1. Trabajo Original
Estudió del efecto del momento circadiano en el aprendizaje y la memoria
olfativa en las abejas Apis mellifera
Fuente: http://www.springerlink.com
Marina Lehmann 1, 1 y Gustav David C. Giovanni Galicia 1
(1) Neurobiología de la Universidad de Konstanz, Universitätsstrasse 10, 78464 Konstanz, Alemania
C. Giovanni Galicia
Correo electrónico: giovanni.galizia @ uni-konstanz.de
Recibido: 28 de enero 2010 Revisado: 12 de julio 2010 Aceptado: 14 de julio 2010 Publicado en Internet el: 31 de
julio 2010
Comunicado por M. Giurfa
Resumen
ritmo circadiano juega un papel importante para muchos aspectos de la vida de las abejas de miel. Sin embargo, la cuestión de si
también afecta el aprendizaje y la memoria han quedado sin respuesta. Para abordar esta cuestión, se estudió el efecto del momento
circadiano en el aprendizaje y la memoria olfativa en las abejas melíferas Apis mellifera utilizando el condicionamiento olfativo de
la extensión de la probóscide paradigma reflejo. Las abejas fueron condicionados diferencialmente a los olores y probado por su
olor aprendizaje en cuatro diferentes "puntos de tiempo" Zeitgeber. Se muestra que el comportamiento de aprendizaje se ve influida
por el momento circadiano. Las abejas de miel obtienen los mejores resultados en la mañana en comparación con los otros
momentos del día. Además, encontramos influencias de las abejas condición de luz fueron entrenados en el aprendizaje
olfatorio. Esta mediada por el aprendizaje circadiano es independiente de alimentación de las abejas tiempos eran arrastrados a, lo
que indica una heredada y no adquirida mecanismo. Tenemos la hipótesis de que un mecanismo de co-evolución entre la abeja de la
miel como polinizadores y plantas podrían ser el motor para la evolución de la persona a cargo de aprendizaje habilidades de tiempo
de las abejas.
complementaria Material electrónico La versión online de este artículo (doi: 10.1007/s00265-010-1026-9 ) contiene material
complementario, que está disponible para los usuarios autorizados.
Circadiano Palabras clave - La miel de abeja - Aprendizaje - Olfato
Introducción
Con la repetición constante de día y de noche, los animales se enfrentan a cambios de luz, temperatura y otros factores ambientales,
tales como alimentos o depredadores. La calidad constante de este fenómeno se les da la posibilidad de anticipar y aprovechar el
momento adecuado del día y de la situación. La predicción de los cambios en el ambiente se hace posible por el reloj circadiano
endógeno. ritmo circadiano afecta a casi todos los aspectos de sanidad animal o la vida humana, desde el nivel celular hasta el
comportamiento. Por lo tanto, no es de extrañar que el aprendizaje también ha demostrado ser afectados por los ritmos diurnos
(Daan 2000 ; Schmidt et al. 2007 ).
La existencia de ritmicidad diurna para las abejas de miel ya se había observado a principios del siglo XX, cuando Hugo von Buttel-
Reepen ( 1900 ) mostraron que las abejas son capaces de aprender la hora del día cuando las flores producen néctar y polen. Diez
años más tarde, Forel ( 1910 ) describe las abejas la recogida en su mesa de desayuno todos los días a la misma hora del día. Esta
memoria del tiempo se denominó "Zeitgedächtnis" y extensamente estudiado por Beling ( 1929 ) y Wahl ( 1932 ). En ese momento,
se planteó la hipótesis de que el "Zeitgedächtnis" es de alguna manera relacionados con el néctar y polen de la secreción de las
abejas forrajeras flores (Beutler 1930 ; Kleber 1935 ) y que las abejas sólo forraje cuando la secreción alcanza su máximo diario.
Un claro indicio de que las abejas de miel tienen un sentido endógeno de tiempo fue dada por Renner ( 1960 ) con un experimento
en el que transoceánicos voló arrastrado abejas en tiempo de París a Nueva York y observó que las abejas todavía mantienen su
calendario de París. Beier y Lindauer (Beier 1968 ; Beier y Lindauer 1970 ) mostró que el ritmo circadiano se ajusta mensualmente
por el sol como el "Zeitgeber", y Koltermann ( 1971 ) demostró que la "Zeitgedächtnis" permite a las abejas distinguir entre los
puntos de tiempo lo más cerca 20 minutos y no se limita a los olores, sino también aplicables a los colores. Prabhu y Cheng
( 2008a , b ) demostraron que esta aptitud funciona incluso después de sólo 1 día de aprendizaje para ambas modalidades, ya pesar
de deterioro por los recuerdos contradictorios. Más tarde, el fondo genético de la abeja de miel reloj circadiano se desenredó (Toma
et al. 2000 ; Rubin et al.2006 ), basado en los hallazgos en otras especies de insectos a partir de 1971 con el descubrimiento del gen
de la época en Drosophila melanogaster(Konopka y Benzer 1971 ).
La mayoría de experiencias en materia de aspectos conductuales y ecológicos del ritmo circadiano en las abejas de la miel se
realizaron a nivel de la población, con pocas excepciones (Moore y Rankin 1983 ; Kaiser 1988 ). Todos los experimentos se
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2. llevaron a cabo para dilucidar la capacidad de recordar un momento específico del día o para encontrar otros posibles "Zeitgeber"
que añadir a la función de luz del día. Hasta ahora, ningún estudio ha investigado si las abejas "los resultados del aprendizaje varía
con un ritmo circadiano. Esto es sorprendente, habida cuenta de que la memoria se ha demostrado que ser modulada por el tiempo
circadiano en otras especies, como el leucophaea maderae cucaracha (Decker et al. 2007 ), la mosca de la
fruta D. melanogaster(Lyon y Roma 2009 ) y los moluscos y Aplysia californica Aplysia fasciata (Lyons et al. 2005 ). La influencia
del reloj circadiano en la memoria también se ha demostrado en los vertebrados, como el pez cebra (Rawashdeh et al. 2007 ) o los
seres humanos (Fabbri et al. 2008 ). Por lo tanto, investigamos la influencia de la sincronización circadiana en la capacidad de
aprendizaje de las abejas melíferas persona que utiliza el reflejo de extensión probóscide (PER) (Bitterman et al. 1983 ) para el
acondicionamiento diferencial apetitivo (véase "Materiales y métodos") en varias ocasiones del día y encontró que el rendimiento de
aprendizaje es mejor en la mañana. Tenemos entonces a analizar si este pico de rendimiento diario puede ser desplazado por arrastre
de las abejas a las expectativas de los alimentos específicos en otros momentos del día y se encontró que esto no es el caso.
