1. Texto adicional Texto adicional Texto adicional texto adicional Texto adicional texto adicional Comparisons of two proteomic analyses of non-mucoid and mucoid Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from a cystic fibrosis patient Jayasim haRao, F.Heath Damron, Marek Basler, Antonio Di Giandomenico, Nicholas E.Sherman, Jay W. Fox, John J. Mekalanos and Joanna B.Goldberg Iliana Vanessa Medellín Alfonso Esteban Jiménez Gaviria. Universidad Pontificia Bolivariana Facultad de Medicina 3th Semester

2. Introduction In this study used Strains 2192 (mucoid) Strains 383 (non-mucoid) were isolated from sputum days apart from the patient with CF FIGURE 1 Phenotypesof P.aeruginosa CF isolates383and2192on L agarmedia. Streaks ofstrains383and2192wereculturedonLagarfor 24 hat37˚C.Thesetwostrainswereisolatedwithin2daysapartfroma CF patient.Previousdataindicatedthesestrainsareisogenic(Hanna etal., 2000). Thegenomeofstrain2192hasbeensequenced1 (Mathee etal., 2008).

3. Strains 2192 (mucoid) Strains 383 (non-mucoid) Alginate Unbranched linear polymer of parcially acetylated β -mannuronic acid and it´s C5 epimer α -guluronic Introduction Synthesis: Begins: cytoplasm Ends: extracellular algD: alginate biosynthesis operon algC: encode enzymes required for synthesis of alginate

4. Factor MucA Biosynthetic are controlated by Production of alginate Degradation ineffective elimination of P.A in the CF lung conversion to the alginate mucoid, over expressing phenotype provides these bacteria additional protection from antibiotics and phagocytic killing Introduction

5. Introduction Variants of P.aeruginosa Establish as dominant pathogens in chronic lung diseases of CF patients. Contribute to the lung infection of CF patients. Alginate over production

6. GENERALITIES

12. Cystic Fibrosis

13. CFTR Gene CFTR Encode the synthesis of a protein transports chloride across cells transports Cl- across cells Cl- H2o Filling of water and production of viscous mucus.

14. Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator

17. MATERIALES Y MÉTODOS

18. MATERIALES Y MÉTODOS CEPAS

22. MATERIALES Y MÉTODOS Espectrometría de masas en tándem La espectrometría de masas es una técnica de análisis basada sobre la separación de acuerdo a sus razones masa/carga de las especies cargadas formadas a partir de la ionización de una muestra, los puntos individuales de proteinas se cortaron de los geles y fueron analizados utilizando el algoritmo SEQUEST de busqueda para encontrar Pseudomonas midiendo su peso (masa).

23. MATERIALES Y MÉTODOS DETERMINAR EL PESO DE LA PROTEINAS POR MEDIO DE ELECTROFORESIS UTILIZANDO ANTICUERPOS. Técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en muestras determinadas Se trata de analizar Pseudomonas aeruginosa el las cepas 383 y 2192 que crecieron en L-agar a 37ºC

24. RESULTADOS

27. Resultados FENOTIPO MUCOIDE Metabolismo para producción de alginato Este análisis proteomico indicó que la motilidad de Alginato regulador Z (Amrz), algF, algD y algC, fueron sobre reguladas en la cepa 2192 Amrz: cinta de union al ADN de helice-helice de proteínas que actúa como represor transcripcional algC: enzima que cataliza fosfomanomutasa, segundo paso en la via del alginato, la cual estaba en la cepa 2192 algD: precursor del acido polimanuronico algF: proteína que funciona al acetilar residuos del acido manurónico. Acetilacion de prop fisicas e inmunes del alginato.

28. Cuando P. aeruginosa produce en exceso el alginato No hay gran demanda en el metabolismo central para producir los intermediarios metabólicos y como combustible para la alta demanda de energía para la producción de Alginato Resultados

29. Resultados TssB1(PA0083) TssC1(PA0084) Hcp1 (PA0085) Tienen mayores niveles de expresion en no mucoide 383 que en la 2192 Canal por donde pasan macromoleculas Cepa 383 Tiene mayor expresión de la mayoría de los operón Se sobreregulan en no mucoide, derivados de las mucoides CF T6SS

30. Resultados Relación inversa entre el T6SS y el fenotipo mucoide de la P.Aeruginosa Usa para competir con otras bacterias y aumentar la amplitud de la P. Aeruginosa para la infección del pulmón de la CF. La adición de este fenotipo mucoide a este modelo presenta un cuadro por el que el no mucoide inicia la infección y el fenotipo mucoide surge, después de que la infección crónica puede ser establecida, negando de la necesidad de T6SS

31. Análisis 2 DE electroforesis Resultados Éste análisis da el tamaño y el pI de las proteínas aisladas 383 2192 Para visualizar diferencias entre las proteínas de cada cepa, éstas fueron separadas y se visualizaron manchas con expresión diferencial El tamaño previsto y el pl se compara con la de las secuencias de proteínas de larga duración

32. Resultados Indica las proteínas que son los mas abundantes en un lugar sin corazón No sugiere que una proteína se abundante, sino que identifica péptidos que pueden corresponder a proteínas de cualquier lugar en núcleo. PMM MS-MS

33. Resultados Reveló dos proteínas de la membrana externa OprH OprF Fuerón expresadas diferencialmente entre las cepas 383 y 2192 OprH Mas abundante en la cepa mucoide 2192

34. Resultados Un punto diferencial de proteínas teñidas entre las cepas 2192-383 es una proteína conservada (PA0460) PA0460 Es 5 veces sobreregulada cuando sensor elimina la cepa PAO1 PA0315 Proteína conservadora en la 2192 PA0315 en la cepa 2192

35. T A M A Ñ o Carga Pr- Bacterianas de Pseudomonas aeruginosa

38. Discussion AUTHOR WHAT HE /SHE SAID AGREE DESAGREE Winsor Bioinformatics analysis of the 297 proteins recognized from iTRAQ analysis allowed funtional classifications as defined by the Pseudomonas genome database X Guina Of the quantified 297,81 proteins showed significant p values in either one or both iTRAQ replicates. In comparison with earlier studies of other P.aeruginosa strains. X

42. Elaborado por: Iliana Medellín