1. INSTITUTO NACIONAL DE SALUD PUBLICA
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS DE LA UNAM
Protocolo de Investigación:
EFECTOS ANEUGENICOS IN VITRO DEL ACETATO DE
PLOMO EN LINFOCITOS HUMANOS DE SUJETOS CON
DIFERENTES NIVELES DE EXPOSICION CRONICA A PLOMO.
Carlos Roberto Leal Escalante
PROGRAMA:
MAESTRIA EN CIENCIAS EN SALUD AMBIENTAL
México, D.F., Febrero de 1996.

2. Con especial agradeciminto para mis maestros por las extraordinarias
sesiones que nos brindaron durante el curso de Genotoxicolgia en la
Maestria en Ciencias en Salud Ambiental.
Profesor Titular:
Dra. Patricia Ostrosky-Wegman.
Jefa del Laboratorio de Genotoxicolgía
del Instituto de Investigaciones Biomédicas de la UNAM.
Profesores Adjuntos:
Dr. Emilio Rojas.
M.C. Libia I. Vega.
M.C. Gillermo Elizondo.

3. I N D I C E:
I. Marco Teórico.
II. Problema de Investigación.
III. Hipótesis.
VI. Material y Métodos.
VI. Bibliografía.

4. I. Marco Teórico.
Aún cuando los eféctos tóxicos del plomo y sus compuestos han sido
estudiados por muchos años, gran cantidad de datos inconsistentes han sido
públicados sobre sus propiedades clastogénicas, mutagénicas y carcinogénicas.
Los compuestos inorgánicos del plomo han sido clasificados como posibles
carcinogénicos para el hombre por la Agencia Internacional para la Investigación
del Cancer (IARC,1980). Esta clasificación esta basada en estudios con animales
de laboratorio, en los cuales el plomo, administrado por diferentes vias, ha
causado principalmente tumores renales en ratas y ratones (IARC,1987). De
manera adicional, el acetato de plomo, subacetato de plomo y óxido de plomo han
demostrado incrementar el número de tumores inducidos por algunos compuestos
orgánicos, incluyendo 2-(etilnitrosamina)etanol (Shirai,et al.,1984) y N-(4'fluoro-4
bifenil)-acetamida (Tanner y Lipsky, 1984). En contraste, la evidencia de
carcinogenicidad por plomo en el humano es todavia inadecuada
(Schiag,R.D.;1987). Mientras que un estudio reportó no encontrar evidencia de un
mayor riesgo de morir por cáncer entre trabajadores de industrias relacionadas
con el plomo, con respecto a la población general (Dingwall y Lane,1963), otro
parecio mostrar evidencias de incremento en el riesgo de desarrollarlo al encontrar
un elevado número de muertes por neoplasias malignas entre los trabajadores de
una fundición pero no entre los de una planta de baterias (Cooper y Gaffey,1975);
pero que al ser reevaluados por la IARC, dictaminó que los resultados de este
último no eran significativos (IARC,1987). Muchos trabajos se han hecho para
determinar la clastogenicidad de los compuestos de plomo, a través de investigar
aberraciones cromosómicas en limfocítos de trabajadores expuestos a plomo. De
cualquier manera los resultados siguen siendo contradictorios, lo que puede
deberse en parte a diferencias en las condiciones de cultivo (Gebhart y
Leonard,1991). Todavía más, no está claro aún si los compuestos inorgánicos del
plomo tienen efectos clastogénicos por si mismos o aumentan las aberraciones
cromosómicas inducidas, por compuestos que se forman simultaneamente o
incrementan su concentración durante el cultivo de las células (Deknut y
Leonard,1975; Nordenson y Beckman,1982; Forni,et al.,1980).
La evidencia en relación a los potenciales efectos Genotóxicos directos del
plomo en células de mamiferos sigue siendo debil y principalmente restringida a
dosis tóxicas. Estudios en células de Hamsters Chinos V79, han mostrado qué
tanto los compuestos solubles como insolubles de plomo al parecer tienen escasa
actividad mutagénica en el locus hprt despues de 5 dias de incubación;
adicionalmente, un aumento en el número de transformaciones celulares en
células embrionarias de Hamster Syrian fué reportado después de tratarlas con
acetato de plomo (Zelikoff,et al.,1988).

