2. BIOTECNOLOGIA

3. CONOCIMIENTO CIENTIFICO Bioquímica Ingeniería Bioquímica Microbiología Biología Molecular Biología Celular Computación Genética Inmunología Fisiología HERRAMIENTAS BIOTECNOLOGICAS Biosensores Antisentido Bioprocesos Ingeniería de proteínas Anticuerpos monoclonales Cultivo de células y tejidos Ingeniería genética MEDICINA AMBIENTAL AGROPECUARIO Rendimiento de cosechas Salud animal Calidad de alimentos Diagnóstico Vacunas Terapéutica Biorremediación Monitoreo ambiental Control de la polución APLICACIONES UTILES

4. Nos encontramos frente a una nueva “Revolución Industrial” llamada Biotecnología, no basada en hierro y acero sino en microbios que, en manos de científicos, se convierten en minúsculas fábricas para producir fármacos, compuestos químicos industriales, combustibles o alimentos.

5. El prefijo “ BIO ” se refiere a bacterias, levaduras y otras células vivas, así como a componentes de estas células. La “ TECNOLOGIA ” consiste en relucientes depósitos de acero, llenos de microbios, conectados a sus fuentes de alimentación y oxígeno mediante una intrincada red de válvulas que se cierran y abren según los ritmos que marca una computadora.

6. DEFINICION Según la Organización de Cooperación y Desarrollo Económicos: Es la aplicación de los principios científicos y de la ingeniería al procesamiento de materiales por agentes biológicos para proveer bienes y servicios.

14. HISTORIA DE LA BIOTECNOLOGIA

17. Hablando de “generación espontánea”, veamos algunas recetas interesantes…

18. Ambroise Paré (1517-1590), el más célebre cirujano de su siglo, escribe: “Hallándome en una viña de mi propiedad, próxima al pueblo de Meudon, hice romper una enorme cantidad de grandes piedras sólidas. Dentro de una de ellas se encontró un grueso sapo vivo, sin que hubiera en la piedra la menor apariencia de abertura…

19. … Me maravilló el hecho de que este animal hubiese podido nacer, crecer y vivir allí. Pero el cantero me dijo que no había por qué asombrarse, pues varias veces había hallado animales de ésta y de otras clases en lo más recóndito de las piedras, sin que existiese el menor indicio de una abertura. Se puede explicar así el nacimiento y la vida de estos animales: son engendrados a partir de alguna sustancia húmeda de las piedras, cuya humedad, al entrar en putrefacción, produce tales seres.”

20. Van Helmont (1577-1644), el más grande fisiólogo de la época, indica lo siguiente para la obtención de ratones: un vaso lleno de trigo se cubre con una camisa sucia, preferentemente de mujer. “Un fermento originado en la camisa y transformado por el olor de los granos, convierte el trigo mismo en ratones.” Esta metamorfosis dura cerca de veintiún días, o sea el tiempo de gestación de ratón y nuestro naturalista se asombre de su notable rapidez…

21. …” Ello, nos dice, es tanto más admirable cuanto que los ratones originados por el trigo y la camisa no son pequeños ni lactantes, ni minúsculos, ni deformes, sino muy bien formados y pueden saltar.”

24. Hasta la primera guerra mundial, apenas progresó la idea de utilizar bacterias y levaduras para fabricar otra cosa que no fuera alcohol. Sin embargo, las restricciones impuestas durante el conflicto anunciaron lo que puede llamarse como “segunda era biotecnológica.”

28. Un hito que merece resaltarse ocurrió en 1982 cuando la compañía Eli Lilly consiguió la aprobación de la Food and Drug Administration de los Estados Unidos de Norteamérica para la utilización de “insulina humana” clonada y producida en Escherichia coli. A esto siguieron los interferones, hormonas de crecimiento humana y bovina, el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B, etc.

29. Entrando ya en tema…

30. El desarrollo de un proceso de producción a gran escala, en forma exitosa, es el resultado de acelerar e intensificar un concepto original, generalmente un procedimiento de laboratorio o a pequeña escala.

32. EL FERMENTADOR

34. En cuanto al biorreactor: Para cada proceso biotecnológico, el sistema de contención más apropiado debe diseñarse para brindar el mejor medio ambiente, optimizado para el crecimiento celular y actividad metabólica.

