Resistencia bacterias mediante ingeniería genética

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Agrobiotecnología
Curso 2011
Resistencia a bacterias fitopatógenas
mediante ingeniería genética
Alejandro Mentaberry

Sumario
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Bacterias fitopatógenas
Interacciones planta-bacteria
Defensas inducibles en las plantas
Estrategias para desarrollar resistencia a
bacterias mediante ingeniería genética
- Péptidos antimicrobianos
- Lisozimas
- Tioninas
- Genes de resistencia
- Glucosa oxidasa
- Ornitil carbamoil transferasa
Inhibición de la regulación de factores de
virulencia
Referencias

Bacterias fitopatógenas
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas

Géneros
y especies
de bacterias
fitopatógenas
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.
iranicus, rathayi, tritici,
michiganensis (subsp.
michiganensis, insidiosus,
nebraskensis, sepedonicus,
tessellarius)
xyli (subsp. xyli, cynodontis)
ilicisArthrobacter
División Firmicutes
(gram positivos)
División Gracillicutes
(gram negativos)
Clase Proteobacteria
Subclase alfa
Familia Rhizobiaceae
fasciansRhodococcus
flaccumfaciensCurtobacterium
suberifaciensRhizomas
Familia (sin nombre)
rhizogenes, rubi, tumefaciens,
vitis
Agrobacterium
ampelinusXylophilus
avenae (subsp. avenae,
citrulli)
Acidovorax
Subclase beta
Familia Comamonadaceae
EspeciesGéneros
Clavibacter

Géneros
y especies
de bacterias
fitopatógenas
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.
fastidiosaXylella
albilineans , campestris,
fragariae, graminis, oryzae,
populi
Xanthomonas
Subclase gamma
Familia Enterobacteriaceae
1) fuscovaginae, marginalis,
tolaasii
2) amygdali
3) syringae, viridiflava
4) chicorii
5) corrugata
Pseudomonas
Familia Pseudomonadaceae
amylovora, nigrifluens, quercina,
rubrifaciens, stewartii,
tracheiphila, herbicola, ananas,
carotovora (subsp. carotovora,
atroseptica, betavasculorum),
chrysanthemi, rhapontici
Erwinia
Spp.Streptomyces
Géneros de afiliaciónincierta
EspeciesGéneros
fastidiosaXylella
albilineans , campestris,
fragariae, graminis, oryzae,
populi
Xanthomonas
Subclase Gamma
Familia Enterobacteriaceae
fuscovaginae, marginalis,
tolaasii
amygdali
syringae, viridiflava
chicorii
corrugata
Pseudomonas
Familia Pseudomonadaceae
amylovora, nigrifluens, quercina,
rubrifaciens, stewartii,
tracheiphila, herbicola, ananas,
carotovora (subsp. carotovora,
atroseptica, betavasculorum),
chrysanthemi, rhapontici
Erwinia
Spp.Streptomyces
Géneros de afiliaciónincierta
EspeciesGéneros

Principales componentes de la ultraestructura
de una bacteria fitopatógena típica
Esquema de
una bacteria
fitopatógena
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Adaptado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.
β
Microscopía electrónica de Erwinia
pyrifoliae, patógeno del peral. Pueden
observarse el glicocálix y varios pili.

Microscopía electrónica de barrido de células
de Pseudomas syringae.
Microscopía electrónica de
células de Xhantomonas
con un flagelo polar (arriba)
y de Peudomonas con
flagelos lofotricos (abajo)
Bacterias fitopatógenas Gram negativas y Gram positivas
Tomadode:Llaceretal.,PatologíaVegetal,1996.
Filamentos ramificados,
micelios aereos y cadenas
de esporas características
de Streptomyces spp.
500 nm
La mayoría de las bacterias
fitopatógenas tienen forma de
bastones cortos de 0,6-3,5 µm
de longitud y 0,5-1 µm de diámetro

Ciclo biológico
de una bacteria
fitopatógena
con fase epifita
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.

Pseudomonas syringae pv. morsprunorum exudando
de los estomatas de hojas de cerezo infectadas
Microscopía de barrido de la superficie
del envés de una hoja de cítrico.
Se observan células de Xanthomonas citri
colonizando la cavidad subestomática
Ingreso y dispersión de fitobacterias por aperturas naturales
Las bacterias fitopatógenas utilizan a los estomas
y lenticelas como vías naturales de ingreso a la planta
Tomado de: Agrios, Plant pathology, 1997.

Microscopía electrónica de una sección longitudinal (A)
y transversal (B) de Pseudomonas syringae pv tabaci
en el espacio intercelular del mesófilode hojas de tabaco.
Microscopía electrónica de Xanthomonas
campestris colonizando una hoja
de Brassica. Las bacterias están
generalmente rodeadas de un polisacárido
extracelular (EPS) y proliferan en estrecho
contacto con las paredes celulares (CW)
La mayor parte de las bacterias fitopatógenas se acumula en el espacio
extracelular o en el tejido vascular y utiliza esta vía y los tejidos conductivo
para colonizar diferentes órganos de la planta
A B A B
Muchas bacterias fitopatógenas se localizan en el apoplasma
Tomado de: Agrios, Plant pathology, 1997.

