tecnicas histologicas

1. TÉCNICAS HISTOLÓGICAS
DRA. PATRICIA CONTRERAS VERA
MEDICO PATÓLOGO
FACULTAD DE MEDICINA HUMANA
UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO
E.A.P DE MEDICINA
CÁTEDRA DE HISTOLOGÍA

2.  Histología.
 Concepto y aplicaciones Científicas y clínicas.
 Técnica Histológica.
 Etapas en la preparación de tejidos para su estudio
al microscopio óptico.
 Histoquímica y Citoquímica
 Microscopía.
INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO DE LA HISTOLOGÍA Y MORFOLOGÍA CELULAR
Objetivo General :
Especificar las herramientas que utiliza la
Histología para el estudio ultraestructural de
tejidos y de la célula como unidad morfológica y
funcional del organismo
Contenido:

3. ¿QUE ES LA HISTOLOGÍA?
Marcello Malpighi es reconocido como el fundador de la
Histología. Las primeras investigaciones histológicas se hicieron
en el siglo XVII gracias a la invención del microscopio óptico por
Antonio Van Leeuwenhoek
Etimológicamente: histo= tejido logos: estudio
Es la rama de la Biología encargada del análisis microscópico de
la anatomía celular y tisular de los tejidos biológicos.

4. ¿QUÉ ES LA ANATOMÍA?
Anatomía Macroscópica: Estudio de las estructuras observables a simple vista.
Anatomía Microscópica: Es aquella que requiere de auxiliares ópticos.
Es el estudio de la forma y la estructura de los organismos vivos organizados
Es una disciplina académica que se encarga del estudio de las células en
cuanto a lo que respecta a las propiedades, estructura, funciones, organelos
que contienen, su interacción con el ambiente y su ciclo vital.
¿QUÉ ES LA CITOLOGÍA o BIOLOGÍA CELULAR?

6. La Histología representa un nexo de unión
entre la Bioquímica, la Fisiología, la
Anatomía, la Genética, la Clínica y la
Patología.

7. TÉCNICA HISTOLÓGICA
ES EL CONJUNTO DE PROCEDIMIENTOS REALIZADOS PARA OBTENER
PREPARADO HISTOLÓGICO

8. PREPARADO HISTOLÓGICO:
Es una rebanada de tejido colocada sobre una lámina
portaobjetos, coloreada y cubierta por una lámina
cubre-objetos.

9. TÉCNICA HISTOLÓGICA

10. DEFINICIÓN:
La técnica histológica, es el conjunto de operaciones a que se
somete una materia organizada, a fin de posibilitar su estudio al
microscopio.

11. Técnicas Histológicas:
Se realizan una serie de pasos para la preparación del tejido
para su posterior estudio en el microscopio
La técnica mas comúnmente utilizada en los laboratorios de
histotecnología es la de la Parafina.
Están relacionadas con los avances de la microscopía.

12. Pasos de la Técnica:
1. Obtención de la muestra
2. Fijación de la muestra
3. Deshidratación
4. Aclaramiento
5. Inclusión
6. Corte
7. Coloración
8. Montaje
Para su realización se efectúan una serie de pasos secuenciales
ordenados:

13. 1. Obtención de la Muestra:
Puede provenir el material humano:
 las necropsias,
 las biopsias
 las piezas quirúrgicas.
De éstas, sólo la primera puede darnos material normal; las dos
últimas proporcionarán tejidos patológicos.

14.  Necropsias: son las piezas que se obtienen de un cadáver.
 Biopsias: tejido que se obtienen de un sujeto con vida con el objeto
de estudiarlos al microscopio y efectuar un diagnóstico
histopatológico.
 Piezas operadas: los tejidos que han sido extraídos de las
intervenciones quirúrgicas, generalmente tumores u órganos
inflamados, también pueden darnos material de investigación pero,
como en el caso anterior, sólo servirán para anatomía patológica

15. Obtención de la Muestra:
Autopsias-Necropsias
Tipos:
 Medicolegales
 Hospitalarias
Biopsias
Tipos
 Incisionales
 Excisionales
 Transoperatorias
 Por Aguja
Citología Exfoliativa

16. BIOPSIA:
 Es un procedimiento realizado
con el propósito de obtener
tejido o células del cuerpo para
examinarlos con el microscopio.