Materiales y métodos
La miel las abejas
Todos los experimentos se llevaron a cabo en Apis mellifera forrajeras (enfermeras no muestran el ritmo circadiano (Shemesh et
al. 2007 )). Las abejas fueron capturados en un alimentador situada delante de las colmenas, a la entrada de la colmena o en el caso
de las abejas en interiores, en los alrededores de gasa colmena. Las abejas no se detecta en el alimentador fueron identificadas como
forrajeras por su edad avanzada (conductualmente por la captura de abejas volando o sentado fuera de la colmena y por su aspecto
global, por ejemplo, pérdida de cabello torácica, abdomen más oscuro, agotado-alas). Las abejas se enfriaron en hielo durante varios
minutos hasta que sólo dejó de moverse. Hemos mantenido el tiempo de enfriamiento lo más breve posible a fin de minimizar los
posibles efectos en tiempo circadiano, dado que la temperatura es un potente "Zeitgeber" (Fuchikawa y Shimizu 2007 ). Tiempo de
enfriamiento fue siempre inferior a 10 minutos y por lo tanto mucho menos que los 30 min informó de que un efecto sobre el ritmo
circadiano (Hamm et al. 1975 ).
Después de aprovechamiento, las abejas se alimentaron con 1,25 M de sacarosa ad libitum solución. Todas las abejas se quedó toda
la noche o, en caso de que se acondicionaron en la noche, durante el día ya sea en su envase o en un ambiente humedecido en una
habitación sin ser molestados. Para aprovechar las abejas al aire libre, se aseguraba que experimentaron ritmicidad diaria normal
durante ese tiempo, es decir, la duración del día y la temperatura. Todos los experimentos se llevó a cabo entre febrero y septiembre.
Al aire libre abejas
Las abejas procedentes de colmenas al aire libre puede volar libremente en las cercanías y de forraje en las praderas y los bosques
cercanos. abejas exterior experimentó la periodicidad normal de la duración del día, los que ocurren naturalmente en los cambios de
temperatura y condiciones de viento y la sucesión natural de la floración y el flujo de néctar.
Cubierta abejas
abejas interior se guardaban en una caja de gasa (4 × 2,4 × 2,3 m) dentro de un cuarto (6 × 2,40 × 2,50 m). Estas habitaciones
estaban iluminadas por 12 tubos fluorescentes (Philips MASTER TL-D90 Pro DeLuxe W/965 58) y 12-tubos fluorescentes UV
(Osram Eversun L80/79). Balastos electrónicos mejorada tubos 'parpadeo de la tasa a 300 Hz. La temperatura y la humedad se
controla con un calentador eléctrico y un humidificador de aire. Humedad se estableció en 75% de humedad relativa
aproximadamente, la temperatura se mantuvo entre 18 ° C (noche) y 25 ° C (día). La radiación solar y altas temperaturas exteriores
llevado a mayores temperaturas ligeramente durante algunos días de verano. La luminancia de 1 m por encima del suelo fue de
aproximadamente 1.800 lux. agua de azúcar, el polen de tierra y el agua fueron proporcionados en una tabla donde las abejas
podrían forraje. De acuerdo a las necesidades de experimentación, el ciclo de luz oscuridad era o 12 h luz/12 h oscuridad (LD) o DL
12:12. Estas abejas se hará referencia a las abejas como en interiores.
Diferencial PER acondicionado
A 10 min antes de los experimentos, se comprobó cada abeja para PER intacta tocando ligeramente una antena con una solución de
sacarosa 1,25 M sin alimentar a la abeja. Los animales que no presentaban ningún reflejo o no se podía mover libremente sus partes
bucales fueron excluidos de los experimentos.Además, las abejas, que no mostraron respuesta a todos durante el entrenamiento y las
pruebas fueron excluidos del análisis, así como las abejas, que respondió a cada olor constantemente.
Un condicionamiento diferencial apetitiva se utilizó para analizar el aprendizaje olfativo. Un olor sirvió como un estímulo
condicionado reforzado (EC +), que fue recompensado con una solución de sacarosa 1,25 M (estímulo incondicionado, EE.UU.), el
otro se quedó sin recompensa olor (CS-) (Bitterman et al.1983 ). Los olores se entregaron a las abejas de miel con una a la medida,
olfatómetro controlada por ordenador. La velocidad del aire a la cabeza abejas estaba a punto de 1,6 m / s que consiste en una
corriente de aire compañía y un flujo de olor. Para evitar cambios en la velocidad del aire, la apertura de la corriente de olor se
compensó con una corriente de aire de cierre correspondiente. Para todos los experimentos, 1-hexanol y 2-octanol (Sigma Aldrich)
fueron utilizados. Estos olores se diluyeron 10 -2 en aceite mineral. Un total de 200 l de diluir el olor se aplicó en tiras rectangulares
Sugi (Kettenbach GmbH & Co. KG, Eschenburg, Alemania) y se coloca en el extremo distal de 2 ml jeringas en el olfatómetro. de
aspiración de aire detrás del aparato de acondicionado impidió la acumulación de olores.
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3. Un intervalo entre ensayos de 10 minutos y una duración de prueba de 40 s permitido la formación de 15 abejas en
paralelo. Después de 20 s de familiarización con el contexto experimental, el CS fue presentado a la abeja de 4 s. Tres segundos
después del inicio del + CS, las antenas se estimularon con los EE.UU., lo que lleva a una extensión de la probóscide. La abeja se le
permitió a los piensos para 3 s. La abeja se quedó en el contexto de acondicionamiento de un adicional de 14 s.