37. AIREACION Y AGITACION. La agitación es necesaria para: 1- incrementar la velocidad de transferencia de oxígeno desde las burbujas de aire al medio líquido; los microorganismos no pueden utilizar oxígeno gaseoso, sino solamente el que se encuentra en disolución.

38. 2- aumentar la velocidad de transferencia de oxígeno y nutrientes desde el medio a las células. Debido al movimiento se evita que las células creen áreas estancadas con bajos niveles de oxígeno y nutrientes. 3- impedir la formación de agregados celulares. 4- aumentar la velocidad de transferencia de productos metabólicos de las células al medio.

39. 5- aumentar la tasa o la eficiencia de la transferencia de calor entre el medio y las superficies de refrigeración del fermentador.

48. En el crecimiento en suspensión, los organismos están sumergidos y dispersados en el medio nutritivo y su movimiento sigue al del medio. En los sistemas con soporte,los organismos crecen como una monocapa o película sobre una superficie en contacto con un medio nutritivo. En la práctica, sin embargo, los sistemas en suspensión poseen una película de organismos en la superficie del contenedor y en sistemas con soporte, encontramos organismos dispersos en el medio nutritivo.

49. TECNOLOGIA DE BIOPROCESOS - FERMENTACION

50. Las etapas en la manufactura de productos en la tecnología de bioprocesos son, esencialmente, similares independientemente del organismo utilizado, del medio elegido y del producto buscado.

51. En todos los ejemplos, se cultiva gran número de células en condiciones controladas. Los organismos deben cultivarse y “motivarse” para formar el producto deseado, mediante un sistema de contención técnica y física (el biorreactor) y un medio correcto en su composición y parámetros reguladores del crecimiento, tales como temperatura y aireación.

52. PRINCIPIOS DE CRECIMIENTO MICROBIANO

53. El crecimiento de microorganismos puede verse como el incremento en el material celular, expresado en términos de masa o número de células. El incremento en biomasa puede determinarse gravimétricamente o numéricamente para sistemas unicelulares.

54. Tiempo de duplicación: Se refiere al tiempo requerido para duplicar el peso de la biomasa. Tiempo de generación: Se refiere al tiempo necesario para duplicar el número de células.

55. En un proceso biotecnológico, existen tres formas de hacer crecer a los microorganismos en un biorreactor: -Por lotes (batch) -Semi-continuo -Continuo

57. El ambiente nutricional dentro del biorreactor cambia en forma continua y, por lo tanto, fuerza cambios en el metabolismo celular. Eventualmente, la multiplicación celular cesa por desaparición o limitación de nutrientes y acumulación de productos tóxicos de excreción.

58. La naturaleza compleja del crecimiento de microorganismos por lotes, se muestra tal como sigue:

59. La fase 1 o “lag”, es un tiempo de aparente no crecimiento, pero estudios bioquímicos demuestran actividad metabólica, indicando que las células están en proceso de adaptación a las condiciones ambientales y que un nuevo crecimiento comenzará, eventualmente.

60. Existe, luego, una fase de aceleración transitoria cuando el inóculo comienza a crecer que es seguida, rápidamente, por una fase de crecimiento exponencial. En la fase exponencial, el crecimiento microbiano ocurre a la máxima velocidad posible para ese microorganismo, con nutrientes en exceso, parámetros de crecimiento ideales y ausencia de inhibidores.

61. Sin embargo, en cultivos por lote, el crecimiento exponencial es de duración limitada y, a medida que las condiciones nutricionales cambian, la velocidad de crecimiento disminuye y se entra en la fase de deceleración, seguida de la fase estacionaria, donde el crecimiento global no se obtiene, por falta de nutrientes.

62. La fase final del ciclo es la fase de muerte, cuando la velocidad de crecimiento ha cesado. La mayoría de los procesos biotecnológicos por lotes se detiene antes de esta fase, debido a la disminución en el metabolismo y a la lisis celular.