5. Este débil potencial mutagénico ha sido confirmado recientemente por otro
reporte, donde el acetato de plomo fué mutagénico a dosis tóxicas en el locus gpt
de E. Coli transferido a células V79 (Roy,N.K. y Rossmann.,1992). En otros estudios
in vitro, ni el sulfuro de plomo (Zelikoff,et al.,1988) o el acetato de plomo (Zelikoff,et
al.,1988; Hartwig,et al,1990), indujeron un número significativo de intercambios de
cromátidas hermanas en células V79. Y tampoco ningun rompimiento de cadenas
de DNA o enlaces cruzados DNA-proteínas fué detectado con disolventes alcalinos
(Zelikoff,et al.,1988) o sedimentación nucleoide (Hartwig,et al,1990). Contrario a lo
anterior, a dosis tóxicas tanto el acetato de plomo como el nitrato de plomo
indujeron rompimientos en el DNA determinados por traslocación de posición
(Roy,N.K. y Rossmann.,1992).
No obstante lo anterior, cada vez hay más estudios que reportan evidencias
sobre la pronunciada actividad comutagénica del plomo, cuando éste está en
combinación con otros agentes capaces de dañar al DNA. En células V79 de
hamsters chinos, el acetato de plomo parece aumentar las mutaciones producidas
por UV en el locus hprt, así como el intercambio de cromátidas hermanas
(Hartwig,et al,1990). La comutagenicidad hacia la luz UV fué recientemente
confirmada en células G12; adicionalmente, se ha reportado un aumento en las
mutaciones inducida por N-metil-N'-nitro-N-nitroguanidina (MNNG) en presencia de
plomo (Roy,N.K. y Rossmann.,1992).
II. Problema de Investigación
La aneuploídia es una condición resultante de la no diyunción de
cromosomas homólogos durante la meiosis, en la cual, uno o más cromosomas
faltan o son agregados al número normal de cromosomas somáticos. Si faltan dos
cromosomas homólogos de un par, el resultado es nulisomia. La monosomía,
trisomía y tetrasomía son condiciones genéticas en las que el sujeto tiene uno,
tres, y cuatro cromosomas homólogos respectivamente, en lugar de los dos
normales. Por arriba del número normal(2), es decir trisomía, tetrasomía etc. estas
condiciones se conocen por polisomías (McKusick,1964;DuPraw,1971;Hook,1985).
Esta distribución anormal del material genético entre las células hijas está
asociado con eventos reproductivos (35% de los abortos expontáneos), y también
se ha asociado con procesos de transformación maligna a nivel celular
(Hassold,1985; Conti et al.,1986; Oshimura and Barrett,1986). Con diferentes
sistemas de prueba se ha demostrado en el laboratorio que algunas sustancias
químicas son capaces de inducir arresto mitótico y aneuplidía, a través de interferir
en la polimeración de tubulina, al enlazarse éstas sustancias con radicales
sulfihidrilos de moléculas proteicas (Hsu and Satya-Prakash,1985; Liang and
Brinkley,1985).