17. Biopsias:

18. Tipos de biopsias:
 La biopsia endoscópica.
 La biopsia de la médula ósea.
 La biopsia excisional o inscisional.
 La biopsia de aspiración por medio de una aguja fina.
 Una biopsia de perforación.
 La biopsia de raspado.
 La biopsia de la piel.

19. PACIENTE REALIZANDOSE
ENDOSCOPIA
RESULTADO DE LA BIOPSIA
ENDOSCOPISTA TOMANDO MUESTRA

21. Los sitios comunes para las biopsias son:
 La médula ósea.
 Los senos.
 El tracto gastrointestinal.
 El riñón.
 El hígado.
 El pulmón.
 Los nódulos linfáticos.
 La piel.
 La tiroides.
 El cerebro.

22. Después de una biopsia, la muestra de tejido se envía a una de las
siguientes áreas de la Anatomía Patológica para que la examinen y la
analicen:
 La patología quirúrgica.
 La citología.
 La autopsia.

23. BIOPSIA POR CONGELACION:
Técnica utilizada para evaluar inmediatamente el tejido obtenido
durante el acto quirúrgico para poder tomar una conducta
terapéutica con el diagnostico anatomopatologico.
PASOS:
1. Congelación de la muestra del tejido
( anhídrido carbónico).
2. Corte del tejido congelado (criostato)
3. Tinción de los cortes
H-E y azul de metileno
El proceso dura unos 10 minutos

24. BIOPSIAS TRANSOPERATORIAS:
Se realiza rápidamente durante el acto
quirúrgico para decidir un conducta médico
quirúrgica.
El tejido en fresco sin fijación se congela a altas
temperaturas con la utilización de un aparato
llamado CRIOSTATO.

25. BIOPSIAS POR CONGELACIÓN- CRIOSTATO
Criostato: Consta de un micrótomo tipo Minot
incluido en una cámara de congelación. El
volante de inercia que controla la realización del
corte permanece en el exterior, mientras que la
cuchilla y el mecanismo de avance están
situados dentro de la cámara fría (normalmente
a -20º C).

26. Citología Exfoliativa:
Utilidad:
 Descarta Malignidad
 Determinación de Sexo
 Estudio Hormonal

27. CITOLOGÍA EXFOLIATIVA:
 Citología exfoliativa: estudio citológico
de las células exfoliadas de un órgano en
comunicación con el exterior o fácilmente
accesible: cérvix y/o vagina, bronquios,
mucosa oral, estómago.

28. CITOLOGIA EXFOLIATIVA O PAPANICOLAU
 Es una técnica que nos sirve para detectar precozmente
el cáncer cervicouterino.

29. Citología cervicovaginal:
 La toma citológica cervicovaginal consiste en pasar suavemente un
algodón y una espátula de madera por el cuello uterino
El procedimiento es indoloro.
 El moco obtenido que contiene células se deposita en un pequeño
cristal (portaobjetos) y se tiñe con diversos colorantes. Más tarde se
examinan al microscopio las características de forma, tamaño,
coloración..., etc., que tienen las células.
 Distintas células de aspecto normal.

30. CITOLOGIA EXFOLIATIVA
Los pasos a seguir en la toma de citología son:
 Anamnesis y registro para citología.
 Preparación de las láminas.
 Toma de la muestra utilizando espátula de
madera o plástico para el exocérvix y cepillo
para el endocérvix, teniendo en cuenta:
 No hacer tacto vaginal antes de la toma de la
muestra.
 Usar espéculo sin lubricante.
 Exponer muy bien el cérvix.
 Limpiar el exceso de flujo con torunda de
algodón.
PAPANICOLAU

31.  Extender la muestra en forma adecuada para que quede
delgada.
 Fijar la muestra utilizando cito-spray, fijador comercial o
alcohol al 95%.
 Identificar adecuadamente la lámina.
 Informar a la usuaria sobre la importancia de reclamar
oportunamente el resultado.