Las abejas fueron expuestos a un total de 12 estímulos olor durante el entrenamiento. Los olores se presentaron en un pseudo-
aleatorios fin (por ejemplo, ABBABAABABBA), comenzando con olor a A o B en una presentación equilibrada. Ambos hexanol y
octanol sirve como CS + en una forma equilibrada. 30 minutos después del entrenamiento, las abejas fueron probados por su
respuesta olor. El procedimiento de ensayo fue similar a la de los ensayos de condicionamiento, pero no EE.UU. fue dada después
de la entrega olor. Los olores de prueba se aplican en el orden EC + - CS-.
Durante los experimentos, la respuesta de la abeja de la sustancia odorífera presentado (o Por no) después de la aparición de la
sustancia odorífera y antes de la presentación del agua con azúcar en el caso de ensayos reforzados se registró. Múltiples respuestas
durante la presentación odorante se contabilizaron como una sola PER. La respuesta sólo al olor se señaló como uno; no hay
respuesta o PER provocados por agua con azúcar se observaron como 0. De las respuestas a la + CS y el CS, un diferencial de
aprendizaje índice (DLI) se calculó (Ec. 1 ).
2 Este índice es una variante del anterior índices de discriminación (et al Pelz. 1997 ; Vergoz et al. 2007 ; Fernández et
al. 2009 ). Corresponde a la diferencia entre la respuesta + CS y el CS-respuesta (v. fig. 2b y c ). Matemáticamente, se calcula como
donde l n es el número de aprendizaje las abejas (respuesta a la CS +, pero no a la CS-) n, el número de aprendizaje las abejas no (no
hay respuesta a la CS +, pero a la CS-) y t n el número total de las abejas.
Diseño experimental
Para investigar los efectos de la ritmicidad diurna en los resultados del aprendizaje, es necesario capacitar a las abejas en puntos
fijos de tiempo diario.iluminación régimen estándar para las abejas de interior fue de 12 h luz y 12 h oscuridad (12:12 LD) con las
luces encendidas a las 07:00 ("Zeitgeber" tiempo (ZT0)) y las luces apagadas a las 19:00 (ZT12) (Fig. 1a ). Además, existe un
régimen 12:12 con iluminación invertida (como se refiere 12:12 DL en el siguiente texto) que conduce a ZT0 a las 19:00 y ZT12 a
las 07:00 (fig. 1b ). tiempos de formación se establece en ZT3, ZT9, ZT15 y ZT21, correspondiente al cuarto y tres cuartos de día y
noche, respectivamente.
Fig. 1. Relación de la iluminación en tiempo real y "Zeitgeber" tiempo para que las abejas diferentes. En el círculo central indica el régimen de
iluminación (negro - oscuridad, blanco - luz del día); el círculo exterior de la "Zeitgeber" tiempo. En círculos del exterior, el tiempo que corresponda
del día se puede encontrar. Abejasuna cubierta (12:12 LD). Tanto la noche y el día tienen la misma duración (12 h). La luz se enciende a las 07:00
(ZT0) y apagado a las 19:00 (ZT12) - indica los tiempos en cursiva. B invertido abejas de interior (12:12 DL). Tanto la noche y el día tienen la
misma duración (12 h). La luz se enciende a las 19:00 (ZT0) y apagado a las 07:00 (ZT12) - indica los tiempos en cursiva. C abejas al aire libre a
mediados de junio (21.06) con una duración del día de 16 horas y una longitud de 8 de la noche h (16:8). Salida del sol en este ejemplo se
encuentra en 05:25 (ZT0) y el atardecer a las 21:25 (ZT12) - indica los tiempos en cursiva
La iluminación interior para las abejas se invirtió también para controlar los posibles efectos que resultan de otros "Zeitgeber" que la
luz (por ejemplo, las vibraciones del edificio durante el día el ruido del tráfico, etc.)
Para las abejas al aire libre, puntos de tiempo fueron elegidos con respecto a la salida del sol, es decir, la apariencia del sol sobre el
horizonte, como equivalente de luces encendidas. Salida del sol se fijó como ZT0 y el atardecer como ZT12, independientemente de
la duración del día actual, utilizando bases de datos públicas (GeneralAviation 2009 ; Thiele 2009 ) como fuente de tiempo correcto
para Konstanz, Alemania. Debido a los cambios fotoperíodo durante todo el año para que las abejas al aire libre, estos puntos de
tiempo tuvo que ser ajustada (Fig. 1c ), la formación es decir, los tiempos han sido definidos en relación al total de la longitud del
día. Para una visión general de los diferentes entrenamientos y pruebas veces respecto a los diferentes tratamientos y ZTS, véanse
los cuadros S1 y S2 .
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4. Debido a que la iluminación es un importante "Zeitgeber", las condiciones de luz durante los experimentos podrían influir en los
resultados. Por lo tanto, los capacita y evalúa tanto la luz (luz de día) y oscuridad (luz roja tenue) en todos los tiempos.
Las abejas en oscuridad constante
ritmo circadiano se ha mantenido sin un "Zeitgeber", tanto en luz constante (Frisch y Aschoff 1987 ), así como la oscuridad
constante (Moore y Rankin 1985 ) por algún tiempo. Para evaluar si nuestros resultados son de carácter circadiano real, seguimos
las abejas al aire libre en oscuridad constante y temperatura constante durante 2 días y los entrenó en el momento mismo número de
puntos como se describió anteriormente, utilizando el contexto experimentales. Las abejas fueron capturados frente a una colmena al
aire libre y se mantienen en un 30 × 30 cm × jaula de cría de insectos 30 (BUGDORM-1, MegaView Ciencias de la Educación
Services Co., Taiwán) dentro de una habitación a oscuras completamente iluminado por la luz roja tenue sólo durante la preparación
de las abejas. Las abejas fueron atrapados en las jaulas de cría, se enfría en hielo durante varios minutos hasta que dejó de moverse y
le enganchó 3 h antes del experimento. Después de aprovechamiento, las abejas se mantuvo en el cuarto oscuro hasta el inicio del
acondicionamiento.
Ajustamos la duración del experimento único al disminuir el intervalo entre ensayos a 5 min. El número de ensayos de
entrenamiento sigue siendo la misma y el tiempo de exposición de olores para cada abeja sigue siendo el mismo, pero el tiempo de
familiarización en la corriente de aire antes de la exposición a los olores y después de la exposición fue el olor disminuido. Las
abejas se probaron 30 minutos después del juicio último entrenamiento. Abejas fueron entrenados y probados tanto en la luz (luz de
día) y oscuridad (luz roja tenue) en todos los tiempos. Debido a que no existen diferencias relativas a los olores fueron encontrados
con anterioridad, solamente se utilizaron octanol como CS + para estos experimentos.