63. Algunos medios para prolongar la vida de un cultivo por lotes: -Adición gradual de componentes nutritivos concentrados (carbohidratos), aumentando el volumen del cultivo (utilizado para producción industrial de levadura). -Adición de medio al cultivo (perfusión) y extracción de un volumen igual de medio usado, libre de células (utilizado para cultivos de células animales).

66. Los organismos pueden separarse de la corriente que lleva al producto y reciclarse para inocular el líquido de alimentación. En un sistema continuo con mezcla completa, las condiciones son uniformes en todo el reactor, en un equilibrio de mezcla de nutrientes, organismos y productos. La alimentación del sistema es medio nutriente libre de organismos y, en algunos casos, un inóculo de organismos reciclados.

67. Esta práctica de cultivo continuo, provee un crecimiento casi balanceado, con pequeña fluctuación de nutrientes, metabolitos, número celular o biomasa. Esto consiste en medio fresco entrando un sistema por lotes, en fase de crecimiento exponencial, con una remoción correspondiente de medio más células.

68. Este método de cultivo continuo, permite a los organismos crecer en condiciones de estado estacionario, en las que el crecimiento ocurre a una velocidad constante y en un medio ambiente constante.

69. En un sistema de cultivo perfectamente mezclado, se pasa medio estéril al biorreactor, a un flujo constante y una mezcla de cultivo (medio, productos de desecho y organismos) emergen del mismo a la misma velocidad, manteniendo el volumen total del cultivo, dentro del biorreactor, constante.

70. Ventajas de un proceso por lotes: Las principales son: menor riesgo de contaminación, flexibilidad operacional cuando los fermentadores se utilizan para distintos productos, un control más cercano de la estabilidad genética del organismo, una mejor coordinación con estadios del proceso entre lotes previos y posteriores.

71. Desventajas del proceso por lotes: La principal es la alta proporción de tiempo improductivo en la operación del fermentador, dificultad de diseño y la operación de procesos que no están en estado estacionario y la variabilidad entre lotes.

72. Los fermentadores deben ser vaciados, limpiados, esterilizados y recargados antes de cada fermentación, operaciones todas esenciales pero no productivas. En procesos por lotes, estas operaciones pueden tomar tanto tiempo como la fermentación misma. En un proceso continuo, por el contrario, una corrida puede durar semanas o meses, es decir que el tiempo no productivo es, en proporción, pequeño.

76. -Cambio de escala -Dise ño de medios para procesos de fermentación -Fermentación en sustratos sólidos -Tecnología de cultivos de células de plantas y animales -Procesamiento posterior de la muestra Pasos a tener en cuenta:

77. Procesamiento posterior de la muestra. Purificaci ón.

78. El diseño y la operación eficiente de los procesos de purificación, son elementos vitales para obtener los productos deseados para uso comercial. Deberían reflejar la necesidad de no perder más que lo absolutamente necesario del producto final.

79. Este procesamiento final involucrará, principalmente, la separación inicial de la mezcla de cultivo hacia una fase líquida y una sólida, con la subsecuente concentración y purificación del producto deseado.

80. El procesamiento involucrará más de una etapa: -Destilación -Centrifugación -Filtración -Ultrafiltración -Extracción con solventes -Adsorción -Tamices moleculares -Electroforesis -Cromatografía de afinidad -Liofilización

81. TECNOLOGIA UTILIZANDO ENZIMAS

82. La tecnología de enzimas involucra la producción, aislamiento, purificación, uso en forma soluble y, finalmente, la inmovilización de las enzimas para su utilización en gran variedad de biorreactores.

83. La utilización de sistemas enzimáticos libres de células, presenta ventajas respecto de los procesos químicos que involucran un número de reacciones secuenciales. En fermentación, el uso de microorganismos como catalizadores puede presentar las siguientes limitaciones:

85. INGENIERIA GENETICA E INGENIERIA PROTEICA DE ENZIMAS

86. La utilización de estas técnicas ha posibilitado producir enzimas industriales con muy buena calidad y pureza.

87. Crecimiento de microorganismos conteniendo la enzima de utilidad Purificación de la enzima Determinación de la secuencia parcial de aminoácidos Síntesis de oligonucleótidos Identificación de clones Transformación de microorganismos Producción industrial de enzima mARN ADN Purificación de mARN total Clonación del ADN en E. coli

89. ENZIMAS INMOVILIZADAS

90. El uso de enzimas en forma soluble o libre, debe considerarse como un posible derroche dado que, en general, la enzima no puede recuperarse al final de la reacción. Una nueva área de tecnología enzimática es la relacionada con la inmovilización de las enzimas en polímeros insolubles, tales como membranas o partículas, actuando como portadores de la actividad enzimática.