32. 1. Infección:
- Vaginosis Bacteriana
- Tricomonas
- Clamydia
- Herpes
2. Otros:
- Cambios reactivos
- Cambios reparativos
- Inflamación por atrofia
CITOLOGIA EXFOLIATIVA

33. Citología Cervicovaginal:

34. La biopsia dirigida y el curetaje endocervical pueden arrojar cualquiera
de los siguientes resultados anatomopatologicos:
· Negativa para neoplasia
· Infección por VPH
· NIC de bajo grado: NIC I
· NIC de alto grado: NIC II, NIC III
· Neoplasia microinfiltrante: escamocelular o adenocarcinoma
· Neoplasia infiltrante: escamocelular o adenocarcinoma

35. CITOLOGÍA
EXFOLIATIVA
CITO BRUSCH

36. • La citología exfoliativa oral se define como
el estudio e interpretación de los
caracteres de las células que se
descaman, natural o artificialmente, de la
mucosa oral.
• Consiste en observar al microscopio la
morfología de las células epiteliales
superficiales después de su toma, fijación
y tinción.
• Es una técnica sencilla, no agresiva,
relativamente indolora y bien aceptada por
los pacientes, por lo que podría ser útil en
el diagnóstico precoz del cáncer oral.

38. 2. FIJACION:
La fijación tiene por objeto la conservación celular,
evitando su destrucción.
Por lo tanto es un método histológico destinado a
obtener preparados duraderos que conservan la
estructura morfológica y química de las células.

39. FIJACIÓN:
La fijación tiene por objetivo:
 Mantener el tejido en estado natural
y evitar su desintegración o su
autolisis.
 Endurecer el material.
 Eliminar bacterias u otros agentes.
Fijación de la muestra.

40. FIJADORES:
 Se llaman fijadores a las sustancias químicas o a los agentes
físicos que se utilizan para tal fin.
Cualidades que debe tener un fijador:
1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las células antes de que
aparezcan los fenómenos agónicos o post-mortem (autólisis,
desintegración, etc.).
2. Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta
hasta en las capas profundas de la pieza a fijar.
3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban
in vivo.

41. 4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para
su observación ulterior (ejecución de cortes, coloración, etc.).
5. No provocar o impedir la producción de estructuras artificiales.
6. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o
quebradizos

42. • Fijación por inmersión:
el tejido se sumerge en las
soluciones fijadoras.
• Fijación por perfusión:
El órgano que debe fijarse, se
infiltra con el medio de fijación a
través de su propio sistema
vascular.
TIPOS DE FIJACION

43. Tipos de fijadores Físicos y Químicos
FIJADORES FÍSICOS:
1. Desecación
2. Calor seco.
3. Calor húmedo.
4. Frío.
5. Congelación y desecación.

44. Fijadores Químicos:
FIJADORES SIMPLES:
a) Formol al 10%, es el más usado. Su empleo es aconsejable en todos los
casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se
trata de fijar órganos o tejidos para estudios histológicos topográficos.
b) Alcohol etílico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microquímica.
c) Alcohol metílico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados
(sangre, médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc.).
d) Ácido ósmico al 1 o 2%, es poco penetrante pero enérgico, conserva muy
bien estructuras celulares.
e) Bicromato de potasio al 3-5%.

45. FIJADORES COMPUESTOS:
a) Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-acética.
b) Líquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-acética.
c) Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol.
d) Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética

46. 3. DESHIDRATACION:
 Las piezas al ser retiradas del fijador, o
después de haberlas lavado, están
embebidas en agua; impidiendo que sean
penetradas por la parafina.
 Por lo tanto, en primer lugar, debemos
deshidratar los tejidos sumergiéndolos en
líquidos anhidros, ávidos de agua.
 Para evitar alteraciones provocadas por
una deshidratación brusca, se aconseja
proceder escalonadamente utilizando,
preferentemente, alcohol etílico de
graduación creciente.
Deshidratación en alcoholes
sucesivos

47. 4. ACLARAMIENTO:
Impregnación por un disolvente de la parafina
 Las piezas perfectamente deshidratadas se sumergen en el
disolvente, xilol o toluol (este último es el que nosotros
utilizamos). Al agregar el xilol, no debe aparecer ninguna
turbidez.
 Si se pone blanco-lechoso es que la deshidratación no ha sido
bien lograda y debemos repetir el baño de alcohol absoluto.