Alimentación
Para evaluar el impacto de la hora de comer en los resultados del aprendizaje, las abejas al aire libre fueron entrenados para dos
estaciones de alimentación al lado de las colmenas. Las estaciones de alimentación fueron odorised por una mezcla de 1-hexanol, 2-
octanol, linalol y limoneno (Sigma Aldrich, Merck, Darmstadt, Alemania) y eran accesibles a las abejas, ya sea en ZT3 o en
ZT9. Las abejas fueron capturados en los alimentadores 1 día antes del experimento y tratados como las otras abejas. Se
acondicionarán a ZT3 o ZT9 y sus diferenciales de aprendizaje Se calculó el índice.
Además, dos colmenas fueron trasladados en dos jaulas con un diámetro de 4 × 2 × 2,50 m, situado al aire libre. Estas abejas semi-al
aire libre estaban sujetos a la ritmicidad diurna normal y las condiciones climáticas normales. Dos dispositivos de alimentación se
colocaron delante de la colmena. Ellos eran accesibles, ya sea ZT3 (9:00 - 12:00) o ZT9 (16:00 - 19:00) durante 1 semana antes de
los experimentos y durante los experimentos. Las abejas fueron capturadas en estos dispositivos de alimentación, se enfría en hielo y
aprovechar un día antes del experimento y luego se sometieron condicionamiento diferencial como se describe anteriormente y en
ZT9 ZT3.
Meta-análisis de polen y néctar de datos
Se analizaron los datos proporcionados por diversos estudios (Kleber 1935 ; Percival 1947 , 1950 , Maurizio 1953 ; Pesti 1976 ;
Mačukanović Blaženčić y1998 ) con respecto a los patrones temporales de ambos y la secreción de néctar de polen. Debido a que
estos estudios utilizaron diferentes métodos, normalizamos los datos relativos al número de plantas secretan néctar o polen para cada
hora del día. Un documento que recoja, por ejemplo, "el polen de la planta X, entre 8 y 10" resultó en un conteo de especies de
plantas secretan el polen a las 8, 9 y 10. Las 86 plantas que se utilizan para calcular la secreción de polen son conocidas como
fuentes importantes de alimentos para las abejas, así como la mayoría de las 49 plantas que suministran información sobre la
secreción de néctar (ver tablas de recursos en línea S3 y S4 ).
Estadística
El porcentaje de PER registrados durante la adquisición se utilizó para trazar curvas de aprendizaje. Para analizar la variación del
rendimiento durante los ensayos, se utilizó análisis de varianza (ANOVA). Se ha demostrado que está permitido el uso de ANOVA
en datos dicotómicos cuando existen al menos 40 grados de libertad (Lunney 1970 ; Guerrieri et al. 2005 ). Estas condiciones fueron
recibidos por todos los experimentos. En su caso, pruebas t se utilizaron.Los análisis se realizaron con la "R" de software (R
Desarrollo del Equipo Central 2008 ; http://www.R-project.org ), Statistica 6.1 (StatSoft Europe GmbH, Hamburgo, Germany) y
JMP (SAS Institute GmbH, Heidelberg, Alemania ).
Resultados
En total, 1.155 miel de abeja formados a lo largo de seis ensayos en cuatro diferentes "puntos de tiempo" Zeitgeber con el fin de
evaluar sus resultados de aprendizaje en diferentes momentos del día. Del número total de 1.155 abejas, las abejas fueron 366 y 789
al aire libre eran abejas de interior. Además, capacitamos a 169 abejas como un control en la oscuridad constante (DD) y 352
entrenaron a las abejas con el fin de evaluar la influencia de la alimentación en el rendimiento escolar diurna.
Condicionamiento diferencial
Olor las adquisiciones del aprendizaje
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5. Durante el entrenamiento, se midió la curva de adquisición de aprendizaje. La figura 2a muestra una curva típica de adquisición
(curvas adicionales se dan en recurso en línea S5 ). La respuesta media PER inicial hacia los olores en el juicio una del 21%. En
todos los experimentos, algunos animales respondieron espontáneamente al olor en el primer juicio, que es normal para los
experimentos PER (Menzel 1990 ). Respuesta a las + CS aumentó considerablemente durante los ensayos siguientes. Las abejas
también respondió a la CS-durante los primeros ensayos (generalización olor). Las curvas de formación comenzó a divergir, durante
el curso de los experimentos, lo que indica que las abejas aprendieron a discriminar + CS y CS-. Las respuestas a la última prueba
para los símbolos + CS osciló entre 75% y 84% y para el CS-entre el 18% y 29% de los posibles 100%, respectivamente, no había
una diferencia significativa en este ensayo última adquisición entre el CS + y CS-en todos los grupos (mediciones repetidas de
análisis de varianza (ANOVA-RM), P <0,05; para la figura. 2 bis ,F 1, 96 = 170.5186, p <0,0001).
Prueba
Las abejas se probaron 30 minutos después del entrenamiento. Durante la fase de prueba, las respuestas a los + CS corresponde
aproximadamente con los del ensayo último entrenamiento. Las respuestas a la + CS osciló entre 78% y 83% y fueron siempre
superiores a los de la CS-, que oscilaron entre 19% y 32% (véase también el recurso en línea S6 ; para la figura. 2b , F 1, 96 =
155.6757, P <0,0001). La diferencia fue significativa en todos los grupos (RM-ANOVA,P <0,001). No hubo diferencias
significativas entre los olores utilizados como EC +, las respuestas hacia octanol, así como a hexanol eran iguales (ANOVA de un
factor, F 1, 1153 = 3,4005, P = 0,0654).
aprendizaje índice diferencial
Las respuestas hacia el + CS y el CS-medido durante la prueba se utilizaron para calcular un DLI (véase "Materiales y métodos")
con el fin de evaluar el desempeño de aprendizaje en diferentes condiciones. Figura 2c muestra las diferencias de aprendizaje índice
correspondiente a la figura. 2b . Superior DLI corresponden a una capacidad de discriminación más alto de las abejas de miel que es
nuestra definición de los resultados del aprendizaje.