Principales tipos de enfermedades bacterianas
y síntomas que producen en el huésped
Clavibacter y
Curtobacterium
P. solanacearum
Algunas Erwinias y
Xanthomonas
Invasión del floema y
xilema
Marchitamiento
Enanismo
Podredumbreen anillo
Manchasen ojo de pájaro
Marchitamientos
en plantas
herbáceas
Pseudomonas
syringae pv. syringae
Erwinia amylovora
Invasión del floema y
xilema a través de
heridas, yemas,
cicatrices foliares, hojas
jóvenes y flores
Necrosis de la corteza
Marchitamientoo desecamiento de
brotes jóvenes y corimbos florales
Necrosis de yemas
Gomosis
Chancros y
marchitamieto
en plantas
leñosas
Principales especies
fitopatógenasde
Pseudomonas y
Xanthomonas
Espacios intercelulares
y necrosis del
parénquima
Necrosis con hidroceles
Manchas angulares o alargadas
Manchas necróticas con halo
Perdigonado de hojas
Clorosis de hojas jóvenes
Desecamiento foliar
Manchasen frutos
Exudados
Manchas foliares
y en frutos
PatógenosTejidos afectadosSíntomasTipo de
enfermedad
Clavibacter
Curtobacterium
P. solanacearum
Algunas Erwinias
Xanthomonas
Invasión del floema
xilema
Marchitamiento
Enanismo
Podredumbreen anillo
Manchasen ojo de pájaro
Marchitamientos
en plantas
herbáceas
syringae pv. syringae
Invasión del floema
xilema a través de
heridas, yemas,
cicatrices foliares, hojas
jóvenes y flores
Necrosis de la corteza
Marchitamientoo de
brotes jóvenes corimbos florales
Necrosis de yemas
Gomosis
Chancros
marchitamieto
en plantas
leñosas
Principales especies
fitopatógenasde
Pseudomonas
Xanthomonas
y necrosis del
parénquima
Necrosis con hidroceles
alargadas
con halo
Perdigonado
Clorosis de hojas jóvenes
Desecamiento
Manchasen frutos
Exudados
y en frutos
enfermedad
Xanthomonas axonopodis

Principales tipos de enfermedades bacterianas
y síntomas que producen en el huésped
Microscopía electrónica de
barrido de la
lesión del cancro
StreptomycesTejidos más externos
epidérmicos,
subepidérmicos y
parenquimáticos
Necrosis eruptivas rugosas, con
costras o pústulas y
suberificadas
Roñas o
costras
Agrobacterium
Rhodococcus fascians
P. syringae pv. savastanoi
Estimulación anormal de la
división celular y del
crecimiento de tejidos
meristemáticos
Tumores en cuello y raíz
Tumores en ramas
Hiperproliferación radicular
Hiperplasia y
proliferación
Erwinias pectinolíticas y
algunas Pseudomonas
Maceración de la lámina
media y pared primaria
celular
Pudrición blanda de tubérculos,
bulbos o rizomas
Pie negro
Podredumbres
blandas
enfermedad
StreptomycesTejidos más externos
epidérmicos,
subepidérmicos y
parenquimáticos
Necrosis eruptivas rugosas, con
costras o pústulas y
suberificadas
Roñas o
costras
Agrobacterium
P. syringae pv. savastanoi
Estimulación anormal de la
división celular y del
crecimiento de tejidos
meristemáticos
Tumores en cuello y raíz
Tumores en ramas
Hiperproliferación radicular
Hiperplasia y
proliferación
Erwinias pectinolíticas y
algunas Pseudomonas
Maceración de la lámina
media y pared primaria
celular
Pudrición blanda de tubérculos,
bulbos o rizomas
Pie negro
Podredumbres
blandas
enfermedad

Síntomas de algunas enfermedades bacterianas
Infección de geranio por
Xhantomonas hortorum pv pelargonii
(clorosis y necrosis foliar)
Infecciones de caña de azúcar por
Pseudomonas rubrilineas (bandas
necróticas; arriba derecha) y de
Platycerium bifurcatum por
Pseudomonas gladioli (lesiones
necróticas; derecha)

Infección por
Xanthomonas
axonopodis
(cancro de
los cítricos)
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de: Daniels. IRL Press, 1993.
Síntomas de cancrosis en frutos,
hojas y ramas de Citrus.

Infección de peral (arriba)
y de manzano (derecha) por
Erwinia amylovora (tizones)

Tomado de: Scnaad et al. APS Press, 2001.
Arriba izquierda:
Infección de
tubérculos de
papa
por Streptomyces
scabies (escaras)
Abajo izquierda:
Infección de fruto
de tomate por
Clavibacter
michiganensis
(cancros)
Derecha:
Infección de
tubérculos de
papa por Erwinia
carotovora subsp.
atroséptica
(podredumbre
blanda)

Infección de una cucurbitácea por Erwinia tracheiphila
(invasión del xilema con goma bacteriana)

• No existe control químico eficiente
• Pulverizaciones a base de cobre
Métodos de control de bacteriosis en cultivos
Pulverización
de citrus con
un preparado a
base de sulfato
de cobre de
para el control
de cancrosis

• Erradicación y quema de las plantas infectadas
Métodos de control de bacteriosis en cultivos
Quema de citrus infectados con cancrosis

Interacciones planta-bacteria
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas

- La planta posee defensas preformadas o su sistema
. defensivo reconoce moléculas presentes en la
. superficie del patógeno (PAMPs; patrones moleculares
. asociados al patógeno) desencadenando una respuesta
. de protección general (resistencia de no específica).
- Se gatillan los mecanismos defensivos inducibles de la .
. planta (Respuesta Hipersensible, Resistencia Sistémica
. Adquirida) y el patógeno resulta restringido en la zona inicial
. de la infección. (resistencia específica).
- Las condiciones ambientales externas cambian y el
. patógeno muere antes de llegar a una etapa en que la
. infección es irreversible.
- Las defensas preformadas son inadecuadas
- El patógeno es capaz de neutralizar las respuestas
. defensivas de la planta y/o de retardar el inicio de las mismas
- Las condiciones externas son favorables para la infección
• Se produce enfermedad cuando:
La enfermedad
resulta de la
interacción entre
el hospedante,
el patógeno y el
medio ambiente
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
• No se produce enfermedad cuando:

