,01%).
Los componentes individuales pueden ser identificados y caracterizados por espectrometría de masa combinada con
HPLC mediante una interfície termospray.
Los extractos de acuerdo con la invención se distinguen de los extractos previamente conocidos con respecto a su
acción especial.
Respecto a los desórdenes de la menopausia, sofocos de calor, insomnio y depresión son los síntomas climatéricos
más frecuentes que la mujer sufre durante la menopausia. Ellos se acompañan por una disminución o cesación de la
actividad ovárica y también por un decrecimiento de la producción de estrógenos y un incremento de la producción de
la hormona luteinizante (LH) y la hormona estimuladora del folículo.
Un estudio reciente (Ducker E.M. et al.; Planta. Med 57, 420, 1991) describió una asociación entre un incremento
ocasional en LH y cambios de temperatura en la piel de ratas hembras siguiendo una ovariectomía. Esta relación entre
el nivel de LH y los sofocos de calor, la cual se ha observado no solamente en el caso de de ratas hembra sino que
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también en mujeres, sugiere que la dosis de LH secretada se puede considerar como un parámetro adecuado para el
estudio de efectos psiconeuróticos/endocrinos de componenetes activos endocrinos.
La Tabla 1 muestra los resultados que se obtuvieron cuando las ratas hembras ovariectomizadas se trataron con dos
fracciones separadas (isoflavonas y saponinas de soja del grupo B) y los extractos de acuerdo con la invención.
TABLA 1
Concentración de hormona luteinizante (LH) en el plasma de ratas hembras ovariectomizadas después del
tratamiento oral con extractos de soja
Producto administrado Dosis (mg/kg/día) LH (ng/ml)
Vehículo 10 ml/kg 6,2 ± 0,01
Saponinas de soja del grupo B 1,000 5,8 ± 0,02
Isoflavonas de Soja 1,000 3,4 ± 0,001
Preparado de extracto de soja como en el Ejemplo 1 1,000 2,1 ± 0,001
Preparado de extracto de soja como en el Ejemplo 3 1,000 1,3 ± 0,001
Las ratas hembras se sometieron a ovariectomía por métodos conocidos. 15 días después de la operación los
animales se trataron con las sustancias de prueba por administración oral simple al día durante 15 días. Se mataron
a los animales tres horas después del último tratamiento. Después la sangre se centrifugó inmediatamente y el suero
obtenido se mantuvo a -25ºC hasta la determinación de LH por radioimmunoensayo de acuerdo con el método descrito
por Niswender et al. (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 128, 807, 1986).
Como se puede ver, administrar los extractos de acuerdo con la invención condujo a una disminución, según las
estadísticas, significante de LH, la cual fue mayor que la obtenida por la suma de los componentes individuales (efecto
sinérgico).
Los extractos empleados en tratamientos repetidos de animales sanos condujo a cambios no macroscópicos o
microscópicos en los órganos o sistemas de animales machos, mientras que en animales hembras ellas emplean el
peso del útero y del esqueleto, lo cual confirma su actividad estrogénica.
Cuando los extractos de acuerdo con la invención se administraron a mujeres durante la menopausia independien-
temente de si esto ocurría naturalmente o se produjo quirúrgicamente - modificaron el nivel de LH en el plasma y
redujeron los trastornos menopáusicos tales como los sofocos de calor o depresión etc. y al cabo de pocos días del
tratamiento también redujeron la desmineralización de los huesos durante el tratamiento durante largos períodos.
Los extractos de acuerdo con la invención también han marcado actividad antiproliferativa. La Tabla 2 muestra la
actividad antiproliferativa hacia una línea celular de tumor ovárico (OVCA 433).