48. PENETRACIÓN EN PARAFINA
Penetración de la parafina
 Se sumergen las piezas en
parafina (56-58º de punto de
fusión), mantenida líquida en la
estufa a no más de 62ºC.
 Después de 1 a 2 horas se
renueva la parafina.

49. 5. Inclusión en parafina:
Inclusión definitiva o formación del bloque:
 En moldes de papel o de metal ad-hoc
(barras de Leuckart) se vierte la
parafina fundida, del mismo punto de
fusión de la que ha servido para la
penetración.
 Se colocan las piezas orientándolas y
luego se pone el molde en heladera.
 A los 15-30 minutos la parafina se
habrá solidificado completamente.

50. 6. CORTE:
 El objeto de la inclusión es hacer posible la
reducción del tejido a cortes lo
suficientemente delgados como para
permitir el paso de la luz para examinarlo al
microscopio.
 Los micrótomos son instrumentos de gran
precisión que nos proporcionan cortes
delgados parejos y de espesor graduable.
 Los cortes más corrientes son los de 4-6
micras.

52. Tipos de Microtomo:
- Tipo deslizamiento: en este caso la pieza queda fija mientras la
cuchilla se desliza por unas guías especiales merced a un soporte al
que se sujeta la cuchilla con unos tornillos.
- Tipo Minot: en este caso la cuchilla queda fija y es la pieza la que se
desliza sujeta a una platina, ésta se desliza verticalmente cuando se
hace girar una manivela. Permite obtener cortes seriados en forma de
cinta.
- Tipo Criostato

53. 7. Coloración:
Clasificación de los colorantes:
Según su origen se clasifican en:
COLORANTES NATURALES:
- Animales (carmín)
- Vegetales (hematoxilina, orceína, azafrán)
COLORANTES ARTIFICIALES O SINTÉTICOS (COLORES DE ANILINA):
- Ácidos: Sales cuya base es incolora y su ácido es coloreado (eosina o eosinato de sodio). Son colorantes
citoplasmáticos.
- Básicos: Sales cuya base es coloreada y el ácido es incoloro (azul de metileno o clorhidrato de azul de
metileno). Son colorantes nucleares.
- Neutros: Sales en las que tanto el ácido como la base son coloreados. Tiñen el núcleo de un color y el
citoplasma de otro.
- Indiferentes: No forman sales. Tiñen aquellas sustancias que tienen un poder disolvente superior al del
líquido que ha servido para preparar la solución colorante (Sudán lll, rojo escarlata).

54. COLORACIÓN:
Las coloraciones pueden ser:
- Ortocromáticas: los tejidos adquieren un color igual al de la
solución colorante empleada.
- Metacromáticas: una sustancia o un componente celular se tiñe
con un color diferente al del colorante empleado.

55. COLORACION:
Colorantes más utilizados en histología humana:
HEMATOXILINA:
- Es un colorante vegetal.
Para ser utilizada debe ser oxidada previamente. Los agentes
oxidantes pueden ser: el aire (varios meses de exposición) u oxidantes
artificiales (óxido de mercurio, permanganato de potasio, dicromato
potásico, etc.)
- Es un colorante directo, pero en la práctica se lo utiliza en forma de
lacas hematoxilínicas (se utiliza alumbre de potasio o de sodio como
mordiente para preparar la solución colorante), comportándose en este
caso como un colorante indirecto.
EOSINA:
- Es un colorante artificial (se trata de derivados hidroxixanténicos
halogenados con tres grupos arilo).
-Presenta autofluorescencia espontánea.
- Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohólicas.
Para colorear se emplea generalmente una batería de coloración.

57. Imagen de microscopía óptica de una sección de piel humana
teñida con Hematoxilina-Eosina, con un aumento de 40x.

59.  PAS (Ácido Peryódico de Schiff): Tiñe carbohidratos
(mucopolisacáridos) de color rojo, por ejemplo las células
caliciformes en el intestino.
 Tricrómico de Masson: Tiñe de color azul la colágena, de rojo la
queratina, y de morado los núcleos (muy utilizada para los cortes de
piel).
 Nissl: Tiñe de color morado el retículo endoplásmico rugoso y los
corpúsculos de Nissl en las neuronas.