La especificidad
del patógeno
bacteriano y de
los genes de
resistencia de
la planta
determinan
diferentes tipos
de interacción
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de: Agrios, Plant Pathology, 1997.
(variedades) (variedades)

Modificado de: Keen, Nat. Biotechnol., 1999.
Interacciones
planta-bacteria
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Eventos de señalización
que regulan la interacción planta-bacteria

Factores que intervienen en la interacción planta-patógeno
Factores de patogenicidad: imprescindibles
para general la enfermedad; no determinan
los síntomas en forma directa (ejemplo,
proteínas hrp; proteínas vir)
Factores de
virulencia:
Factores de virulencia: responsables de la
sintomatología; modulan la gravedad de la
enfermedad (ejemplo, toxinas, enzimas
degradadoras, fitohormonas)
Factores de Requeridos para el reconocimiento del
avirulencia: patógeno por parte de la planta
Factores de patogenicidad: imprescindibles
para general la enfermedad; no determinan
los síntomas en forma directa (ejemplo,
proteínas hrp; proteínas vir)
Factores de
virulencia:
Factores de virulencia: responsables de la
sintomatología; modulan la gravedad de la
enfermedad (ejemplo, toxinas, enzimas
degradadoras, fitohormonas)
Factores de Requeridos para el reconocimiento del
avirulencia: patógeno por parte de la planta

Algunos factores bioquímicos producidos por las bacterias fitopatógenas que
tienen una función en la virulencia y en la colonización de la planta huésped
SIDEROFOROS
EXOPOLISACARIDOS
EXOENZIMAS
BACTERIOCINAS
FITOHORMONAS
PROTEINAS
NUCLEADORAS
FITOTOXINAS
BACTERIA
SIDEROFOROS
EXOPOLISACARIDOS
EXOENZIMAS
BACTERIOCINAS
FITOHORMONAS
PROTEINAS
NUCLEADORAS
FITOTOXINAS
BACTERIA
Factores secretados por bacterias fitopatógenas

Sistemas de secresión en bacterias Gram negativas
Tomado de: Nature Reviews Microbiology, 2009.

Modelo de patogenia bacteriana que involucra la liberación mediada por el sistema Hrp de
factores de patogenicidad y factores de avirulencia dentro de la célula vegetal
Factores de compatibilidad (virulencia)
- Las proteínas secretadas por el sistema Hrp (símbolos rojos/verdes) interactúan
con la proteínas o ácidos nucleicos del hospedante (símbolos negros)
- Algunas pueden sintetizar productos activos (no se muestran)
- Las mutantes bacterianas poseen fenotipos de virulencia débil (parte verde de
los símbolos rojos/verdes)
- Estas proteínas promueven colectivamente el parasitismo vía:
. Supresión de las defensas?
. Promoviendo la síntesis o liberación de nutrientes
Factores de incompatibilidad (avirulencia)
- Un amplio espectro de proteínas del hospedante codificadas por genes R
(símbolos negros) acopladas a las rutas de señalización de las respuestas
defensivas (flechas en zig-zag) conforman el sistema de vigilancia
- La Respuesta Hipersensible (HR) es gatillada por la interacción de cualquier
par correspondiente de proteínas R y Avr (parte roja de los símbolos
rojos/verdes) o de proteínas R y productos enzimáticos Avr (no se muestran)
- Las interacciones avirulentes son epistáticos sobre las interacciones
virulentas (compatibles)
Pared
celular
Parasitismo
HR y
defensa
Nutrientes
Agua
Incremento
de pH
Secresión de proteínas mediada por el
sistema Hrp
La región de patogenicidad Hrp contiene:
- El agrupamiento conservado de genes hrp
(subconjunto hrc en púrpura)
- El gen hrpZ que codifica a la harpina HrpZ (Z
amarilla)
- Multiples genes avr (cruzado) en regiones
flanquentes variables
El sistema Hrp (tipo III) secreta:
-HrpZ al medio (parte del aparato de
secresión extracelular?)
- Proteínas Avr directamente dentro de la
célula vegetal (transferencia gatillada por
contacto con el hospedante?)
Factores de compatibilidad (virulencia)
- Las proteínas secretadas por el sistema Hrp (símbolos rojos/verdes) interactúan
con la proteínas o ácidos nucleicos del hospedante (símbolos negros)
- Las mutantes bacterianas poseen fenotipos de virulencia débil (parte verde de
los símbolos rojos/verdes)
- Estas proteínas promueven colectivamente el parasitismo vía:
. Supresión de las defensas?
. Promoviendo la síntesis o liberación de nutrientes
Factores de incompatibilidad (avirulencia)
- Un amplio espectro de proteínas del hospedante codificadas por genes R
(símbolos negros) acopladas a las rutas de señalización de las respuestas
defensivas (flechas en zig-zag) conforman el sistema de vigilancia
- La Respuesta Hipersensible (HR) es gatillada por la interacción de cualquier
par correspondiente de proteínas R y Avr (parte roja de los símbolos
rojos/verdes) o de proteínas R y productos enzimáticos Avr (no se muestran)
- Las interacciones avirulentes son epistáticos sobre las interacciones
virulentas (compatibles)
Pared
celular
Parasitismo
HR y
defensa
Nutrientes
Agua
Incremento
de pH
Nutrientes
Agua
Incremento
de pH
sistema Hrp
amarilla)
sistema Hrp
amarilla)
El sistema de secreción de tipo III