92. ESTERILIZACION Y ESTERILIDAD

93. La esterilización es el proceso de conseguir la esterilidad, para la que no existen grados: un objeto, superfcie o sustancia es, o no es, estéril. Si es estéril no contiene organismos viables o células presentes y, si se le protege contra la contaminación, la condición estéril permanecerá indefinidamente. La desinfección implica que el material ha sido tratado a fin de eliminar o reducir el riesgo de organismos patógenos, pero no implica que todos los organismos viables hayan sido inactivados.

96. Las esporas bacterianas resisten el calor (termófilas: 200 kPa a 134 o C, 1-10 min, vapor de agua o calor seco a 180 o C, 15 min) y, algunas, las altas dosis de radiación (Deinococcus radiodurans: 6000 krad). La esterilización debe ser capaz de eliminar las esporas más resistentes de las especies más resistentes.

98. En la esterilización por calor seco, el calor es transferido muy lentamente y la tendencia es reducir más el nivel de hidratación y, de esta forma, se protegen las proteínas de las esporas. Las esporas son considerablemente más resistentes al calor seco que al calor húmedo.

99. Radiación La radiación ultravioleta no es muy penetrante y no se puede confiar en ella como agente esterilizante, a menos que se pueda garantizar la exposición directa del organismo contaminante. Los rayos gamma y X son más útiles debido a su alto poder de penetración.

102. Métodos prácticos: Calentamiento: Para comparar las capacidades relativas de esterilización de los diferentes procesos de calentamiento, se requiere una unidad de letalidad. La unidad escogida es el efecto letal de un minuto de calentamiento, a la temperatura de 121 o C. F = t * 10 (T-121)/z Donde t = tiempo de aplicación del tratamiento letal; T = temperatura en o C y z = aumento de temperatura requerido para reducir el período de calentamiento en un 90% (es decir el valor z).

103. En la industria alimentaria el peligro más serio para la salud es la presencia de Clostridium botulinum, el formador de esporas patogénico más resistente al calor, así como el agente más tóxico. En esterilización clínica: Calor húmedo: Vapor a 134 o C (30 psi), 3 min Vapor a 126 o C (20 psi), 10 min Vapor a 121 o C (15 psi), 15 min Vapor a 115 o C (10 psi), 20 min

104. Como los valores de D para las esporas son, a 121 o C, del orden de 0,2 min, un tiempo de mantenimiento de 15 min de vapor a 121 o C equivale a 75xD, lo que hace la probabilidad de fallo en relación a la supervivencia de C. botulinum casi imposiblemente remota.

105. Procesos discontinuos: Autoclaves: Todo el aire debe ser eliminado antes del ciclo de calentamiento, ya que mezclas de aire y vapor a una presión determinada alcanzarán una temperatura más baja que la del vapor puro a la misma presión.

106. Inyección directa del vapor: Si se utilizan inyecciones directas de vapor se debe tener en cuenta que entre el 10 y el 20% del volumen final se deberán a condensación. Mientras la eficiencia térmica de este proceso es alta, la fuerte formación de espuma durante el burbujeo puede limitar la transferencia del calor.

107. Calentamiento indirecto: Pasando vapor de agua a través de una espiral de intercambio de calor o de una camisa. El calor en este procedimiento es menos eficiente que por inyección directa y, en ambos casos, permanecen los problemas de enfriamiento, generalmente conseguido mediante espirales.

110. Esterilización por radiaciones: Normalmente se lleva a cabo con una fuente de cobalto-60 o de cesio-137. El efecto letal es siempre mayor en presencia de oxígeno y alto contenido en agua. La unidad de medida de la dosis de radiación es el rad, equivalente a una energía de absorción de 100 ergs/g de aire. El Roentgen (R) es 83 ergs/g de aire.