TABLA 2
Actividad antiproliferativa de extractos de soja hacia una línea celular de tumor ovárico (OVCA 433) in Vitro
Componente IC50 µM
Saponinas del grupo B 6,2
Isoflavonas de soja 4,5
Preparado de extracto de soja como en el Ejemplo 1 1,6
Preparado de extracto de soja como en el Ejemplo 3 1,1
Las células se cultivaron en un cultivo monocapa en un mínimo de medio esencial que contiene agregado de
suero de ternera y 200 unidades/ml de penicilina para mantener el medio estéril. Para la reproducibilidad de las
pruebas, las células se tripsinizaban cada semana y se aplicaron a las placas a una densidad de 8 x 104
células/ml y
se incubaron a 37ºC bajo una atmósfera de aire con un contenido 5% de CO2 y humedad. Para ensayar la actividad
de los componentes, las células se colocaron en pocillos (Falcon 3046, Becton Dickinson NY) a una concentración
de 1 x 105
/ml en una cantidad mínima de sustrato. Después de 24h, el sustrato se reemplazó por sustrato fresco y los
componentes disueltos se añadieron en etanol absoluto. Los controles se trataron de manera similar con el excipiente
en ausencia del componente activo para ser probado. El tratamiento descrito anteriormente se repitió a intervalos de
24 horas para un periodo de prueba de 72h. La inhibición de la proliferación celular se calculó por enumeración
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directa de las células, con el crecimiento de los controles siendo comparados con éste de la prueba “tratada”. Como
se ha mostrado, los extractos de acuerdo con la invención poseían una actividad antiproliferativa mayor que la de las
suma de la actividad antiproliferativa de sus componentes (actividad sinérgica). Los componentes de acuerdo con la
invención inhibían la proliferación celular in vivo, como se verificó midiendo la talla de los tumores transplantados en
el interior de un ratón desnudo atímico de acuerdo con las condiciones habituales descritas en la literatura. Tratar los
animales con dosis en el rango de 10 a 500 mg/kg llevó a una degeneración marcada de los tumores estudiados, hasta
su desaparición en un alto porcentaje de los individuos.
En cuanto al efecto en el consumo de alcohol, este efecto se determinó usando ratas consumidoras de alcohol de
las especies “Sardos preferentes de alcohol” (Sp) (Fadda F., Mosca E., Colombo G., Gessa G.L, Alcohol preferring
rats; Genetic sensitivity to alcohol-induced stimulation of dopamine metabolism, en Physiol. Behav. 47, 727 (1990)
9. Estos animales que, con una libre elección entre alcohol y agua, consumen de 6 a 7 g de alcohol diariamente por
kg de peso corporal (en una proporción de agua-alcohol mayor que 2:1) se han usado exitosamente en los últimos
años para determinar el efecto de varias sustancias el consumo voluntario de alcohol, ver por ejemplo, Balakleevsky
A., Colombo G., Fadda F., Gessa G.L., Ro 19-4603, a benzodiazepine receptor inverse agonist, attenuates voluntary
ethanol consumption in rats selectively bred for high ethanol preference, en Alcohol 25, 449-452 (1990); Fadda F.,
Garau B., Colombo G., Gessa G.L., Isardipine and other calcium channel antagonists attenuate ethanol sonsumption
in ethanol-preferring rats, en Alcoholism: Clinical and Experimental Research 16 (3), 449-452 (1992).
Los animales que se mantuvieron bajo condiciones normales de acomodación podían libremente escoger entre
agua (que siempre estuvo presente) y alcohol (una solución al 10% vol/vol) el cual se ofreció durante un periodo de
4h al día (esto es las primeras cuatro horas de oscuridad durante el ciclo día/noche). Las cantidades de agua y alcohol
consumidas se registraron cada día a la misma hora. Se ofreció comida cuando se deseaba. Después de un consumo
estable de agua y alcohol se consiguió, el extracto, a una dosis de 1000 mg/kg suspendida en agua, se administró
oralmente en una cantidad volumétrica de 2 ml/kg una vez al día durante 7 días sucesivos. Como control, se usó un
volumen idéntico de excipiente. Al final del tratamiento, el consumo de alcohol se registró hasta que el valor de antes
del tratamiento se cumplió.
La Tabla 3 muestra el efecto de la administración oral repetida de 1000 mg/kg de extracto de soja en el consumo
de alcohol.