Influencia de la "Zeitgeber" tiempo de los resultados del aprendizaje
Los resultados del aprendizaje, se mide con DLI variadas en diferentes momentos del día y la noche (Fig. 3 ). Una comparación de
DLI en las cuatro ZTS diferentes para las abejas, al aire libre (Fig. 3a ), las abejas de interior (Fig. 3b ) y las abejas mantenido en
oscuridad constante (Fig. 3c ) mostró que las abejas aprenden significativamente mejores que en todos los ZT3 ZTS otros todos los
grupos (con excepción para la comparación con ZT3 ZT21 en la figura. 3c ) (ANOVA de un factor, F 3, 1319 = 14.3624, P <0,0001;
post-hoc de Fisher de comparación, ZT3/ZT9 P <0,0001, P ZT3/ZT15 <0,0001, ZT3/ZT21, P = 0,0004; F abejas al aire libre 3, 362 =
5,4057, P = 0,0012; post-hoc de comparación de Fisher, P = 0,0145 ZT3/ZT9, ZT3/ZT15 P = 0,0001, P = 0,0045
ZT3/ZT21 ; F abejas interior 3, 785 = 6,3439, P = 0,0003; post-hoc de comparación de Fisher, P = 0,0226 ZT3/ZT9,
ZT3/ZT15 P <0,0001, P = 0,0151 ZT3/ZT21). No hubo diferencias significativas entre los tres tratamientos, demostrando que el
buen desempeño en ZT3 es un fenómeno robusto.
Fig. 3. Aprendizaje rendimiento es mejor en ZT3 que en todos los demás "tiempo" puntos Zeitgeber. Abejas uno al aire libre, la diferencia de
índices de aprendizaje (DLI) en cuatro diferentes "puntos de tiempo" Zeitgeber (ZTS). B abejas cubierta en día-noche ritmo artificial . c abejas al
aire libre que se mantuvieron en oscuridad constante durante 2 días antes de la formación. barras horizontal: barra blanca, la formación y las
pruebas durante el día; barra de negro, la formación y la detección durante la noche; barra gris, la formación y las pruebas durante el día
subjetivo. En todos los casos, DLI a los 30 minutos de entrenamiento se muestran. Las letras indican diferencia estadística (ver texto), los números
entre paréntesis indican los tamaños de muestra
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6. Nuestros experimentos fueron equilibrados con respecto al olor utilizados para CS + (dos grupos), es decir, tanto los olores fueron
utilizados como EC + y CS, respectivamente-, para excluir posibles preferencias olor innata y con respecto al régimen de
iluminación para el entrenamiento y las pruebas (es decir, cada experimento se llevó a cabo ya sea en la oscuridad o con luz). No
hubo interacción de DLI entre ZT y el olor utilizados como EC +, y el efecto del olor no fue significativa (de dos vías, ANOVA,
olor × ZT, M 3, 1147 = 1,778, P = 0,3170; olor solo, P = 0,1097; recurso en línea S7 b). Del mismo modo, no hubo interacción entre el
estado de iluminación y SD (en ambos sentidos-ANOVA, luz × TC, M 3, 1147 = 0,4218, P = 0,7374). Sin embargo, las pruebas en la
oscuridad o con luz tuvo una fuerte influencia en el rendimiento de la prueba: las abejas se desempeñaron mejor en la oscuridad
(ANOVA de un factor, F 1, 1153 = 16.4018, P <0,0001; de recursos en línea S7a ).
Las abejas en oscuridad constante
Cuando un ritmo circadiano es privado de su "Zeitgeber" (luz, ya que en la mayoría de los casos, el sol es el más importante
"Zeitgeber"), por lo general continuará por sí solo en un data ritmo libre, aunque la fase de cambio y se la amplitud del ritmo se
reducirá (Aschoff 1981 ). Para comprobar si la capacidad de aprendizaje mejor que hemos observado en ZT3 se basa en un ritmo
circadiano endógeno, que entrenaron a las abejas que se guardaban en DD. En las abejas oscuridad constante, DLI también fue
superior en la mañana (CT3) que en la tarde (CT9) (ANOVA de un factor, F 3, 165 = 9,5523, P <0,0001; post-hoc de comparación de
Fisher, P <0,0001). Por lo tanto, mejores resultados del aprendizaje en la mañana es realmente circadiano endógeno y controlada.
Influencia de la alimentación en tiempo de DLI
Aunque controlados de forma endógena, los resultados del aprendizaje durante el día podría verse aún más influenciada por la
experiencia de alimentación individual. Desde las primeras observaciones del ritmo circadiano en las abejas melíferas, se planteó la
hipótesis de que la actividad de forrajeo se sincroniza con la ritmicidad de flores, en particular, con fluctuaciones diurnas en la
disponibilidad de néctar y polen. Las abejas aprenden a asociar fácilmente un momento específico del día con una fuente de
alimento y sus parámetros restantes, tales como la ubicación, el olor y pantalla de visualización (Pahl et al. 2007 ; Prabhu y
Cheng 2008a ; Prabhu y Cheng 2008b ). Por otra parte, muchas flores en las zonas templadas secretan más néctar y el polen
temprano en el día (Kleber 1935, véase también la fig. 4 , el presente documento). Por lo tanto, mejores resultados del aprendizaje
en la mañana también puede estar vinculada a los alimentos llamados de anticipación de actividad así (Moore y Doherty 2009 ) que
refleja la experiencia individual de cada abeja como se ha demostrado que las abejas son más precisos para llegar a una hora
determinada y los alimentos fuente (Moore y Rankin 1983 ; Moore et al. 1989 ). Por lo tanto, prueba la influencia de la
disponibilidad de alimentos para la colmena en el comportamiento de aprendizaje de las abejas. las abejas al aire libre fueron
entrenados para alimentadores de agua azucarada cuyo atractivo para las abejas se reforzó con una mezcla de olor. A los pocos días,
las abejas se presentó en el lugar de alimentación cerca de un cuarto de hora más temprano, lo que confirma la previsión de
alimentos a menudo se describe el comportamiento (von Frisch 1965 ; Moore et al. 1989 ; Moore y Doherty 2009 ). Las abejas de
estos alimentadores se utilizaron en nuestro ensayo de la formación. Las abejas de las colmenas arrastrado a la alimentación en ZT3
aprendido significativamente mejores que en ZT3 ZT9 (F 1, 86 = 4,7953, P = 0,0312; fig. 4a ). Sin embargo, también las abejas de las
colmenas arrastrado a la alimentación en ZT9 tuvieron mayor DLI en ZT3 que en ZT9 (F 1, 84 = 29.9065, P <0,0001; fig. 4a ). Un
ANOVA de un factor de arrastre dos mostraron que los alimentos de la colmena no tuvo ninguna influencia en los valores DLI (F 1,
170 = 0,2212, P = 0,6388), mientras que la diferencia entre ZT3 y ZT9 fue significativa (F 1, 170 = 26.4638, P < 0,0001). Cabe
señalar, sin embargo, que hubo alguna interacción entre ZT y el tiempo de alimentación (ZT tiempo de alimentación ×, F 1, 170 =
5,2292, P = 0,0234).
