Tecnicas de biologia molecular en UCI
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- 20. Infeccion Quemaduras, isquemia, pancreatitis Sepsis Bacteremia Adapted from Crit Care Med 1992;20:864-874 .
- 21. El tiempo y adecuado diagnostico es vital… la sepsis es una enfermedad progresiva SRIS Falla Multiples organos Sepsis Sepsis Severa Shock Septico 6 - 17 % 16 % 20 % 46 % > 60 % Temperatura > 38 < 36 FC > 90 ppm FR > 20 o PCo2 < 32 GB > 12000 < 4000 SRIS + Lugar infeccion o fuerte sospecha SRIS + Disfuncion de organo, hipoperfusion o hipotension SRIS + hipoperfusion e hipotension Current Definitions According to the “2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference”. Levy et al. (2003) CritCare Med 31: 1250 –1256 Mortalidad
- 22. El tratamiento empirico inicial muchas veces es inadecuado Tratamiento antibiotico inicial Adecuado Inadecuado Ibrahim Harbarth Kolleft
- 23. Dias 1 2 3 4 5 50 60 70 80 90 % de pacientes recibinedo tratamiento adecuado Inadequate treatment from day 1 to day5 (prospective study); BouzaE. et al, CID 2004/39/1161 Los clinicos necesitan diagnostico rapido!
- 24. Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Cultivo PCR 6H Hemocultivo Septi Fast Especies Resistencia: mecA Gram Especies Resistencia
- 25. S eptiFast . Roche Diagnostic Resistencia: mecA
- 27. 50%
- 28. 1. Medir el á cido láctico 2. Obtener cultivos de sangre antes de iniciar los antibióticos 3. Administrar antibióticos de amplio espectro en las primeras 3 horas del ingreso a la emergencia o en 1 hora desde otro servicio El objetivo es realizar todas las indicaciones el 100% de las veces en las primeras 6 horas de la identificación de la sepsis TENDRAN UN LUGAR LAS TECNICAS DE PCR TR?
- 29. Microbiological diagnosis of sepsis: comparison between real-time polymerase chain reaction and blood culture techniques Simona Barnini , Carlotta Dodi and Mario Campa Dipartimento di Patologia Sperimentale, Biotecnologie Mediche, Infectivologia ed Epidemiologia, Unità Operativa di Microbiologia, Università di Pisa, Pisa, Italy Critical Care 2007, 11 (Suppl 4) : P41doi:10.1186/cc6020
- 30. Numero de organismos detectados Numero de muestras 10 20 30 27 30 147 muestras 51 pacientes con sepsis 30 hemocultivos positivos 27 positivos por PCR En el 76 % de los casos mismo resultado. Prueba multiplex fue mas rapida que el cultivo el 97% de los casos Critical Care 2007, 11(Suppl 4):P41doi:10.1186/cc6020
- 32. Reaccion en cadena de la Polimera por Multiplex para la deteccion de bacteremia y fungemia Louie, Richard F. PhD; Tang, Zuping MD; Albertson, Timothy E. MD, PhD; Cohen, Stuart MD; Tran, Nam K. BS; Kost, Gerald J. MD, PhD Crit Care Med. 2008 May;36(5):1487-92. Polimicrobiana 9 “ PCR es una técnica coadyuvante a los métodos tradicionales de cultivo, en facilitar la detección temprana de microorganismos en sepsis .”
- 33. Utility of a Commercially Available Multiplex Real-Time PCR Assay To Detect Bacterial and Fungal Pathogens in Febrile Neutropenia J Clin Microbiol. 2009 August; 47(8): 2405–2410. Marie von Lilienfeld-Toal, 1,2†* Lutz E. Lehmann, 3† Ansgar D. Raadts, 3 Corinna Hahn-Ast, 1 Katjana S. Orlopp, 1 Günter Marklein, 4 Ingvill Purr, 4 Gordon Cook, 2 Andreas Hoeft, 3 Axel Glasmacher, 1 and Frank Stüber 5 Results of blood cultures and PCR during antimicrobial therapy Pathogen N (%) of positive Results By No. of FNEs (no. initially positive) Blood culture PCR None 113 (97) 565 (84) Staphylococcus aureus 0 32 (4.8) 19 (6) Staphylococcus species (CoNS) 2(1.8) 13 (1.9) 9 (2) Enterococcus faecium 0 14 (2.0) 6 (1) Enterococcus faecalis 0 3 (0.4) 1 (1) Escherichia coli 0 6 (0.9) 4 (3) Pseudomonas aeruginosa 0 14 (2.0) 3 (1) Stenotrophomonas maltophilia 1(0.9) 4 (0.6) 3 (2) Candida krusei 0 1 (0.1) 1 (0) Candida albicans 0 8 (1.2) 2 (0) Aspergillus fumigatus 0 9 (1.3) 5 (1) Total positive (%) 3% 15%
- 34. Utility of a Commercially Available Multiplex Real-Time PCR Assay To Detect Bacterial and Fungal Pathogens in Febrile Neutropenia J Clin Microbiol. 2009 August; 47(8): 2405–2410. Marie von Lilienfeld-Toal, 1,2†* Lutz E. Lehmann, 3† Ansgar D. Raadts, 3 Corinna Hahn-Ast, 1 Katjana S. Orlopp, 1 Günter Marklein, 4 Ingvill Purr, 4 Gordon Cook, 2 Andreas Hoeft, 3 Axel Glasmacher, 1 and Frank Stüber 5