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Tabla 3 lleva a la conclusión que el extracto de soja disminuye significativamente el consumo de alcohol. La re-
ducción del consumo de alcohol permanece constante durante los siete días de tratamiento y luego disminuye después
del final del tratamiento. Además, se puede observar que la reducción en el consumo de alcohol es mayor que la dada
por la suma de los efectos de los componentes individuales (efecto sinérgico).
La invención por lo tanto también se refiere a una composición farmacéutica que contiene el extracto antes des-
crito como componente activo. En particular, la invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene
este extracto para la prevención o el tratamiento de síntomas pre- y post-menopáusicos, a una composición farma-
céutica que contiene este extracto para la prevención y el tratamiento de cáncer de mama en mujeres y de próstata
en hombres y a una composición farmacéutica que contiene este extracto para la prevención o el tratamiento del
alcoholismo.
Los productos o extractos de acuerdo con esta invención pueden ser formulados de forma adecuada en comprimi-
dos, cápsulas de gelatina dura o blanda, polvos granulados para preparar soluciones listas para usar o fluidos o líquidos
que son compatibles con su solubilidad. Las dosis del extracto de acuerdo con la invención están en el rango entre 30
mg y 500 mg en el caso de administración única o repetida al día, preferiblemente 200 mg con administración dos
veces por día. La forma oral es la forma de administración adecuada.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención.
Ejemplo 1
Producción de extracto de soja con un contenido en isoflavonas del 15% en peso y una proporción de glucósidos de
isoflavonas /saponinas de soja del grupo B de 1: 1,5 por purificación con disolventes
10 Kg de harina de soja libre de aceite que contiene 0,2% de isoflavonas glucósidas y 0,3% de saponinas de soja
del grupo B se someten a reflujo cinco veces con 30 l de alcohol etílico 95%. Los extractos alcohólicos se mezclan
y se concentran bajo presión reducida hasta 5 l. El concentrado se diluye con 1,5 l de agua y se extrae cuatro veces
con 5 l de n-hexano. La fase de hexano se descarta y la fase orgánica concentrada se extrae cuatro veces utilizando
2,5 l de n-butanol. La fase orgánica se concentra y se seca bajo presión reducida. Se obtienen 133 g de extracto que
tiene un contenido en isoflavonas del 15% en peso y un contenido en saponinas de soja del grupo B del 22,5% en
peso.
Un diagrama HPLC del extracto obtenido con el proceso de este ejemplo se muestra en la Figura 1.
Ejemplo 2
Producción de extracto de soja con un contenido en isoflavonas del 15% en peso y una proporción de isoflavonas
glucósidas/saponinas de soja del grupo B de 1: 1,5 por purificación en resina de poliestireno
El concentrado acuoso producido en el ejemplo 1 no se extrae con n-butanol, sino que se trata con aceite de ricino
polietoxilado (Cremophor®), para disolver los residuos de la resina de la concentración de la fase alcohólica. Luego
se aplica, suspendido en agua purificada (5l), en una columna de resina xad1180. La columna se enjuaga después con
agua para eliminar de forma completa las sales, azúcares y agentes de superficie activos y luego se eluye con unos 10
l de alcohol etílico 95%. Después de concentrar y secar el eluido alcohólico, se obtienen 130 g de extracto que tiene
el mismo contenido que el extracto obtenido en el Ejemplo 1.
Ejemplo 3
Producción de extracto de soja con un contenido en isoflavonas del 43% en peso y una proporción de glucósidos de
isoflavonas/saponinas de soja del grupo B de 1:1
200 g del extracto obtenido en el Ejemplo 1 o 2 se suspenden en 1 l de alcohol etílico 20% acuoso y se diluye
con 0,5 l de acetato de etilo. La suspensión se somete a un calentamiento a contracorriente con agitación vigorosa
hasta completa disolución y luego se deja durante el transcurso de una noche. Las saponinas precipitadas (38 g, pureza
93%) se aislan por filtración y se separa la tintura madre acuosa que contiene etilacetato y agua. La fase orgánica se
concentra bajo presión reducida y secada. El residuo de isoflavonas - 37 g con una pureza de 81% - se disuelve en 1 l
de alcohol etílico y se mezcla con 32 g de saponinas cristalizadas, para obtener un producto que contiene isoflavonas y
saponinas en una proporción en peso de 1:1. La solución alcohólica se concentra hasta sequedad bajo presión reducida
y proporciona 69 g de extracto con un contenido de 43% en peso de glucósidos de isoflavonas y 43% en peso de
saponinas de soja del grupo B.
