Tecnología Medica, Laboratorio clinico, ELISA

1. ELISA
Enzyme – Linked Immuno Sorbent Assay

2. Elisa
• Método descubierto por Engvall e Perlmann em 1971;
• Método de reacción Ag/Ac monitoreado por actividad
enzimática;
• Utiliza como princípio la inmobilización de dos reactivos
en uma fase sólida, en el que uno u otro puede ser ligado a
una enzima.

3. Tipos de Fase Sólida:
• Placa de microtitulaçión: poliestireno transparente
• Pérola: esfera plástica
• Membrana: nitrocelulose nylon, policrilamida, dextran,o
etc.

4. Tipos de Antígenos
• Lisado viral: virus obtenido de cultivos celulares habiendo
posibilidad de falsos positivos
• Peptídeo sintético: secuencia de nucleotídos do DNA,
peptídos
• Recombinante: fragmento do genoma viral en bacterias.
Produçción de antígenos correspondientes a partícula viral
intacta;

5. Rectivos

6. Enzima
• Alta atividade específica;
• ser de fácil cuantificación;
• alto coeficiente de extinción molar;
• ser estable
• obtenida de forma purificada;
• conjugada a varios Ags/Acs
• preçio accessible
• ej.: peroxidasa o fosfatasa alcalina

7. Lavativos
• Tampón Fosfato – Tween 20 a 0,05%.
• Soluçión de Urea o aminas básicas – Pesquisa de Acs.

8. Conjugados
• Utilizar Acs de alta afinidade e purificados - Ex: Acs Monoclonales

9. Sustrato
• Substrato – Ex: Peróxido de Hidrogênio ( H2O2 );
• Cromógenos o dadores de Hidrogeno:
• Ortofenilenodiamina ( OPD )
• Tetrametilbenzidina ( TMB )

10. Lectura
• Medir densidade óptica (fotômetro multicanal);
• 490 nm – 492 nm

11. Tipos de Ensayo
Imunoenzimático
• Indireto: detecçión y medida de Acs;
• Antígeno adsorvido a placas;
• Suero (muestra);
• Adiçión de conjugado;
• Sustrato

12. Tipos de Ensayo
Imunoenzimático
• Competitivo: detecçión y
medida de Ags/Acs;
• Ac específico a placa;
• Suero;
• Ag marcado con enzima;
• Sustrato;
• Cor – Ag marcado;
• Inibiçión de core – Ag
(muestra).

13. Tipos de Ensayo
Inmunoenzimático
• Sanduich o Captura;
• Detecçión medida de Ags;
• Ac en placa;
• Suero;
• Acs específico como enzima;
• Sustrato.

14. Vantagem do Test de Elisa
• Alta sensibilidade;
• Basico costo
• Detección de antígenos y anticuerpos
• Cuantificaçión de anticuerpos ( bacterianas, fungicas y
virales
• Automatizado.

16. Automatización

30. Bioseguridad

31. Virus de Imunodeficiencia Humana:
Consideraçiones Generales sobre Especificidade y
Sensibilidad de Métodos Laboratoriais para la Detecçión de
Anticuerrpos y Antígenos Específicos
Dept. de Virologia – FIOCRUZ – RJ
Autores: Simonetti, SRR; Carvalho, VF; Reche, C; Reynald, MD.
• 483 muestras de suero de 196 HIV positivo transfundidas;
• Referidas muestras son análisadas como reacciones inespecíficas com
o Elisa de III generación;
• Análise de 1318 muestras de gestantes
• 51 de hemodialisados;
• 66 hepatopattías
• 73 pares de crianzas com anti - HIV

32. • das 483 amostras da população pediátrica analisada
registrou-se reações inespecíficas para os testes
imunoenzimáticos (1,03%);
• amostras de genstantes / hepatopatas apresentaram
reatividade inespecífica equivalente a 3,9% e 3%;
• amostras analisadas pelos métodos Imunoenzimático e W.
Blot;
Resultados

33. • apartir dos valores de inespecificidade para anticorpos
contra HIV analisado de soro de adultos e crianças
conclui-se sobre a necessidade da utilização de 02 testes de
diferentes procedências em uma primeira coleta;
• deve-se aplicar o uso do teste de Elisa de 4o. geração ao
diagnóstico da infecção por HIV. Identificação da fase
aguda de indivíduos asintomáticos.
• janela imunológica antecipada de 4 a 12 dias em
comparação à Elisa de 3o. Geração;
Conclusão