Fig. 4. Mejor rendimiento en el aprendizaje ZT3 se mantiene independientemente de la hora de comer. Un tiempo de alimentación no influye en la
capacidad de aprendizaje de las abejas melíferas. El aprendizaje en el rendimiento "Zeitgeber" tiempo (ZT) 3 es significativamente mayor que en
ZT9 tanto para alimentadores temprana (las abejas tuvieron acceso a la alimentación en ZT3), así como alimentadores tarde (las abejas tuvieron
acceso a la alimentación en ZT9) en ambos tratamientos (gratuito ( n = 174) and caged ( n = 178) bees). Asterisks indicate significant difference
6

7. (see text). b Plants exhibit strong daily variation in nectar secretion and pollen production. The majority of nectar- and pollen-secreting plants
blossom during the morning and early afternoon (meta-analysis based on data from Kleber ( 1935 ), Percival ( 1947 , 1950 ), Maurizio ( 1953 ),
Pesti ( 1976 ) and Mačukanović & Blaženčić ( 1998 ); pollen: n plants =85, nectar: n plants =44)
Aunque hubo poco néctar que secretan las plantas en flor durante la duración de estos experimentos específicos (mes de agosto en el
sur de Alemania), no puede excluirse que los alimentos de otras fuentes podría haber sido utilizada por las abejas y que estos
podrían haber influido en las abejas experiencias. Por lo tanto, se repitieron los experimentos con las abejas parcialmente al aire
libre. Aquí, las colmenas fueron mantenidos en jaulas al aire libre para que experimentaron el mismo entorno que las abejas al aire
libre, con la excepción de las fuentes de alimentos disponibles que fueron controlados en su totalidad en el experimento. Mediante la
utilización de diferentes tiempos de funcionamiento en paralelo, que redujo aún más la influencia de otros parámetros de nuestro
experimento. Las abejas aprendido a anticipar la alimentación y llegó temprano en el lugar de alimentación a los pocos días de
alimentación regular. Además, se observó que la actividad de vuelo en las jaulas fue mayor antes, durante y después de la hora de
comer, pero menos durante el resto del día. Esto sucedió independientemente de otros factores como la temperatura o la lluvia. Estas
observaciones son también consistentes con estudios previos (von Frisch 1940 ; Moore et al. 1989 ). El DLI fue mayor a ZT3 que en
ZT9 tanto para las abejas, arrastrado a la alimentación en ZT3 (F 1, 86 = 14.3953, P = 0,0003) y para las abejas, arrastrado a la
alimentación en ZT9 (F 1, 88 = 5,6200, P = 0,0199; la figura . 4a ). Un ANOVA de un factor dos mostraron un efecto significativo
en magnitud entre las pruebas en DLI ZT3 y en los valores ZT9 (F 1, 174 = 18.6050, P <0,0001), pero no para tiempos de arrastre de
la alimentación (F 1, 174 = 0,9990, P = 0.3189) y no hay interacción significativa entre los dos factores (F 1, 174 = 0,7038, P <0.4072).
Discusión
Las abejas aprenden mejor en la mañana
En este estudio, hemos investigado la influencia de los ritmos circadianos en los resultados del aprendizaje olfativo de las abejas de
miel y demostrar que las abejas aprenden mejor en la mañana.
Estudios previos han demostrado que el ritmo circadiano tiene una fuerte influencia en diversos aspectos de la vida de las abejas de
miel. Por ejemplo, utilizan una vez compensada dom brújula para navegar hacia atrás y adelante de la (sección von Frisch 1950 ;
Lindauer 1960 ; von Frisch 1965 ) lo que se consigue por una combinación de conocimiento innato y una actualización adecuada en
función de la situación (Dyer y Dickinson 1994 ; Towne 2008 ; Towne y Moscrip 2008 ), y su comportamiento locomotor es
impulsado por un reloj circadiano (Moore y Rankin 1985 ; Moore 2001 ). Estos resultados muestran una clara variación diurna en la
actividad abejas productoras de miel. La fase de alimentación de las abejas de miel se limita a la luz del día como su pequeña y
relativamente insensibles aposición ojos compuestos no permiten para escarbar en la noche (Rose y Menzel 1981 ; obtención et
al. 1996 ). Además, las abejas del sueño en su fase inactiva, especialmente en la noche (Kaiser 1988 ). Por lo tanto, no es de extrañar
que el aprendizaje y la memoria en las abejas de miel es mejor durante la fase activa, como lo es en otras especies, por ejemplo, las
cucarachas (Decker et al. 2007 ), A. californica y A. fasciata (Lyons et al. 2005), ratones (Chaudhury y Colwell 2002 ) y humanos
(Kleitman 1933 ; Folkard 1975 ; Folkard y Monk 1980 ).