Defensas inducibles en las plantas
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas

Respuesta Hipersensible (HR) y Resistencia Sistémica Adquirida (SAR)
en el sistema de genes RPS2-avrRPt2/RPM1-avrRPM1
La planta y su sistema defensivo
Adaptado de: Mackey et al., Cell, 2003.
A
RPS2 (Resistance to P. syringae 2) confiere
resistencia a cepas que expresa el factor de
avirulencia avrRpt2. RPM1 de A. thaliana
(Resistance to P. syringae pv maculicola 1)
confiere resistencia a cepas que que expresan
el gen de avirulencia avrRPM1.
.
A
RPS2 (Resistance to P. syringae 2) confiere
resistencia a cepas que expresa el factor de
avirulencia avrRpt2. RPM1 de A. thaliana
(Resistance to P. syringae pv maculicola 1)
confiere resistencia a cepas que que expresan
el gen de avirulencia avrRPM1.

Para que exista resistencia (incompatibilidad) se requiere un gen Avr
del patógeno y un gen R de la planta, ambos dominantes. En presencia
de los alelos recesivos ocurre la enfermedad (compatibilidad)
El modelo de resistencia “gen por gen” (Flor, ca. 1940)
El modelo gen
por gen explica
los casos de
compatibilidad de
incompatibilidad
planta-patógeno
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Modificado de: Keen, Ann. Rev. of Gen., 1990.

Localización
de proteínas
de resistencia
y esquema
de sus
dominios
funcionales
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
BS2: gen de resistencia de pimiento que confiere resistencia a Xanthomonas campestris pv vesicatoria; Cf-2,4,5 y 9: genes de
resistencia a las razas 2, 4, 5 y 9 de Cladosporium fulvum; FLS2: gen de resistencia a bacterias de Arabidopsis thaliana; L6: gen
de resistencia a la roya del lino 6; PBS1: gen de A. thaliana que confiere resistencia a Pseudomonas syringae; Pto: gen de
resistencia a P. syringae pv. tomato; RPG1: gen de resistancia a Puccinia graminis sp. tritici 1; RPM1: gen de resistencia a P.
syringae pv. maculicola; RPP5: gen de resistencia a Peronospora parasitica; RPW8: gen de resistencia de A. thaliana que
confiere resistencia a Erysiphe orontii, E. cichoracearum y Oidium lycopersici; RRS1: gen de resistencia a Ralstonia
solanacearum 1; Xa21: gen de resistencia a X. oryzae pv. Oryzae; Va1 y Va2: genes de resistencia de tomate que confieren
resistencia a Verticillium alboatrum. ECS: señal de endocitosis; NLS: secuencia de localización nuclear; PEST: secuencia Pro-
Glu-Ser-Thr-like; CC: dominio coiled-coil; NB: dominio de unión a nucleótidos; TIR: domino similar a Toll/receptor de
interleuquina; LRR: leucine rich repeat; WRKY: dominio de “dedos de zinc” . Dominios 1-4: sin homología conocida.
Adaptado de: Hammond-Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003.

Modelo de interacción proteína R/factor de avirulencia:
hipótesis de la “proteína guardiana”
Adaptado de: Loh et al., Curr. Opin. in Biotechnol., 2002.
Interacción
R2
proteína “guardiana”

Procesos defensivos inmediatos, locales y sistémicos
comprendidos en una respuesta inducible
Respuesta
defensiva
- Engrosamiento de la pared celular
- Inducción de genes involucrados en la síntesis
de metabolitos secundarios. Síntesis de fitoalexinas
- Síntesis de tioninas
- Síntesis de proteínas relacionadas con la defensa (PRs)
a patógenos
- Síntesis de ácido salicílico Inducción de Resistencia
Sistémica Adquirida (SAR)
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Las respuestas
defensivas
inducibles por
patógenos
comprenden
diversos
mecanismos
moleculares
Adaptado de: Lamb et al., Ann. Rev. of Plant Physiol. and Plant Mol. Biol., 1997.
Cl -
BA

Genes involucrados en resistencia local a patógenos
CET1/CET3: constitutive expression of thionin 1/3; COI1: coronatine insensitive 1; EDR1: enhanced disease resistance 1; EN2: ethylene-
insensitive 2; NRD1: non-race specific disease resistance 1; PAD4: phytoalexin-deficient 4; PDF1.2: plant defensin 1.2; Pti4/5/6: factores de
transcripción Pto-interacting 4, 5 and 6; SID2: SA induction deficient 2; SS2: suppressor of salicylate insensitivity of NPR1-5.
TGAs: factores de transcripción de unión a TGACG
COL1
EIN2

Genes involucrados en resistencia local a patógenos
Independiente de SAR
SIR ISRSAR
Dth9: detachment 9;
ISR1: induced systemic
resistance 1;
JAR1: JA resistance 1;
NPR1-1 inducible;
SNI1: suppressor of SAR
SON1: suppressor of nim1-1;
SAG: salicylic acid glucoside.
Dir1?

