Manual de laboratorio de inmunologia ULA

Manual de prácticas de inmunología
MANUAL DE PRÁCTICAS
DE INMUNOLOGÍA
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOANÁLISIS
ESCUELA DE BIOANÁLISIS
CÁTEDRA DE INMUNOLOGÍA
PROF. BENIBELKS ALBARRAN
PROF. ZULAY LABRADOR
PROF. CESAR PEREZ MALDONADO
TECNICO: REINALDO LOPEZ
MÉRIDA, FEBRERO 2013

Índice pag
Normas Internacionales de Bioseguridad 1
Normas de Bioseguridad en el laboratorio de
Inmunodiagnóstico
2
Instrucciones para descartar material 3
Practica 1 órganos y células del sistema inmunológico 4
Práctica 2. Células que participan en el proceso inflamatorio 8
Práctica 3. Detección de inmunoglobulina G por
inmunodifusión radial 11
Práctica 4. Inmunodiagnóstico de la infección por Treponema
pallidum mendiante la prueba VDRL
16
Práctica 5. Detección del factor reumatoide por la prueba de
látex
22
Práctica 6. Determinación del título de antiestreptolisina O
(ASO) mediante la inhibición de la hemólisis
25
Práctica 7.- Determinación de anticuerpos anti- Toxoplasma
gondii por inmunofluorescencia indirecta
29
PRÁCTICA 8. Determinación de anticuerpos anti- toxoplasma
gondii por hemoaglutinación pasiva
33
PRÁCTICA 9. ELISA (enzyme linked inmuno sorbent assay)
para la detección de IgE
39
NORMAS INTERNACIONALES DE
BIOSEGURIDAD PARA LABORATORIOS
CLÍNICOS
-Es obligatorio el uso de:
 Bata manga larga
 Guantes
 Zapatos cerrados
 Cabellos recogidos
 Dispositivo para pipetear (Propipeteador)
 PROHIBIDO PIPETEAR CON LA BOCA
- No se permite el uso del teléfono celular en el
laboratorio.
- Lavarse las manos al finalizar el trabajo de
laboratorio.
- Acatar las instrucciones para el uso de cada
instrumento del laboratorio.
- Descartar el material en el sitio adecuado, de
acuerdo con las instrucciones sugeridas.
- Mantener ordenado el área de trabajo y una vez
finalizada la actividad, descontaminarla con una
solución con cloro.
- En el área de trabajo está prohibido:
 Ingerir, preparar o almacenar alimentos.
 Fumar.
 El acceso y la permanencia de niños y otras
personas no adscritas al servicio.
 El acceso de personas con mascotas.
Nota: El uso de los guantes y de las batas, queda
restringido solo para los ambientes dentro del
laboratorio.
1

NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL
LABORATORIO DE INMUNODIAGNÓSTICO
- Cumplir con las normas internacionales de
Bioseguridad.
- Colocar los bolsos y otros útiles en el estante
indicado.
- Traer el manual de prácticas, propipeteador y
estuche con lápices, marcadores y bolígrafos de
uso exclusivo para el laboratorio.
- Al finalizar cada sesión de trabajo:
 Descartar el material de acuerdo con las
instrucciones.
 Colocar el resto de materiales y reactivos en el
sitio de trabajo.
 Descontaminar el área de trabajo con solución
con cloro.
 Quitarse la bata de laboratorio.
 Lavarse las manos en el sitio indicado.
INSTRUCCIONES PARA DESCARTAR
MATERIAL EN EL LABORATORIO DE
INMUNODIAGNÓSTICO
- Descartar las muestras de suero provenientes de
tubos y pipetas, en el envase que contiene una
solución de jabón y cloro.
- Descartar las pipetas de vidrio, puntas de las
pipetas de precisión y los dispensadores de plástico
en el envase de mayor tamaño que contiene una
solución jabonosa.
- Descartar las soluciones de los tubos de vidrio en el
envase que contiene jabón y cloro.
- Colocar los tubos en la bandeja que contiene una
solución jabonosa.
- Lavar las láminas de vidrio con agua de chorro,
seguido de una solución jabonosa.
- Enjuagar bien con agua de chorro y luego con agua
destilada.
- Colocar las láminas en posición vertical sobre papel
absorbente para su secado.
LOS TELÉFONOS CELULARES DEBEN SER
APAGADOS EN:
 Áreas de trabajo de los laboratorios.
 Salones de clase.
 Reuniones de trabajo.
2 3