Además, nos encontramos con que, durante el día, las abejas aprenden mejor en la mañana en comparación con la tarde. Este efecto
está claramente relacionado con el ritmo circadiano. Nuestros experimentos, sin embargo, no fueron diseñados para evaluar el
origen mecanicista del efecto. Por lo tanto, un efecto de la fatiga, de dormir ciclo, o de una relación directa con el reloj endógeno es
posible, sin ser mutuamente excluyentes. Por ejemplo, la privación del sueño también afecta la memoria, aunque su efecto es
complejo, con diferencias entre la adquisición y retención (Hussaini et al. 2009 ). La función de un ritmo endógeno se evidencia en
nuestro hallazgo de que las abejas mantienen en oscuridad constante también aprenden mejor por la mañana. Además, estas abejas
no mostró diferencias estadísticamente significativas entre CT3 (mañana) y CT21 (antes del amanecer, fig. 3c ), lo que sugiere un
tiempo de ciclo de menos de 24 h. Estudios previos mostraron que el día intrínseca de las abejas es más corta de las 24 h, tanto para
alimentarse ritmos (Bennett y Renner 1963 , Beier1968 ) y para el comportamiento del aparato locomotor (Moore y
Rankin 1985 ). Otros experimentos con períodos más largos de oscuridad, una mejor resolución temporal y manipulaciones
moleculares son necesarios para investigar el origen mecanicista de por qué el aprendizaje es mejor por la mañana.
Las abejas aprenden mejor en la oscuridad
Adicionalmente a nuestros datos sobre la influencia de la sincronización circadiana en la abeja de la miel discriminación olfativa de
aprendizaje, nos muestran que el contexto experimental también es importante: las abejas aprender a discriminar dos olores
notablemente mejor en la oscuridad que con luz.Posiblemente, es sólo el efecto de la reducción de distraer a los estímulos
ópticos. Como alternativa, o adicionalmente, esto podría proceder de la abeja la biología de miel: la mayoría de abeja la vida de una
se lleva a cabo dentro de la colmena oscura donde los olores son una fuente principal de información, incluida la comunicación
entre los trabajadores y de cría (Pankiw et al. 1998 ; Pankiw 2004 ; Sagili Pankiw y 2009 ), así como la reina y los trabajadores
(Winston y Slessor 1992 ; Hoover et al. 2003 ; Pankiw et al. 2004 ). Además, los olores son utilizados por los cazadores-
recolectores homing para hacer publicidad de alimentos fuentes de rentabilidad (Farina et al. 2005 ; Arenas et al. 2007 ; Farina et
al. 2007 ). Por lo tanto, la capacidad de aprendizaje mejor para señales olfativas en la oscuridad (con independencia de la hora del
día) podría ser una adaptación a la vida dentro de la colmena. Más y experimentos dedicados son necesarias para abordar esta
cuestión, en particular, dado que la influencia de las condiciones de luz hacia el aprendizaje se ha analizado en varias especies de
insectos, pero van desde la mejora (Yarali et al. 2008 ) o ningún cambio (Matsumoto y Mizunami 2004 ; Sato et al. 2007 ) a la
reducción de los resultados del aprendizaje (este documento), lo que sugiere un rasgo específico de especie.
Adaptable y ecológica
Ha habido una larga discusión desde los experimentos hechos por Wahl en la década de 1930 (Wahl 1932 ; Wahl 1933 ) en cuanto a
si existe un cierto ritmo circadiano en las abejas de miel o si las abejas "sólo" aprender la hora del día cuando el alimento está
7

8. disponible . La existencia de un reloj endógeno se muestra a continuación, varias décadas después, no sólo por la identificación de
los genes respectivos (Toma et al. 2000 ), sino también por los experimentos de comportamiento que muestran su control sobre la
locomoción, el tiempo de detección o las conductas alimentarias de anticipación (para una revisión , ver Moore 2001 ). Se confirmó
que las abejas pueden ser entrenados para visitar un alimentador en un momento determinado del día. Sin embargo, también
muestran que esta formación no tiene impacto en la variación circadiana en los resultados del aprendizaje: el aprendizaje sigue
siendo el mejor en la mañana.
Esto también coincide con un mayor nivel de precisión de forrajeo de las abejas entrenadas para una fuente de alimento por la
mañana en comparación con las abejas entrenadas para una fuente de alimento por la tarde (Moore et al. 1989 ). Por lo tanto,
nuestros resultados no se puede explicar por una adaptación del comportamiento inmediato. De hecho, la tendencia a las conductas
alimentarias de anticipación podría ser una de las fuerzas motrices de evolución en la interacción entre las flores y las abejas.
Proponemos que la ventaja es energético, bajo el supuesto de que el aprendizaje de alto rendimiento es energéticamente costoso
(Mery y Kawecki 2003 ). En este punto de vista, la necesidad de aprender nuevos olores se reduciría por la tarde porque hay menos
plantas de flores en ese momento. Se mostró por Kleber (Kleber 1935 ) que la mayoría de las flores que ella investigó flor y el
néctar y el polen secreta durante la mañana, una observación que fue confirmado en repetidas ocasiones (Jaxtheimer 1949 ;
Maurizio 1953 ; Pesti 1976 ; Mačukanović Blaženčić y 1998 ). Esto también es válido para la secreción de sacarosa pulgón, la
llamada miel de rocío es así, que es una fuente importante de alimento para las abejas (Gleim 1984 ). Por lo tanto, la hipótesis de
que el mayor rendimiento de aprendizaje ha evolucionado con el néctar de la planta y la secreción de polen.
Pero ¿cuál es la fuerza evolutiva que empuja a esta co-evolución de las horas de la mañana en lugar de cualquier otro momento del
día? Las abejas arrastrado a los tiempos de alimentos en este estudio mostraron el mismo comportamiento descrito en otra parte
(Forel 1910 , Moore et al. 1989 ; Moore y Doherty2009 ): ya estaban esperando en su lugar de alimentación antes de la hora de
comer arrastrado. Por lo tanto, especulan que podría ser evolutivamente ventajoso para ser los primeros de abeja "y para" atrapar "la
flor con el fin de outcompete posibles competidores, como mariposas, moscas y sus congéneres de otras colmenas. Por lo tanto, las
abejas y las flores pueden haber evolucionado la carrera de armamentos por los tiempos pasados de días, limitado por la madrugada
en un lado y por la productividad, por otro. Esta tendencia podría ser reforzado por otros factores, por ejemplo, que las abejas
obtienen mejores resultados después de descansar (Hussaini et al. 2009 ) o que la producción de néctar que podría acumularse
durante la noche (Kleber 1935 ), los factores que podrían actuar como preadaptación en términos evolutivos.