6. Algunos de estos agentes tienen gran importancia por ser contaminantes
ampliamente dispersos en el ambiente, como es el caso de herbicidas, fungicidas
y solventes orgánicos (Liang and Brinkley, 1985). También se demostrado la
suceptibilidad especial de algunos sujetos para ser blanco de este tipo de
sustancias (Libia, Vega. et al,1995) De ahi la importancia de estudiar aquellos
agentes que, por exposición ambiental, sean capaces de inducir aneuploídia en
seres humanos.
A. Forni y cols.(1980) colectaron linfocitos de 18 controles y 12 mujeres
expuestos ocupacionalmente a plomo y los cultivaron 48 y 72 hrs. El experimento
consistió en exponer in vitro a los linfocitos a acetáto de plomo (en dif. conc.).
Dichos autores reportaron en su estudio una diferencia significativa en el número
de cromátides y aberraciones cromosómicas en los linfocitos de las mujeres
trabajadoras a las 72 hrs, en comparacion con los controles cultivados por el
mismo lapso de tiempo.
Lo que se propone nuestro estudio es investigar si exiten diferencias
significativas, in vitro, entre los linfocitos de sujetos con diferentes niveles de
exposición crónica a plomo (niveles extremos altos y bajos), sobre todo de origen
ambiental, en términos de la capacidad del acetato de plomo para inducir en ellos
aneuploídía, aberraciones cromosomicas y arresto mitótico. Han pasado 16 años
desde los trabajos de Forni, y la controversia continua.
De confirmarse la hipótesis del estudio, nos gustaria estar en condiciones de
correr posteriormente otros experimentos (con los mismos sujetos), los cuales
estarian orientados a establecer: 1) si entre ellos existe polimorfismo de la -
Amino-Levulinato-Dehidratasa (particular al plomo), 2) estudiar posibles
diferencias en los patrones de actividad de los diferentes mecanismos de
reparación de DNA de esta población, y por último 3) hacer estudios in vitro, para
establecer si hay diferencias en la capacidad mutagénica del acetato de plomo en
los espermatozooides de sujetos con diferentes niveles de exposición crónica a
plomo.

7. III. Hipótesis.
En presencia de acetáto de plomo, los linfocítos activos in vitro de sujetos
con niveles más altos de exposición crónica a plomo, presentan una
diferencia significativa en el número de intercambios de cromátidas
hermanas, aberraciones cromosomicas y arresto mitótico, con respecto de
los linfocitos provenientes de sujetos que tienen niveles más bajos de
exposición crónica.
VI. Material y Metodos.
Se seleccionarán, al azar, 10 sujetos (5 casos y 5 controles sanos) entre
aquellos con niveles altos y 10 (5 casos y 5 controles sanos) con niveles
bajos. La selección se hará a partir de los sujetos (del estudio de casos y
controles sobre exposición crónica a plomo e infertilidad masculina anéxo a
este) que sean detectados con los niveles más extremos de exposición
crónica a plomo, por niveles de plomo en hueso estimado a través de
Fluoroscopia de R-X.
Se conducirán dos tipos de experimentos: un protocolo de experimento
estará orientado a investigar, in vitro, si el acetáto de plomo induce de forma
diferencial aneuploidia y/o células poliploides, en linfocítos proliferantes
activos de sujetos con diferentes niveles de exposición crónica a plomo. Y el
otro estará diseñado para evaluar la indución de arresto mitótico y
aberraciones cromosómicas en el mismo tipo de células, en presencia de
acetato de plomo, cuando los donadores tienen diferentes niveles de
exposición crónica a plomo.

8. Experiménto 1. (Efectos aneugénicos):
Se tomarán muestras de sangre periférica de los participantes 10 sujetos (5
casos y 5 controles sanos) con niveles altos y 10 (5 casos y 5 controles
sanos) con niveles bajos. Los donadores no deberán tomar ninguna droga o
medicamento, por al menos una semana antes de que les sea tomada su
muestra de sangre. Cultivos por duplicado para linfocitos se iniciarán como
sigue: 0.5 ml. de sangre en 6 ml. de medio de cultivo RPMI, suplementado
con 1% de L-glutamina y aminoacidos no esenciales (Gibco), 32 μM de
bromodeoxyuridina (Sigma) y 0.2 ml. de fitohemaglutinina (PHA)(Gibco). Los
cultivos serán incubados por 48 y 72 hrs (Forni,1980). a 37o
C con exposición
a acetato de plomo en las últimas 24 hrs. previas a la recolección de los
linfocitos. Las dosis probadas estarán en el rango de 10-10
a 5 μM. Medios de
cultivo y calcemida 10-2
μM. serán usados como controles negativos y
positivos respectivamente.
Recolección de células y Cuantificación:
2 horas antes de recolectar a los linfocítos, se añadirán 0.2 ml. de calcemida
(Gibco) a los cultivos e incubarán por espacio de 2hrs a 37o
C. Las células se
centrifugarán 10 min. a 300 X g. En seguida, se procederá a remover el
sobrenadante, para después colocar las células en una solución hipotónica:
KCL 0.1 M (Dauford, 1984) a 37o
C por 10 minutos. A continuación se fijarán
las células, para después lavarlas con una solución enfriada de metanol-
ácido acético 3:1. Las laminillas de microscopio serán en su caso
preparadas para conteo de aneuploidía, primero, dejando caer suavemente
las células sobre las laminillas (por goteo), en seguida secándolas por aire
(a temperatura ambiente), para después teñirlas por el metódo de Perry y
Wolff (1974).
Se analizarán 200 metafases en primera y segunda división, para determinar
la frecuencia de células heteroploides, clasificándolas como hypoploides
(cuando estén presentes menos de 46 cromosómas) e hyperploides (Cuando
estén presentes aproximadamente 92 cromosómas).
Experiménto 2. (Arresto Mitótico y aberraciones cromosómicas):
A fín de investigar posibles diferencias en la inducción de arresto mitótico
(efecto citoestático) por exposición in vitro de linfocitos a acetato de plomo.
Se tomará una muestra de sangre periférica proveniente de donadores con
diferentes niveles de exposición crónica a plomo (alta o baja). Se cultivarán
linfocitos de sangre total (mismos sujetos participantes que en el
experimento 1) y expondrán a diferentes concentraciones de acetáto de
plomo (mismas concentraciones que en el experimento 1) en las 2 últimas
hrs. del cultivo. Medios de cultivo y calcemida 10-2
μM. serán usados como
controles negativos y positivos respectivamente.