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Ejemplo 4
Producción de cápsulas de gelatina dura que contienen extracto de soja
Extracto de soja, producido de acuerdo con Ejemplo 1 200,0 mg
Lactosa 67,5 mg
Celulosa microcristalina 22,5 mg
Dióxido de silicio coloidal 3,0 mg
Croscarmelosa sódica (polímero reticulado de carboximetilcelulosa sódica) 21,0 mg
Talco 8,0 mg
Estearato de magnesio 3,0 mg
Ejemplo 5
Producción de comprimidos que contienen extracto de soja
Extracto de soja, producido de acuerdo con Ejemplo 3 400,0 mg
Polisacáridos de soja 155,5 mg
Celulosa microcristalina 57,0 mg
Hidroxipropilmetilcelulosa 12,0 mg
Aceite vegetal hidrogenado 19,5 mg
Dióxido de silicio coloidal 3,0 mg
Estearato de magnesio 3,0 mg
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REIVINDICACIONES
1. Extracto de soja, caracterizado por contener de 0,6 a 1,5 partes en peso de saponinas de soja del grupo B por 1
parte en peso de glucósidos de isoflavonas, siendo el contenido de glucósidos de isoflavonas del extracto como mínimo
del 13% en peso.
2. Extracto de soja de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por un contenido de 1 parte en peso de
saponinas de soja del grupo B por 1 parte en peso de isoflavonas glucósidas.
3. Un proceso para la producción de extracto de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, que se caracteriza en que
comprende las siguientes etapas:
a) la extracción de judías de soja maduras enteras o harina de soja libre de aceite que contiene saponinas de soja
del grupo B y glucósidos de isoflavonas en la proporción recíproca de 3:2 a 2:3, con alcoholes alifáticos o una mezcla
de éstos alcoholes con agua;
b) concentración del extracto de la etapa a);
c) purificación del extracto concentrado de la etapa b) de sustancias oleosas o lipófilas por tratamiento con hidro-
carburos alifáticos;
d) extracción de componentes activos con alcoholes alifáticos inmiscibles en agua;
e) concentración del extracto de la etapa d) y su secado.
4. Un proceso para producir un extracto de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, que comprende la etapa a), y en
el que, después de la etapa b) o etapa c), el extracto alcohólico concentrado es sometido a la siguiente etapa d’), que
es seguida de la etapa e):
d’) adsorción de los componentes activos en una resina de adsorción basada en poliestireno; enjuagando la resina
con agua; elución de los constituyentes activos con etanol, en dónde las etapas a),b),c) y e) son como en la reivindica-
ción 3.
5. El proceso de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4, comprende las siguientes etapas adicionales:
f) suspender el extracto de la etapa e) en una mezcla de alcohol miscible en agua y agua y diluir ésta con un
disolvente aprótico inmiscible en agua;
g) calentar la mezcla de la etapa f) para completar la disolución y dejarla a temperatura ambiente;
h) recoger las saponinas de soja del grupo B por filtración;
i) separar la fase la fase orgánica de la fase acuosa; y concentrar la fase orgánica y secarla para producir los
componentes isoflavona; y
j) mezclar las saponinas de la etapa h) y las isoflavonas de la etapa i) para formar el extracto.
6. Una composición farmacéutica que contiene, como componente activo, un extracto de acuerdo con las reivindi-
caciones 1 o 2.
7. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 para la prevención o el tratamiento de síntomas
pre- y post-menopáusicos.
8. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 para la prevención o el tratamiento de cáncer.
9. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 o 8 para la prevención o el tratamiento del
cáncer de mama en mujeres.
10. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 o 8 para la prevención o el tratamiento del
cáncer de próstata en hombres.
11. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 para la prevención o el tratamiento del
alcoholismo.
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