Estrategias para desarrollar resistencia
a bacterias mediante ingeniería genética
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas

Total
Pseudomonas syringae pv.
phaseolicola
Haba
Pseudomonas
syringae pv.
phaseolicola
OCTasa
insensible a
faseolotoxina
TotalPseudomonas syringaeTabaco
Pseudomonas
syringae pv. tabaci
Proteína de
resistencia a
tabtoxina
Inhibición de la patogenicidad o de factores de virulencia bacterianos
Erwinia carotovora
Ralstonia solanacearum
Pseudomonas syringae pv. tabaci
Erwinia carotovora
Erwinia amylovora
Pseudomonas syringae pv. tabaci
Ralstonia solanacearum
Resistencia a
ParcialTabacoGusano de sedaMB39
ParcialTabacoGusano de sedaShiva-1
ParcialManzanoGusano de sedaAtacina E
ParcialTabacoHumanoLisozima
ParcialPapaBacteriofago T4Lisozima
ParcialTabacoHumanoLactoferrina
ParcialPapaCangrejo herraduraTaquiplesina
Producción de compuestos antibacterianos no vegetales
Nivel de
resistencia
Especie
transgénica
OrigenProteína
Estrategias para desarrollar resistencia a bacterias
por medio de ingeniería genética
Modificado de: Düring et al., Mol. Breed. 1996.

ParcialErwinia carotovoraTabacoErwinia carotovoraExpR
ParcialErwinia carotovoraTabacoBacillus spp.aiiA
Interferencia con el mecanismo de quorum sensing
Total
tabaci
Tabaco
Halobacterium
halobium
Bacterio-opsina
Muerte celular inducida artificialmente en el sitio de infección
tabaci
Erwinia carotovora
Xanthomonas oryzae
Erwinia carotovora
Resistencia a
TotalArrozCultivares resistentesProteína Xa21
ParcialPapaErwinia carotovoraPectato liasa
ParcialPapaAspergillus nigerGlucosa oxidasa
ParcialTabacoCebadaTionina
Incremento de los sistemas de defensa naturales
Nivel de
resistencia
Especie
transgénica
OrigenProteína
Estrategias para desarrollar resistencia a bacterias
por medio de ingeniería genética
Modificado de: Düring et al., Mol. Breed. 1996.

Péptidos
antimicrobianos
Estructuras de algunos péptidos antimicrobianos
En rojo: aminoácidos básicos (cargados positivamente)
En verde: aminoácidos hidrofobitos
Modificado de: Zasloff, Nature, 2002.
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas

Mecanismos de acción postulados
para péptidos antimicrobianos
La estructura
anfipática
de los péptidos
antimicrobianos
determina
su especificidad
y mecanismo de
acción
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas

Mecanismos de acción postulados para péptidos antimicrobianos
Modelo de Shai-Matzusaki-Huang para el mecanismo de acción de péptidos líticos
A: reconocimiento de la
membrana bacteriana.
B: inserción a la
membrana mediada por
la atracción
electrostática
C: formación de poros
en la membrana.
D: transporte de
péptidos y lípidos a la
capa interna de la
membrana.
E: acción de los
péptidos sobre
“blancos” intracelulares
F: colapso de la
membrana bacteriana y
ruptura de la célula.
Llípidos en amarillo:
carga negativa. Lípidos
en negro: sin carga neta

Transformación de cloroplastos de tabaco
con el gen del análogo de magainina MSI-99
Bioensayos en plantas de tabaco transformadas con el gen MSI-99. Se trataron
áreas de 5-7 mm de hojas de plantas transformadas R0 y de plantas control con
un papel de lija fino y se inocularon en las mismas 10 µl de 8x105, 8x104, 8x103
y 8x102 células de Pseudomonas syringae pv tabaci.
Expresión en
plantas de un
péptido lítico
antimicrobiano
análogo de
magainina
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de: Chakrabarti, Planta, 2003.
Transgénica
Transgénica
Wild type
Wild type
8.105 8.105
8.105 8.105
8.104
8.102
8.103
8.103
8.102

Resistencia
a bacterias
mediada por
sarcotoxina,
un péptido
aislado de
Sarcophaga
peregrina
Hojas de plantas de naranja inoculadas con Xanthomonas axonopodis
pv. Citri (104 ufc/mL), bacteria causante de la cancrosis en cítricos.
Izquierda: planta control no transgénica; derecha: planta transgénica que
expresa el gen de sarcotoxina. Fotos obtenidas a los 26 d post-infección.
Expresión de sarcotoxina en plantas
transgénicas de cítricos
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de: Ohshima et al. J. Biochem., 1999.

La lisozima es
una enzima
de reconocida
acción
bacteriolítica
Estructura del vector pSR-2 conteniendo el gen quimérico de la lisozima
del fago T4 fusionado a la secuencia codificante del péptido señal de
α-amilasa de cebada. El gen es dirigido por el promotor de 35S del CaMV
Resistencia antibacteriana en plantas de papa
transformadas con el gen de lisozima del fago T4
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de : Düring et al. The Plant Journal, 1993.

Ensayos de maceración con distintas densidades de inóculo
La resistencia
fue clasificada
determinando
la superficie
macerada
sobre el total
de la superficie
de cada disco.
En a) se
muestra el
promedio de 5
experimentos;
en b) se
muestra el
promedio de 4
experimentos.
La edad de los
tubérculos fue
de 2-3 meses

Ensayos de maceración con Erwinia carotevora pv atroséptica a lo largo de 1-12 días.
Se presentan los resultados correspondientes a los controles, el mejor transformante
y el valor promedio de todos los transformantes
Evaluación de resistencia mediante ensayos de maceración
en plantas de papa transformadas con lisozima del fago T4

Cuantificación de los resultados de un bioensayo de brotacion de tuberculos en invernadero
luego de la infección con Erwinia carotovora pv. atroséptica
Comparación de la brotación en plantas de papa control y transformadas con la lisozima del fago
T4 en condiciones de invernadero. Se plantaron trozos de tubérculo infectados con Erwinia
carotovora pv atroséptica. Izquierda: plantas transgénicas T424; derecha: plantas control Z2
Ensayos de brotación de tubérculos en plantas
de papa transformadas con lisozima del fago T4
Plantas
transgénicas
de papa que
expresan el
gen de la
lisozima
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas Tomado de: Düring et al. The Plant Journal, 1993.

