La replicación del ADN es el proceso por el cual el material genético se duplica antes de la división celular. Es semiconservativa, bidireccional y semidiscontinua. En procariotas involucra maquinaria enzimática como ADN polimerasas, helicasas y ligasas. En eucariotas es más complejo con múltiples orígenes de replicación. La replicación in vitro mediante PCR permite amplificar fragmentos de ADN y tiene numerosas aplicaciones.

1. Replicación del ADNReplicación del ADN

2. La división celular requiere de la duplicación
del material genético
mitosis
mitosis
meiosis

3. Mecanismo generalMecanismo general
La misma estructura del
ADN sugirió un mecanismo
de replicación de la
información
◦ Cada hebra sirve como molde
para replicar la complementaria

4. PropiedadesPropiedades

5. Semiconservativa: cada nueva molécula esta
formada por una hebra parental y una recién
sintetizada
◦ Experimentos de Meselson y Stahl

6.  Bidireccional: Se da hacia ambos lados del sitio de inicio
denominado origen de replicación
 A cada lado de la burbuja de replicación se forma una
horquilla de replicación

7. Dirección de la síntesis: 5’ 3’

8. Semidiscontinua: Una de las hebras no puede ser
sintetizada de continuo
◦ Consecuencia de la direccionalidad

9. Replicación en procariotasReplicación en procariotas

10. MecanismoMecanismo
 Inicio
◦ Reconocimiento de orígenes de replicación.
◦ Separación de hebras.
◦ Posicionamiento de maquinaria transcripcional.
 Elongación
◦ Crecimiento bidireccional de las horquillas de replicación.
◦ Replicación semiconservativa, semidiscontinua, coordinada.
 Terminación
◦ Reconocimiento de señales de terminación.
◦ Desensamble de replisomas.

11. ADN polimerasas:
◦ Pol I
◦ Pol II
◦ Pol III (replicasa)
◦ Pol IV y V
Necesitan 3’ OH libre

13. Maquinaria enzimáticaMaquinaria enzimática
ADN polimerasas: Síntesis de ADN
Primasas: Generación 3’OH libres
Ligasas: Unión los fragmentos de Okazaki
Helicasas: Separación de hebras
Topoisomerasas: Mantenimiento del
grado de superenrollamiento
SSBs: Mantenimiento de simples hebras

14. InicioInicio
Reconocimiento del
origen y apertura de las
hebras

15. ElongaciónElongación
Primasa:
◦ Sintetiza fragmentos de
ARN (cebadores) que
provean los 3’ OH libres
◦ Puede comenzar sin
necesidad de cebador

16. ReplisomaReplisoma

17. TerminaciónTerminación

20. Replicación en eucariotasReplicación en eucariotas

21. Los mecanismos son similares
Más de un origen de replicación por cromosoma
Es más complejo
Proteins Functions
RPA
PCNA
RFC
Pol α/primase
Pol δ / ε
FENI
DNA2
DNA ligase I
Mcm2-7
Single-stranded DNA binding; stimulates DNA polymerases;
facilitates helicase loading
Stimulates DNA polymerases and RFC ATPase
DNA-dependent ATPase; primer-template DNA binding;
stimulates DNA polymerases; PCNA loading
RNA-DNA primer synthesis
DNA polymerase; 3'-5' exonuclease
Nuclease for removal of DNA/RNA primers
Nuclease for removal of DNA/RNA primers
Ligation of DNA
DNA helicase; primosome assembly, licensing factor

22. ADN polimerasasADN polimerasas

23. Ocurre durante la fase S
Una única vez por ciclo celular

24. Horquilla eucariotaHorquilla eucariota

25. TelómerosTelómeros
Son secuencias repetidas que
se encuentran en los
extremos de los
cromosomas lineales
Entre otras funciones
resuelven los problemas de
replicar este tipo de
cromosomas

26. TelomerasaTelomerasa
Enzima capaz de resolver
el problema de
acortamiento de los
extremos
Ribonucleoproteína

29. Mantenimiento de la informaciónMantenimiento de la información
hereditariahereditaria
Errores durante la replicación:
◦ Las ADN polimerasas no son 100% fieles
◦ Los errores son reparados en un alto
porcentaje de las veces
◦ Cuando los errores escapan los mecanismos
de reparación ocurren cambios en la
secuencia del ADN: Mutaciones
Las mutaciones también pueden ocurrir
por fenómenos post replicación
(mutágenos físicos, químicos, etc.)