9. Recolección de células y Cuantificación:
A las 48 y 72 hrs de cultivo se colectarán las células (linfocitos), para
después centrifugarlas 10 min. a 300 X g. En seguida, se removerá el
sobrenadante, para después colocar las células en una solución hipotónica:
KCL 0.075 M a 37o
C por 30 minutos. A continuación se fijarán las células,
para lavarlas en seguida con una solución de metanol-ácido acético 3:1. Las
laminillas serán entonces preparadas y teñidas tal y como está descrito en
varios estudios (Gonsebatt et al,1992b).
Las proporciones de células con arresto mitótico serán determinadas por un
recuento en base al indice mitótico (MI), dado como el número de metafases
en, al menos, 5000 células mononucleares, usando la siguiente formula:
MI = número de metafases / número total de núcleos contados.
Los datos que se obtengan por tratamiento con colcemida serán tomados
como el 100% de metafases acumaladas, para cada individuo, los cuales se
compararán con los datos que se obtengan de células tratadas con acetáto
de plomo y los controles negativos.
Aberraciones cromosómicas estructurales.
La posible inducción de aberraciones cromosómicas estructurales como
consecuencia de la exposición de los linfocitos al acetáto de plomo será
investigada a diferentes concentraciones, a partir de 10-2
μM hasta dosis
tóxicas, analizando las 100 primeras metafases con 46 centrómeros, para
cada individuo. Los tipos de aberraciones a cuantificar serán:
a) Rompimientos definidos como una discontinuidad en la cadena del
DNA, más grande que el grosor de la cromátide ó como
desplazamiento de una pieza.
b) Rearreglos, que abarcan ambos tipos de cromátide, figuras
caracterizadas por un arreglo anormal de los brazos de una o varias
cromátides, en las que se forman configuraciones multiradiales y
arreglos intercromosomales en forma de anillos y dicéntricos.
c) Multifragmentaciones, cuando se observan más de 10 rompimientos
en una células.
d) Pulverizaciones, que comprenden células en las que todos los
cromosomas están fragmentados.

10. Análisis Estadístico.
Se aplicará a los datos obtenidos una prueba de heterogeneidad de Chi2,
para comparar la respuesta de todos los individuos en los tres parámetros
cuantificados en este estudio: células heteroploides, arresto mitótico (efecto
citostático), y aberraciones cromosómicas estructurales. Las proporciones
de heteroploídía y arresto mitótico serán comparadas usando una t de
Student, ambas a P<0.05 . Se practicará un análisis de ANOVA de tres vías,
para comparar individuos considerando todos los parámetros juntos, a una
P<0.05. Lo anterior con el propósito de verificar si los individuos mantienen
el mismo comportamiento a través de, todos los parámetros, para todas las
concentraciones empleadas en el estudio con excepción del control positivo
(colcemida 10-2
μM).
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