60. COLORANTES Y REACCIONES HISTOLOGICAS COMUNES
REACTIVO RESULTADO
Hematoxilina Azul: núcleo; regiones acidas del
citoplasma; matriz del cartílago
Eosina Rosa: regiones básicas del citoplasma;
fibras de colágena.
Tricómica de Masson Azul oscuro: núcleo
Rojo: musculo, queratina, citoplasma
Azul claro: mucinógeno, colágena.
Acido peryóico de Schiff Magenta: moléculas ricas en glucógeno y
carbohidratos.
Colorante de Wright y Giemsa
(células sanguíneas)
Rosa: eritrocitos, gránulos de eosinófilos
Azul: citoplasma de monocitos y linfocitos.

61. T
i
n
c
i
o
n
e
s
h
i
s
t
o
l
ó
g
i
c
a
s
REACTIVO NUCLEOS CITOPLASMA FIBRAS
COLAGENAS
FIBRA
ELASTICAS
Hematoxilina y
Eosina (H-E)
Azul violeta Rojo o Azul violeta
(ribosomas y
RER)
Rojo Sin tinciön o rosa
Azan Rojo brillante Rosa palido o azul
tenue.
Azul Sin tinciön o rojo a
azul rojizo
(abundan,
ligamentos.
Para elastina
(resorcina-fucsina
u orcreina)
Negro violeta (r-f)
o rojo pardo (o)
Van gieson Azul negro Amarillo o
parduzco claro.
Rojo Sin tinciön
especial
Tricomica de
Goldner
Pardo negro Rojo ladrillo. Verde Sin tinciön.
EH (hematoxilina
ferrica) de
Heindenhain.
Heterocromatina y
nucleolo azul
negro
Centriolos,
cinocilios,
Sin tinciön
especial o gris
amarillento.
Gris tenue.

62. Tinciones histoquímicas
Reacción de PAS Tinción rojo violeta. El acido
peryodico grupos aldehídos en el
glucógeno y el los componentes
sacáridos de las glicoproteínas.
El reactivo de Schiff los tiñe de
rojo violeta
Azul alciano Tinción azul. Polianiones: moco
sulfatado, glucosaaminoglucanos,
hialuranos.
Lípidos (Sudan III, Negro, aceite rojo
0)
Naranja-rojo o pardo… Lípidos
Tinción d Feulgen para ADN Tinción purpura
Azul de toluidina Tinción azul. Tiñe la cromatina
(ADN), el nucléolo y los ribosomas.

63. INMUNOHISTOQUIMICA
ES UNA TECNICA DE COLORACION QUE PERMITE
DETECTAR IN SITU COMPONENTES CELULARES O
EXTRACELULARES (ANTIGENOS), POR MEDIO DE
ANTICUERPOS ESPECIFICOS, EMPLEANDO PARA ELLO,
SISTEMAS DE DETECCION ENZIMATICOS.

65. 8. Montaje:
 Luego de la coloración, se deshidrata el corte y se procede a la
aclaración y montaje definitivo, dado que nos hemos propuesto hacer un
preparado en condiciones de ser observado y protegido del ambiente
para evitar su deterioro.
 La deshidratación se realiza con alcoholes de graduaciones crecientes.
 La aclaración se realiza con xilol.
 El objetivo de este paso es impregnar el corte con un disolvente del
Bálsamo de Canadá, que al mismo tiempo le confiere un índice de
refracción semejante al del vidrio.
 Para el montaje se limpia el portaobjeto alrededor del corte y se deposita
sobre el mismo una gota de Bálsamo de Canadá disuelto en xilol y se
cubre con un cubreobjeto.

66. Reglas Básicas para el diagnóstico
de un preparado Histológico
 Mírese el preparado a simple vista: Determinar si es un órgano
macizo o hueco, bordes son artificiales o naturales.
 Mírese con el microscopio con el aumento menor y determinar si hay
una organización definida ( Corteza y Medula).
 Examínese todo el corte minuciosamente con los aumentos menor-
mediano.
 Procédase descripción de formas, disposición, coloración,
relaciones, comparaciones , identifique y defina.
 Solo utilícese gran aumento para detalles celulares.

67. A TRAVES DE LOS PREPARADOS
HISTOLOGICOS DESCRIBIR,
IDENTIFICAR, COMPARAR,
CLASIFICAR, DEFINIR,
EXPLICAR E INTEPRETAR.