30. Mecanismos de reparaciónMecanismos de reparación
Las propias replicasas son capaces de reparar
sus errores durante la elongación:
◦ actividad correctora de prueba (proofreading)
◦ Implica una actividad exonucleasa 3’ 5’

31. Mecanismos de reparaciónMecanismos de reparación

32. Replicación de ADNReplicación de ADN in-vitroin-vitro: PCR: PCR
 Permite la amplificación de un fragmento de ADN de interés
 Algunas aplicaciones:
◦ Clonado acelular de moléculas de ADN
◦ Detección de secuencias sin purificación previa
◦ Análisis de expresión génica
◦ Secuenciación de ácidos nucleicos
◦ Amplificación de ADN para su posterior clonación celular
◦ Aplicaciones en medicina:
 Diagnostico de enfermedades hereditarias/infecciosas
 Diagnóstico parental (amniocentesis, vellosidades coriónicas)
 Tipado de tejidos para transplantes
 Detección de células tumorales
 Estudios de asociación genotipo-fenotipo
◦ Técnicas forenses: huellas genéticas (Identificación de polimorfismos)
 Identificación individual
 Tests de paternidad
◦ Filogenia
◦ Análisis de genética poblacional

33. Reacción de replicaciónReacción de replicación in-vitro:in-vitro:
Molde
ADN polimerasa: Taq polimerasa (termoestable)
Cebadores:
◦ 3’ OH libre
◦ Definen la región a amplificar
dNTPs (A, C, G, T)
Condiciones para el funcionamiento de la enzima:
◦ Buffer
◦ Mg++ (cofactor de la enzima)

34. ProcedimientoProcedimiento
Desnaturalización del
ADN (94ºC)
Agregado e
hibridación de los
cebadores (50ºC-
65ºC dependiendo de
los cebadores)
Elongación (72ºC)
Repetición de estas
etapas (25-35 ciclos)

35. Luego de terminados los ciclos se obtienen
millones de moléculas de la región blanco
La hace una técnica extremadamente sensible
◦ Ventaja: se puede amplificar ADN partiendo de
muy poco material
◦ Desventaja: Contaminaciones

37. Variantes del métodoVariantes del método
rt- PCR:
◦ Se usa una transcriptasa reversa para pasar
una muestra de ARN a ADN obteniendose
ADN copia (ADNc)
◦ Se realiza un PCR para amplificar el ADNc de
interés
◦ Estudios de expresión génica
◦ Clonado de genes eucariotas (eliminación de
intrones)

38. PCR cuantitativo (real time PCR, qPCR):
◦ Se diferencia en que en cada ciclo de amplificación
se cuantifica la cantidad de ADN obtenida
◦ Permite inferir la cantidad de moléculas de molde
que existía originalmente en la muestra:
 Cuantificación de la expresión génica
 Cuantificación de microorganismos

39. Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN
Método de Sanger (nobel en 1980)
Utiliza dideoxinucleotidos (ddNTPs) para
terminar una reacción de síntesis de ADN in-
vitro

41. Realizando 4 reacciones independientes
(una para cada base) se puede inferir la
secuencia original

42. Secuenciación automáticaSecuenciación automática
Sigue el mismo principio
A diferencia del método anterior cada ddNTP se
marca con una molecula fluorescente diferente
Esto permite realizar una unica reaccion en la cual
estan presentes los 4 ddNTPs marcados
Los fragmentos obtenidos se separan por
electroforesis capilar
La detección se realiza en un punto fijo al final de la
corrida

44. Secuenciación de genomasSecuenciación de genomas
Cada reacción de secuencia es capaz de leer
unas 500 pb
Como se obtuvo la secuencia continua del
conjunto de los cromosomas humanos?
Cada cromosoma tiene en promedio 150Mb
(genoma completo 109
)

45. Construcción de biblioteca de ADN genómico
fragmentado al azar
Lectura de secuencias individuales
Las secuencias individuales son solapadas y
ensambladas (contigs)
Para asegurarse de que todas las secuencias estén
representadas se leen unas 10 veces la cantidad de
bases del genoma

46. La velocidad de producción de las secuencias ha ido
en aumento.
Recientemente se dio un salto en este sentido con el
desarrollo de los secuenciadores de “próxima
generación”
No usan terminación de cadena
Se coloca una base cada vez y se detecta cual fue
incorporada a cada molécula que se esta
secuenciando
Producen en una única reacción de secuencia
millones de lecturas de fragmentos diferentes
(paralelización)
108
1010
bases por corrida (menos de 1 día)
De esta forma se secuencio el genoma entero de
Watson en menos de 1 mes a un “bajo” costo