Plantas de Solanum tuberosum transformadas
con genes de osmotina AP24, lisozima y dermaseptina
Plantas control Plantas transgénicas

Plantas de Solanum tuberosum transformadas
con genes de osmotina AP24, lisozima y dermaseptina
controles transgénicas controles transgénicas
Ensayos de
infección con
Erwinia
carotovora
de plantas
transgénicas
(derecha) y
controles
(izquierda) de
Solanum
tuberosum
que expresan
combinaciones
de uno, dos y
tres genes
antimicrobianos

Ensayos de maceración en tubérculos de plantas transgénicas
Ensayos de
maceración
en
tubérculos
de Solanum
tuberosum
inoculados
con Erwinia
carotovora

Las tioninas
son proteínas
ricas en
cisteína
tóxicas para
las bacterias
Desarrollo de plantas de tabaco
que expresan tioninas de trigo y de cebada
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas Tomado de: Carmona et al., The Plant Journal, 1993.

Lesiones causadas por las bacterias 6 días después
de la inoculación en plantas transformadas con la
tionina de cebada (UP1) y no transformadas (WT)
Datos de infección. El porcentaje de infección fue
medido 90 h después de la inoculación y representa
la proporción de puntos de inoculación que formaron
lesiones necróticos.
Desafío de plantas de tabaco que expresan tioninas
con Pseudomonas syringae pv tabaci
Tomado de: Carmona et al., The Plant Journal. 1993.
SNN: N. tabacum Sansum NN no
transformada
SNN+CS: plantas de N. tabacum Samsun NN
transformadas con un vector vacío
UP1 hz y UP2 hz: plantas homocigotas
transformadas con la tionina de cebada
UP6 pg y UP7 pg: progenies heterocigotas
de UP1 y UP2
UP3 hz y UP4 hz: plantas homocigotas
transformadas con la tionina de trigo.
WTUP1

El desarrollo de la infección
se midió titulando el número
de bacterias. Los títulos en las
plantas UP1 a las 34 y 48 h
fueron significativamente
diferentes de los de las
plantas UP3 y controles. Los
títulos en UP3 no son
significativamente diferentes
de los de los controles
(trigo)
(cebada)

A: lesiones causadas por el patógeno en
plantas transgénicas (UP1) y control (WT)
a los 4 días de la infección
B: Datos de infección. Se midió el área
necrótica a los 4 días de la infección en el
Experimento 1 y a los 3 días de la
infección en el Experimento 2.

La OCTasa de
Pseudomonas es
insensible a su propia
toxina.
Se la expresó la secuencia
de la la OCTasa en plantas
para proteger de la acción
de la faseolotoxina.
A la secuencia de la
OCTasa se le agregó una
señal de transporte al
cloroplasto (en plantas, ruta
de síntesis cloroplastídica).
Modo de acción de la faseolotoxina
faseolotoxina

19,80 ± 0,4019,90 ± 0,1522,90 ± 0,66SSO-T16
10,30 ± 0,3010,70 ± 0,1414,20 ± 0,26SSO-T13
2,10 ± 0,302,10 ± 0,155,50 ± 0,10SSO-T1
N.D.59,80 ± 2,4068,00 ± 6,10
SSO-T3
(cloroplastos)
N.D.0,90 ± 0,036,0 ± 0,05
Control
(cloroplastos)
N.D.0,10 ± 0,022,50 ± 0,02Control
Toxina (375 ng/ml)Toxina (37 ng/ml)Sin toxina
Actividad OCTasa
Planta
Efecto de faseolotoxina en la actividad de ornitil carbamoil transferasa
(OCTasa) de plantas transgénicas SSU-OCTasa y plantas control.
La actividad de OCTasa está expresada como mmoles de citrulina formados por
min/mg de proteína, con la excepción de extractos de cloroplastos, que fueron
reportados por mg de clorofila. Las actividades mostradas representan un
promedio de tres experimentos independientes. N.D. = no determinado.
Ensayos con faseolotoxina
en plantas transgénicas SSU-OCTasa
Tomado de: De la Fuente-Martínez et al., Bio/Technology, 1992.

Ensayos con
faseolotoxina
con plantas
transgénicas
SSU-OCTasa
A: Clorosis típica inducida en hojas de Phaseolus tratadas con faseolotoxina.
B y D: Plantas control independientes no transformadas tratadas con faseolotoxina.
C y E: Plantas transgénicas independientes tratadas con faseolotoxina. Todos los
tratamientos en las hojas fueron con 2 µl de una solucion de 3 µg/ml de toxina.
Las flechas señalan los sitios de inoculación de la toxina
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de: De la Fuente-Martínez et al., Bio/Technology, 1992.

Efecto de la inoculación con Pseudomonas syringae pv
phaseolitica sobre las plantas transgénicas OCTasa
A y C: Plantas control no transformadas a los 7 días de la inoculación con Pseudomonas
B y D: Plantas transgénicas SSU-OCTasa a los 7 días de la inoculación con Pseudomonas
A B
C D
Ensayos con
Pseudomonas
syringae en
plantas
transgénicas
SSU-OCTasa
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas Tomado de: De la Fuente-Martínez et al., Bio/Technology, 1992.

