El documento resume los principales aspectos de la replicación del ADN. La replicación es llevada a cabo por enzimas ADN polimerasas que copian fielmente la hebra molde de ADN. Estas enzimas requieren proteínas accesorias y el proceso es semiconservativo, copiando una hebra molde original y una nueva hebra complementaria. La replicación ocurre de forma simultánea en ambas hebras a través de la acción coordinada de enzimas y proteínas asociadas.

1. Replicacíón del DNA

2. Egipcio jeroglífico
Egipcio demótico
Idioma griego
proteína
ARN
ADN

3. Replicación del ADN
 El ADN es copiado fielmente a partir
de la hebra molde
 El proceso es llevado a cabo por las
enzimas ADN polimerasas
 Se necesitan proteínas accesorias que
permiten que la ADN polimerasa actúe
 Es un proceso semiconservativo

4. Experimento de
Meselson y Stahl
(1958)

5. Isótopos del nitrógeno

6. Las ADN polimerasas
 Catalizan la formación del enlace fosfodiéster
 Usan como sustrato
 El extremo 3’-OH del nucleótido final de una hebra de ADN o ARN
(cebador/partidor/primer)
 Los 4 desoxinucleótidos trifosfatados (dATP, dCTP, dGTP y dTTP)
 Una hebra molde para copiar
 Mg2+

8. La ADN polimerasa ensamblará una nueva hebra de ADN directamente sobre la hebra molde
La enzima reconoce al cebador (el extremo 3’-OH libre) y realizará la unión fosfodiéster con
el desoxinucleótido entrante
Muchas ADN polimerasas tienen actividad correctora (exonucleasa) y reconocen cuando ha
ingresado un nucleótido no complementario y lo remueven.

10. Algunos fármacos antifúngicos son análogos de bases nitrogenadas que
detienen el proceso de replicación eucarionte

11. La replicación es simultánea en ambas hebras
 Esto fue demostrada con el experimento de John Cairns en 1963 para lo cual
se cultivó E. coli con timidina tritiada (3H) por largo tiempo y luego el
cromosoma circular fue visualizado por autoradiografía. Se observó que al
comienzo se forma un ojo replicativo con una estructura tipo theta marcada
radiactivamente lo que indica que ambas hebras hijas están siendo copiadas
simultáneamente.
Imagen por auto-
radiografía (hebra
radiactiva en rojo)
Imagen al
microscopio
electrónico

12. Isótopos del hidrógeno
El protón (H) es la especie más abundante
El deuterio (D) es una especie pesada del hidrógeno no radiactiva
El tritio (T) es una especie pesada del hidrógeno que emite radiación beta

13. El origen de replicación
 En procariontes, el ADN es circular y posee un único sitio de inicio de la
replicación, se denomina Origen de replicación (locus OriC)

14. En el sitio Ori se ensamblan un hexámero de
proteínas DnaA que marcan los sitios cercanos
a las repeticiones de AT
Los sitios ricos en AT son abiertos por las
helicasas (DnaB)
Las hebras simples de DNA son protegidas por
las chaperonas Single Strand Binding proteins
(SSB)

15. Para copiar el DNA se necesita separar la
doble hebra
 El inicio de la replicación del ADN necesita que la doble hebra se separe
 Esto lo realizan las enzimas llamadas Helicasa
 Requieren gastar ATP para romper los puentes de hidrógeno entre las bases
apareadas
 Se forma una horquilla de replicación

16. Una hebra crece de forma continua, se denomina hebra líder
La otra hebra crece de forma discontinua, es mas lenta su
síntesis y se denomina hebra retrasada

17. El síndrome de Werner es un
envejecimiento prematuro debido a
deficiencias en la actividad helicasa,
empieza en la adolescencia

18. Una hebra es continua y la otra es
discontinua
 El proceso de síntesis de ADN avanza en una dirección de la horquilla
 La cadena molde sobre la que se sintetiza a partir del cebador anteriormente
mencionado se llama hebra líder y se sintetiza de forma continua
 La cadena complementaria queda en sentido 3’->5’ se llama hebra retrasada
 En la hebra retrasada se sintetizan varios cebadores sucesivamente en forma
distanciada y la ADN polimerasa sintetiza ADN entre esos cebadores, formando
fragmentos cortos de ADN, los llamados fragmentos de Okazaki

22. Formación de un cebador
 Debido a que la DNA polimerasa necesita reconocer un extremo 3’-OH libre es
necesario sintetizar una estructura provisoria con esta característica
 El cebador es una pequeña cadena de ARN (de 10 nucleótidos) que posee un
extremo 3’-OH libre
 La formación de un cebador (partidor o primer) lo realiza la enzima primasa
dentro de un complejo llamado primosoma formado por varias proteínas
 El cebador es posteriormente removido una enzima correctora

23. El cebador o partidor es reconocido por la DNA polimerasa para sintetizar DNA

24. DNA polimerasas de bacteria
 La DNA polimerasa I se encarga de: remover el cebador de RNA con su
actividad correctora exonucleasa “marcha adelante” (5’3’), y sintetizar el
ADN en el espacio que dejó el cebador
 La DNApol II sintetiza la hebra retrasada
 La DNApol III sintetiza la hebra líder, es la más procesiva y rápida

25. Procesividad de la síntesis de ADN
 Las ADN polimerasas necesitan sintetizar sin parar las largas hebras de
millones de nucleótidos
 La característica de procesividad indica cuántos nucleótidos son incorporados
a la hebra naciente sin que la ADN polimerasa “se desprenda”
 Esta característica es mayor en la ADN polimerasa III de procariontes que
tiene una subunidad llamada sliding DNA clamp (β clamp) , que es un anillo
de sujeción a la hebra molde