Si esta hipótesis era cierta, sería de esperar los resultados del aprendizaje para aumentar la ya antes del amanecer. De hecho, todos
nuestros datos muestran que "los resultados del aprendizaje abejas de miel llega a su punto más bajo entre ZT15 y ZT21 y que la
capacidad de aprendizaje aumenta de nuevo después.En su viaje de forrajeo en primer lugar, las abejas tienen que aprender la fuente
de alimento más rentable para ese día que se pueden cosechar después. El temporal óptima de las instalaciones «néctar y polen de la
producción y el cambio a principios de llegada por resultado la presión competitiva en un nicho ecológico común.
A. mellifera apareció cerca de 1 millones de años y colonizó su día actual gama con un número de subespecies cerca de 50.000 a
100.000 años atrás (Ruttner2003 ). Durante el glaciar últimas etapas de nuestra época de las glaciaciones, las plantas y las abejas
tuvieron que retirarse en varias ocasiones hacia las regiones con un clima más cálido o zonas insulares con condiciones de
supervivencia mejor (Ellenberg 1996 , Schroeder 1998 ; Ruttner 2003 ). Este período de tiempo debe ser suficiente para desarrollar
una planta apretado - xinsect relación. Si esta co-evolución entre las plantas y las abejas de miel de néctar favorece la mañana y la
secreción de polen, ¿por qué no todas las plantas presentan el mismo ritmo diurno? No todas las flores son polinizadas por las abejas
de miel: por ejemplo, especies de Silene. Saponaria officinalis y ambos muestran un pico en la secreción de néctar en la noche y son
polinizadas por mariposas nocturnas y polillas halcón (Baker 1961 ; Witt et al. 1999 ; Wolff et al. 2006 ). Las polillas tienen una
memoria muy buena apetitiva (Daly et al. 2001) y pueden aprender los olores. Si nuestra hipótesis es correcta y polillas aprenden a
asociar olores florales con flores gratificante, se podría predecir que exhiben sus mejores resultados del aprendizaje durante la noche
temprana. Una polilla posible candidato para Europa Central sería gamma Autographa(Esche 1996 ). Si nuestra hipótesis es
correcta, especializada insectos - las relaciones entre plantas no estaría bajo la presión evolutiva para horas de la mañana. Estos
incluyen la relación altamente específicas entre las orquídeas engañosas sexual del género Ophrys y sus polinizadores
(Kullenberg 1961 ; Borg-Karlson 1990 ; Schiestl et al. 1999 ). Se necesita más investigación para estudiar estas interacciones.
Nuestros hallazgos demuestran que las abejas aprenden mejor por la mañana temprano y proponer un modelo evolutivo que
explique este hallazgo. Nuestros resultados también proporcionan un aspecto importante a considerar en el diseño de futuros
experimentos de aprendizaje: las fluctuaciones circadianas necesidad de tener en cuenta.
Agradecimientos Agradecemos a Guillermo Schönherr y Seier Isabel para obtener ayuda con los experimentos, Wolfram Kutsch
para los debates útiles y comentarios útiles y dos evaluadores anónimos por sus útiles sugerencias. Este estudio fue financiado por la
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) y la Universidad de Konstanz. Los donantes no participó en el diseño del estudio,
recopilación de datos y el análisis, la decisión de publicar, o de la preparación del manuscrito. Los experimentos de cumplir con las
leyes actuales de Alemania.
Los conflictos de interés
Los autores declaran que no tienen conflictos de interés.
Acceso Abierto
Este artículo se distribuye bajo los términos de la Licencia Creative Commons Reconocimiento No comercial que permite que
cualquier uso no comercial, distribución y reproducción por cualquier medio, siempre que el autor original (s) y la fuente se
acreditan.
Electrónica material complementario
A continuación se muestra el vínculo con el material complementario electrónica.
8

9. S1 Training and testing times for indoor bees (DOC 34 kb)
S2 Training and testing times for outdoor bees (DOC 34 kb)
S3 List of plants producing nectar and the corresponding study (nomenclature adapted according to Schmeil et
al. 2009) (DOC 69 kb)
S4 List of plants producing pollen and the corresponding study (nomenclature adapted according to Schmeil et al. 2009)
(DOC 99 kb)
S5 Learning performance of CS− but not CS+ is affected by “Zeitgeber” time. Response (proboscis extension reflex) to
conditioned stimulus (CS) + is mostly equally high whereas response to CS− changes from low in the morning to high in
the afternoon. Outdoor bees: n ZT3 =98, n ZT9 = 85, n ZT15 = 95, n ZT21 = 88. Indoor bees: nZT3 = 215, n ZT9 = 201, n ZT15 =
206, n ZT21 =167. Bees in constant darkness: n CT3 =47, n CT9 = 40, n CT15 = 41, n CT21 = 41 (DOC 365 kb)
S6 Both CS+ and CS− contribute to the diurnal variation observed by use of the DLI. Outdoor bees: n ZT3 =98, n ZT9 =
85, n ZT15 = 95, n ZT21 = 88. Indoor bees: n ZT3 =215, n ZT9 =201, n ZT15 = 206, n ZT21 =167. Bees in constant darkness: n CT3 =
47, n CT9 =40, n CT15 =41, n CT21 =41. CS, conditioned stimulus; CT, circadian time; DLI, differential learning index; PER,
proboscis extension reflex; ZT, “Zeitgeber” time (DOC 132 kb)
S7 Light conditions and odour type do not interact with variation in learning performance: (a) Bees perform better in
darkness than in light. There is a significant difference between bees trained in light (light grey) and bees trained in
darkness (dark grey) (ANOVA, P <0.001). Bees trained in darkness show a higher differential learning index compared
to bees trained in light. No interaction was found between light condition and “Zeitgeber” time (ZT) (two-way ANOVA, P
>0.05). (b) Odour type has no influence on learning behaviour. No significant difference can be found between the two
CS+ for the retention test after 30 min (ANOVA, P >0.05). There is no interaction between odour type and ZT (two-way
ANOVA, P > 0.05) (DOC 168 kb)
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Ricardo Carrera
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