Transformación
de arroz
con el gen
de resistencia
Xa21
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de: Zhang et al., Nature Biotech. 2000.
CC
Plantas control
Plantas transgénicas
Plantas control
Plantas control
Plantas control
Resistencia a la infección
con Xanthomonas oryzae
pv. oryzae en cultivares
susceptibles
transformados con
el gen Xa21
A: cultivar Minghui 63-12
B: cultivar IR7 2-82
C: Síntomas en plantas
transgénicas (izquierda) y
control (derecha) en
ensayos de campo.

Transformación de arroz con el gen de resistencia Xa21
Segregación de la expresión de Xa21 en la generación R1 de las líneas
transgénicas IR72-82, Minghui 63-12, Minghui 63-22 y BG90-2-27

Transformación
de arroz
con el gen
de resistencia
Xa26
Resistencia a la infección de
Xanthomonas oryzae pv. oryzae
en plantas transformadas con el
gen Xa26, aislado del cultivar
MH63
MH63: Minghui 63 (con moderada
resistencia)
MDJ8: Mudanjiang 8 (susceptible)
RB22: MDJ8 transformado con
Xa26
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Lesiones producidas por
Xanthomonas orizae pv. orizae
sobre hojas de plantas de arroz.
IR24: planta susceptibles
Rb17-18: Líneas transgenicas que
expresan el gen Xa26.
Controles de la PCR para Xa26:
Positivos: MH63 y IRBB3, líneas
moderadamente resistentes y
resistentes, respectivamente.
Negativo: MDJ8, línea susceptible.
Tomado de: Sun et al., Plant Journal, 2004.

Crecimiento de Pseudomonas syringae pv tabaci en plantas de tabaco transformadas
con el gen de resistencia Pto (líneas sólidas) y en plantas control no transformadas
(líneas discontínuas). Las plantas fueron inoculadas con bacterias que expresan el gen
avr/Pto (cuadrados) o que no poseen el gen (triángulos). Los tipos de interacciones que
se indican son: [1]: incompatibilidad (presencia de gen R y gen avr; [2]: compatibilidad
(ausencia del gen R y presencia del gen avr; [3]: compatibilidad (presencia del gen R
y ausencia del gen avr); [4]: compatibilidad (ausencia del gen R y del gen avr)
Transformación
de tabaco con
el gen de
resistencia
Pto de tomate
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Tomado de: Thilmony et al. The Plant Cell. 1995.
Planta transgénica
Planta control
Crecimientobacteriano[log(cfu/cm2)]

Detección de H2O2 en plantas que expresan
el gen de glucosa oxidasa de Aspergillus niger
A: raíces de planta de papa
no transgénica (izquierda) y transgénica
(derecha)
B: discos de hoja de papa no transgénica
(arriba) y transgénica (abajo) puestos en
medio KI/almidón por 30 minutos
C: Idem que B, pero durante 5 horas
D: discos de tubérculos de papa de
plantas no transgénicas (arriba) y
transgénicas (abajo) puestos en medio
KI/almidón por 30 minutos
E: Idem que D, pero por 5 horas
ββββ-D-glucosa + O2
. ácido glucónico + H2O2
glucosa oxidasa

Incremento del nivel de H2O2
en hojas de papa
transgénicas que expresan
el gen de glucosa oxidasa de
Aspergillus niger.
Controles: Russet Burbak no
transformada y planta
transformada con el vector
vacío (17227-1).
Líneas transgénicas: 22587-3,
22587-12 y 22587-33
Detección de H2O2 en plantas que expresan
el gen de glucosa oxidasa de Aspergillus niger

Ensayos de infección in vitro con Erwinia carotovora
de plantas que expresan el gen de glucosa oxidasa
Inhibición del
crecimiento Erwinia
carotovora en discos
de tubérculos de
plantas transgénicas
Se midió el número de
bacterias entre 1 y 5 días
luego de la inoculación.
Los símbolos vacíos
corresponden a los
controles de plantas no
transformadas o
transformadas con el
vector vacío. Los símbolos
llenos corresponden a dos
líneas transgénicas que
expresan el gen de
glucosa oxidasa

A: discos de tubérculo de papa inoculados a 23-24oC bajo condiciones aeróbicas
B: discos de tubérculo de papa inoculados a 23-24oC bajo condiciones anaeróbicas
Los minituberculos de papa de plantas no transgénicas (RB) o de las líneas transformadas con
glucosa oxidasa 22587-3 (3) y 22587-34 (34) se inocularon con 2x105 cfu de Erwinia carotovora
por disco de tubérculo. Los síntomas se evaluaron a los tres días de la inoculación
Ensayos de infección in vitro con Erwinia carotovora
de plantas que expresan el gen de glucosa oxidasa

Inhibición de la regulación
de factores de virulencia
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas

Quorum sensing
• Mecanismo de comunicación comunitario presente en
. diversas especies de bacterias. Fue detectado por
. primera vez en Vibrio fischeri
• Capacidad de los microorganismos de percibir y
. responder a la densidad poblacional a través de la
. producción de moléculas difusibles de reducido peso
. molecular
Moléculas señal: acil-homoserin lactonas (AHSLs)
Un gran número
de bacterias
Gram – se
comunican
sintetizando,
secretando y
respondiendo a
compuestos
difusibles
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas

Regulación génica dependiente de la densidad poblacional
El incremento de una población bacteriana determina una
elevada concentración de factores difusibles
Modificado de: Fuqua et al., Curr. Opin. in Microbiol. 1998.