- 35. Rapid Detection of Methicillin-Resistant Staphylococci from Blood Culture Bottles by Using a Multiplex PCR Assay L. Louie, 1* J. Goodfellow, 1 P. Mathieu, 2 A. Glatt, 2,3 M. Louie, 1,4† and A. E. Simor 1,4 Sunnybrook and Women's College Health Sciences Centre, 1 University of Toronto, Toronto, Ontario, Canada, 4 St. Vincent Catholic Medical Centers, Brooklyn/Queens Region, Jamaica, 2 New York Medical College, Valhalla, New York 3 J Clin Microbiol. 2002 August; 40: 2786–2790. Organism type No. of strains Expected PCR results a (16S/ mecA/nuc ) Direct PCR results, 16S/ mecA/nuc (no. of isolates) CoNS, b methicillin resistant 107 +/+/− +/+/− (100); −/+/− (7) CoNS, methicillin susceptible 73 +/−/− +/−/− (71); −/−/− (2) MSSA 36 +/−/+ +/−/+ (34); −/−/+ (2) Total 223
- 36. Rapid Detection of Methicillin-Resistant Staphylococci from Blood Culture Bottles by Using a Multiplex PCR Assay L. Louie, 1* J. Goodfellow, 1 P. Mathieu, 2 A. Glatt, 2,3 M. Louie, 1,4† and A. E. Simor 1,4 Sunnybrook and Women's College Health Sciences Centre, 1 University of Toronto, Toronto, Ontario, Canada, 4 St. Vincent Catholic Medical Centers, Brooklyn/Queens Region, Jamaica, 2 New York Medical College, Valhalla, New York 3 J Clin Microbiol. 2002 August; 40: 2786–2790.
- 37. A multicenter trial to compare blood culture with polymerase chain reaction in severe human sepsis Frank Bloos, Frank Hinder, Karsten Becker, Svea Sachse, Armand Mekontso Dessap, Eberhard Straube, Vincent Cattoir, Christian Brun-Buisson, Konrad Reinhart, Georg Peters, Michael Bauer Intensive Care Med.2010 Feb; 36(2):193-5
- 38. A multicenter trial to compare blood culture with polymerase chain reaction in severe human sepsis Frank Bloos, Frank Hinder, Karsten Becker, Svea Sachse, Armand Mekontso Dessap, Eberhard Straube, Vincent Cattoir, Christian Brun-Buisson, Konrad Reinhart, Georg Peters, Michael Bauer Intensive Care Med.2010 Feb; 36(2):193-5
- 39. A multicenter trial to compare blood culture with polymerase chain reaction in severe human sepsis Frank Bloos, Frank Hinder, Karsten Becker, Svea Sachse, Armand Mekontso Dessap, Eberhard Straube, Vincent Cattoir, Christian Brun-Buisson, Konrad Reinhart, Georg Peters, Michael Bauer Intensive Care Med.2010 Feb; 36(2):193-5
- 40. A multicenter trial to compare blood culture with polymerase chain reaction in severe human sepsis Frank Bloos, Frank Hinder, Karsten Becker, Svea Sachse, Armand Mekontso Dessap, Eberhard Straube, Vincent Cattoir, Christian Brun-Buisson, Konrad Reinhart, Georg Peters, Michael Bauer Intensive Care Med.2010 Feb; 36(2):193-5
- 42. Detecci ó n Temprana Activaci ó n del C ó digo Reanimaci ó n Inicial Traslado a UCI
Notas del editor
- La magnitud del avance tecnológico en el área de la genética y técnicas de biología molecular ha alcanzado niveles sin precedentes en los últimos años y más aún, siguen incrementándose exponencialmente. Lo cual esta teniendo y tendrá en un futuro próximo, importantes implicaciones dentro de la practica clínica , principalmente en diagnóstico y seguimiento de enfermedades, en la determinación de riego de presentar distintas situaciones patológicas; como por ejemplo, enfermedades cardiovasculares, metabólicas y oncológicas, entre otras; así como, importantes implicaciones desde el punto de vista terapéutico.
- Uno de los retos de la medicina actual es como realizar la transición de toda esta tecnología propia del área de investigación, al área de la práctica clínica. . Este proceso de transición es precisamente el que nos encontramos viviendo en la actualidad . Algunas técnicas se encuentran ya aplicándose ampliamente en el área clínica, sobre todo en los países desarrollados, otras están comenzando a aplicarse y otras se encuentran todavía en fase desarrollo . Cualquiera que sea su fase evolución todas estas técnicas han tenido o tienen que resolver algunos problemas para que estén disponibles en la práctica clínica. Los mas relevantes ellos es la: Simplificación tecnológica, Automatización del los procesos que permita su aplicación a gran escala, Abaratamiento de los costos, Entrenamiento del recurso humano en el manejo de la tecnología e interpretación de los resultados Y por último manejo de problemas o dilemas éticos que pueden plantearse en la aplicación de la tecnología.