26. La actividad correctora
 Cuando ingresa un nucleótido que no corresponde al sitio activo de la ADN
polimerasa y se enlaza a la cadena naciente ocurre un impedimento estérico
 Este impedimento cambia la conformación tridimensional de la cadena
naciente y queda “sobresaliendo”
 El extremo sobresaliente queda expuesto hacia el dominio exonucleasa
 La actividad exonucleasa corta en enlace del nucleótido mal ingresado

27.  El bajo porcentaje de errores en la copia del ADN se debe a que el bolsillo activo de la enzima va cambiando de
forma de acuerdo con el nucleótido que debe ingresar a continuación, el nucleótido en la hebra molde indica el
grado de apertura del sitio de ingreso del nuevo nucleótido, este fenómeno se llama ajuste inducido

28. A veces, el dominio
exonucleasa remueve uno
o dos nucleótidos contiguos
al que ingresó mal
Esta es una actividad
correctora “marcha atrás”
(3’5’)

29. Luego de que la DNApol I
remueve los cebadores,
la enzima ADN ligasa establece
los enlaces fosfodiéster entre
los fragmentos de Okazaki
vecinos, produciendo una
hebra continua a partir de la
discontinuidad de los
fragmentos
Esta enzima consume ATP
DNA ligasa

30. Holoenzima ADN
polimerasa
 Es un gran complejo
multiproteico que consta de:
 La helicasa
 Un clamp loading complex
 2 enzimas ADN polimerasa
 Esta holoenzima permite la
síntesis de la hebra líder y la
hebra retrasada en forma
simultánea

31. SSB (single strand binding proteins)
son proteínas chaperonas

33. Las enzimas topoisomerasas
 El proceso de abrir una zona de la doble hebra produce sobreenrollamiento en
el resto de la cadena de ADN
 Se necesita librar esta tensión mecánica para evitar la ruptura del ADN
 Las enzimas Topoisomerasas son capaces de cortar una o ambas hebras y
liberar la tensión de enrollamiento, las más famosas son las de tipo I y II

34. TOPO I
TOPO II

35. TOPO III resuelve enrollamientos terminales en
la replicación del DNA circular de procariontes

36. TOPO IV resuelve “plectonemas” producto de la replicación del DNA circular de procariontes

37. Las topoisomerasas de bacteria,
también llamadas DNA girasas,
pueden ser blanco de moléculas
como el ciprofloxacino y al ácido
nalidíxico.
Estos antibióticos han resultado
muy eficientes para combatir
infecciones bacterianas.

38. Replicación del ADN en eucariontes
 El proceso es más complejo que en procariontes
 Las bacterias poseen un solo cromosoma circular de 4,6 millones de pares de
bases
 El humano posee 46 cromosomas lineales, un total de 6.000 millones pb
 En bacteria existe un solo origen de replicación
 En eucariontes existen múltiples orígenes dentro de cada cromosoma, que
parten a distinto tiempo (en humanos hay cerca de 30.000 orígenes de
replicación)
 Proteínas llamadas licensing factors permiten que cada origen comience solo
una vez para evitar múltiples copias de la misma zona del cromosoma,
cuando la holoenzima se monta y comienza el proceso, los licensing factors
son destruidos

39. Los cinco tipos de DNApol de eucariontes
La afidicolina es capaz de inhibir las DNApol de tipo α, δ y ε
Detiene el ciclo celular en la fase S
PM (kDa)
300
40
300
200
250

40. Polimerasas en eucariontes
 La replicación en eucariontes comienza con la síntesis del cebador de la hebra
líder por la Polimerasa α, esta polimerasa luego cambia de lugar y se asocia a
la helicasa para sintetizar cebadores en la hebra retrasada
 Luego entra la Polimerasa δ, se encarga de sintetizar los fragmentos de
Okazaki
 La Polimerasa ε, que es muy procesiva, se encarga de sintetizar la hebra líder
 Este fenómeno se llama polymerase switching

41. RPA son proteínas chaperonas

42. Modelo del core enzimático de replicación de DNA en eucariontes
El complejo RFC (Replication Factor C) compuesto por 5 subunidades permite el anclaje de PCNA al DNA.
El complejo GINS (proteínas “Go-Ichi-Ni-San” 5-1-2-3) es indispensable para la iniciación y elongación
durante la replicación.
Las proteínas SSB en eucariontes también se conocen como RPA.
El complejo MCM (MiniChromosome Manteinance) posee 6 proteínas y actúa como helicasa.
La proteina Fen1 (Flap endonuclease 1) remueve los extremos colgantes (“flap”) de los Okazaki

43. Telómeros
 Los cromosomas lineales de los eucariontes tienen extremos libres
 Estos extremos se denominan telómeros
 Posee secuencias abundantes en Guanosina
 La ADN polimerasa es incapaz de sintetizar la hebra retrasada en los
telómeros, por esto es que tras cada ronda de replicación los telomeros se
van a cortando más y más

45. Para evitar que los telómeros se acorten demasiado y afecten al ADN codificante,
una de las hebras es más larga que la otra (repeticiones AGGGTT) y puede formar
una estructura en forma de loop que lo protege de la degradación por nucleasas

46. Enzima Telomerasa
 Esta enzima se encarga exclusivamente de replicar los telómeros y ayudar a
extender la hebra retrasada
 Usa como molde una secuencia de RNA rica en C y A
 En humanos su actividad es casi inexistente, por eso llega un punto en que los
órganos y tejidos ya no se pueden regenerar ya que los telómeros se
acortaron demasiado para conducir a la proliferación celular
 En células cancerosas la telomerasa está altamente activa