Modelo simplificado de la transducción
de señales en quorum sensing
Célula bacteriana: proteína I (azul), responsable de la síntesis de las señales
difusibles de acil-homoserin lactona (A-HSL; óvalos verdes). La proteína R (rojo),
sufre un cambio conformacional cuando se une a la señal A-HSL; actúa entonces
como regulador transcripcional, aumentando su afinidad por secuencias
promotoras específicas de los genes regulados por HSLs (“lux” box) .
El mecanismo
de quorum
sensing es
mediado por
moléculas
difusibles
como las acil-
homoserin
lactonas
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.
Proteína R
activada

El sistema rpf en Xanthomonas campestris
Otros sistemas de regulación de virulencia en bacterias
Gentileza de J. Maxwell Dow
endoglucanasas ,
proteasas y polisacáridos
rpf: Regulation of Pathogenicity Factors

Estructura de moleculas señalizadoras de quorum sensing

La interferencia
de la
comunicación
entre bacterias
es una posible
estrategia
de resistencia
antimicrobiana
Posibles blancos y estrategias para interferir en la
comunicación entre bacterias (quorum quenching)
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.
HSL
sintetasa
R

Mecanismos que afectan la regulación
mediada por homoserin lactonas
Reconocen las A-HSLs
producidas por otros organismos
Homólogos de proteínaLux-R
No producen A-HSLs
Salmonella enterica
(patógenohumano)
Organismos A-HSLs oportunistas
Afectan sistema de quorum
sensing
Diferentes compuestosPlantas superiores
(arroz, arveja, etc)
Se unen a receptores de A-HSLs
Inhiben quorum sensing
Furanonas halogenadasDelisea pulchra
Moléculas imitadoras de las A-HSLs
Degrada A-HSLsA-HSLs lactonasa
GenaiiA
Bacillus sp. 240B1
Degrada A-HSLsActividad aminoacilasaVariovax paradoxus
FunciónMoléculaOrganismo
Enzimas degradadoras de A-- HSLs
Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol., 2002.

Tomado de: Dong et al., Nature, 2001.
Transformación de plantas de papa con el gen
de acil homoserin lactonasa (aiiA) de Bacillus spp.
Cortes transversales de tubérculos de papa
inoculados con Erwinia carotovora.
A la izquierda: tubérculo de planta no transformada.
A la derecha: tubérculo de planta transformada con el
gen aiiA.
Inoculación de hojas con Erwinia carotovora SCG1.
Arriba: hojas de plantas de tabaco transformadas con el gen aiiA
Abajo: hojas de plantas de tabaco control no transformadas

Tomado de: Mae et al., MPMI, 2001.
Las plantas que
expresan
genes de
N-acil-homoserin
lactona sintasas
exhiben mayor
resistencia
a Erwinia
carotovora
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas
A BA B
A: detalle de una hoja
de una planta
transgénica infectada
con Erwinia carotovora
B: hoja de una planta
control luego de la
infección
Porcentajes de
infección observados
para dos líneas
transgénicas (barras
verde y anaranjada) y
de una planta control,
no transgénica (barra
violeta).
Transformación
de plantas de
tabaco con el
gen de la N-acil-
homoserin
lactona sintasa
de E. carotovora
(gen expI)
transgénica control

1. Carmona, M.J., Molina, A., Fernández, J.A., López-Fando, J. J. and
García Olmedo, F. Expression of the thionin gene from barley in tobacco
confers enhanced resistance to bacterial pathogens. The Plant Journal,
3:457-462, 1993.
2. De Gray, G., Rajasekaran, K., Smith, F., Sanford, J. and Daniell, H.
Expression of an antimicrobial peptide via the chloroplast genome to
control phytopathogenic bacteria and fungi. Plant Physiology, 127:852-
862, 2001.
3. Dong, Y.H., Wang, L.H., Xu, J.L., Zhang, H.B. and Zhang, L.H.
Quenching quorum-sensing-dependent bacterial Infection by an N-acyl
homoserine lactonase. Nature, 411:813-817, 2001.
4. Fray, R.G. Altering Plant-Microbe interactions through artificially
manipulating bacterial Quorum-sensing. Annals of Botany, 89:245-248,
2002.
5. Loh, J., Pierson, E.A., Pierson, L.S., Stacey, G. and Chatterjee, A.
Quorum sensing in plant-associated bacteria. Current Opinion in Plant
Biology, 5:1369-1375, 2002.
6. Mae, A., Montesano, M., Koiv, M. and Palva, E.T. Transgenic Plants
producing the bacterial pheromone N-acyl-homoserine lactone exhibit
enhanced resistance to the bacterial phytopathogen Erwinia carotovora.
Molecular Plant-Microbe Interactions, 14:1035-1042, 2001.
7. Tai, T.H., Dahlbeck, D., Clark, E.T., Gajiwala, P., Pasion, R., Whalen,
M.C., Stall, R.E. and Staskawicz, B.J. Expression of the Bs2 pepper
gene confers resistance to bacterial spot disease in tomato. Proceedings
of the Natural Academy of Sciences U.S.A., 96:14153-14158, 1999.
Referencias
Agrobiotecnología
Resistencia
a bacterias
fitopatógenas

Resistencia bacterias mediante ingeniería genética

Recomendados

Recomendados

Más contenido relacionado

La actualidad más candente

La actualidad más candente (20)

Destacado

Destacado (7)

Similar a Resistencia bacterias mediante ingeniería genética

Similar a Resistencia bacterias mediante ingeniería genética (20)

Resistencia bacterias mediante ingeniería genética