- Simplificación tecnológica, Automatización del los procesos que permita su aplicación a gran escala, Abaratamiento de los costos, Entrenamiento del recurso humano en el manejo de la tecnología e interpretación de los resultados Y por último manejo de problemas o dilemas éticos que pueden plantearse en la aplicación de la tecnología
- Desde el punto de vista diagnostico se han venido aplicando distintas técnicas de bilogía molecular en diferentes áreas de la practica clínica; sin embargo, en tres de ellas es donde se han desarrollado con mayor éxito y tienen ya un puesto establecido. En el área genética propiamente, la cual es la pionera y esta dirigida al estudio de todo lo relacionado con la reproducción, herencia y conjunto de fenómenos y problemas relacionados con la descendencia En el área hemato-oncológica. Que actualmente se encuentra en plena ebullición esta orientada al estudio de la determinación susceptibilidad o riesgo de desarrollar algún proceso hemato- oncológico, mediante la determinación de la presencia de oncogenes. Genotipificación de tumores o procesos mieloproliferativos, predicción de respuesta a agentes quimioterapéuticos determinados; así como, seguimiento de enfermedades neoplásicas.
- Por último el área de diagnostico microbiológico . Su aplicación surge, ya hace varias décadas, como una necesidad para poder detectar microorganismos de difícil crecimiento en cultivos o desarrollados tardíamente, donde las técnicas serológicas de detección anfígeno- anticuerpo carezcan de suficiente sensibilidad y especificidad, lo cual, se ajusta principalmente a la detección de virus, es por ello, que el desarrollo de las técnicas moleculares comenzó en esta área y posteriormente se ha desarrollado a los otros microorganismos: micobacterias, hongos, parásitos y bacterias.
- . Las primeras técnicas de BM utilizada para determinar la presencia de micropatogenos en la muestras clínicas data de los años 70 se basaban en el mismo principio de las actuales, que es la hibridación, es decir unión de pares de base complementarias, entre cadenas de ADN, si bien es cierto presentaban una alta especificidad eran muy poco sensibles debido a la poca cantidad de ADN que existia en las muestras .
- En la década de los 80 se describe la técnica de amplificación del ADN o Reacción de Cadena Polimeraza, realizada a través de una enzima polimerasa termoestable, descrita por Kary Mullis, la cual permite la amplificación de un fragmento de ADN o ARN en vitro. Esta técnica revoluciono, entonces la B M, apartir de lo cual mejoró significativamente la sensibilidad, conjuntamente con el desarrollo de los sistemas de identificación del ADN
- Sin embargo comenzó a surgir el inconveniente, en el tiempo, de cómo realizar la cuantificaciones de microorganismos donde la cantidad de la muestra nunca era suficiente para realizar esa determinación; así como, la necesidad de generar los resultados en un tiempo más corto y cada vezas exactos. Lo cuál dio origen a las técnicas moleculares de Tiempo Real. Estas técnicas permiten ir detectando el producto de la amplificación a medida que se va formando
- Mediante esta técnica un fluoróforo donador, excitado por una fuente de luz externa (azul), emite luz (verde) absorbida por un segundo fluoróforo próximo a él, denominado aceptor. Este aceptor emite luz (rojo) a una longitud de onda distinta del donador, y ésta luz puede medirse. Este principio es la base del protocolo en el que se utilizan las llamadas Sondas de Hibridación
- Mediante esta técnica un fluoróforo donador, excitado por una fuente de luz externa (azul), emite luz (verde) absorbida por un segundo fluoróforo próximo a él, denominado aceptor. Este aceptor emite luz (rojo) a una longitud de onda distinta del donador, y ésta luz puede medirse. Este principio es la base del protocolo en el que se utilizan las llamadas Sondas de Hibridación
- Mediante esta técnica un fluoróforo donador, excitado por una fuente de luz externa (azul), emite luz (verde) absorbida por un segundo fluoróforo próximo a él, denominado aceptor. Este aceptor emite luz (rojo) a una longitud de onda distinta del donador, y ésta luz puede medirse. Este principio es la base del protocolo en el que se utilizan las llamadas Sondas de Hibridación
- Los pacientes con neutropenia febril son son tratados con antibioticos de amplio espectro indiferentemente del resultado de los cultivos debido a la alta mortalidad de esta condicion si no se indican los antibioticos de forma temprana. Sin embargo, hay causas en estos pacientes de fiebre no infecciosa persistente, la cual dificil de diferenciar de problemas infecciosos. Nonetheless, patients with FNEs are treated with broad-spectrum antimicrobial agents regardless of the result of their blood culture (7) because potentially life-threatening infections need early treatment to ensure better clinical outcome, such as tumor fever, drug fever, or transfusion reactions complicate the diagnostic challenge in cancer patients Noninfective causes of a systemic reaction culminating in a rise in temperature. In addition, the etiology of a deterioration of an FNE during antimicrobial therapy is often difficult to elucidate, since blood cultures are infrequently positive once effective antimicrobial therapy has started