PRÁCTICA 1. ÓRGANOS Y CÉLULAS DEL SISTEMA
INMUNE
El Sistema inmune consta de una serie de
órganos, tejidos y células ampliamente
repartidos por todo el cuerpo. Funcionalmente,
los órganos se clasifican en primarios y
secundarios.
I. Órganos linfoides primarios o
centrales, que
A. proporcionan el entorno para la
maduración de linfocitos
(linfopoyesis), de modo que los
linfocitos adquieren su repertorio de
receptores específicos para cada tipo
de antígeno;
B. los linfocitos se seleccionan de modo
que poseen autotolerancia (evitación
de la autoinmunidad).
Los órganos linfoides primarios son:
el timo, donde maduran los linfocitos T
la médula ósea en el adulto como órgano de
maduración de los linfocitos B
En el feto temprano esta función la toma el
hígado, aunque paulatinamente se ve
sustituido por la medula.
En las aves, el equivalente funcional de la
médula es la Bolsa de Fabricio.
II. Órganos linfoides secundarios o
periféricos, que
A. proporcionan el entorno para que los
linfocitos interaccionen entre sí, o
con las APC y otras células
accesorias, y para que entren en
contacto con el antígeno;
B. diseminan la respuesta inmune al
resto del cuerpo.
Los órganos linfoides secundarios
son:
los ganglios linfáticos, que recogen Ag de
los tejidos
el bazo, que recoge Ag de la sangre
tejidos linfoides asociados a mucosas
(MALT), que recogen Ag de las mucosas
en la respuesta secundaria, la médula ósea
actúa igualmente como órgano secundario
Por otra parte, se sabe que todas las células del
sistema inmune se desarrollan a partir de las células
pluripotenciales presentes en la médula ósea. La
diferenciación de los glóbulos blancos se da a través
de dos principales vías. La línea linfoide que genera a
linfocitos T, B y células asesinas naturales (NK) y la
línea mieloide que a su vez produce dos estirpes
celulares, los granulocitos y los monocitos. Los
primeros están representados por neutrófilos,
eosinófilos y basófilos. La estirpe monocítica genera a
su vez a los monocitos/macrófagos.
54

Material y métodos
Reactivos Materiales
Solución salina fisiológica (SSF)
Cajas de Petri
PBS
Bulbos de succión
Alcohol
Portaobjetos
Azul de Tripano
Cubreobjetos
Tubos de ensayo de 13 x 100 mm
Centrífuga
Microscopio
Material proporcionado por el alumno
Ratones BALB/c
Estuche de disección
Navajas para rasurar
Gasas
Dos jeringas de 5 mL
Procedimiento
1. Una vez sacrificado el ratón se procede a
observar los órganos protegidos por la cavidad
torácica, localizar el timo (se encuentra en el
mediastino descansando sobre la parte apical
del corazón, en la región anterior de los grandes
vasos)
2. El bazo se localiza en la cavidad peritoneal. Se
procederá a extirpar el órgano. Separar este
órgano del tejido conectivo que lo fija al
estómago y al intestino delgado.
3. El bazo extirpado es depositado en una caja de
Petri que contiene 4 mL de PBS o Solución
Salina Fisiológica.
4. Posteriormente, se homogeniza el bazo con el
apoyo de dos agujas dobladas en la punta y
acompañadas de las jeringas.
5. Con la pipeta Pasteur se toma el material
celular, se colocado en un tubo de ensayo de
13 x 100 mm (capacidad de 10 mL) y se
centrifuga a 1500 rpm por 10 minutos a
temperatura ambiente.
6. Se decanta el sobrenadante. Se extrae el
paquete celular para ser observado en el
microscopio. En un portaobjetos se agrega una
gota de suspensión celular y una gota de Azul
Tripano al 3 %, se coloca el cubreobjetos y se
observa al microscopio. Las células que captan
el Azul Tripano presentan muerte celular.
Cuestionario:
1. ¿Cuál es la función del sistema inmunológico?
2. Realice un esquema donde mencione cuáles son los
órganos del sistema inmunológico?
3. Esquematice la ontogenia de las células del Sistema
Inmunológico?
4. Resalte la importancia de esta práctica en su
formación como futuro bioanalista.
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PRÁCTICA 2. CÉLULAS QUE PARTICIPAN EN EL
PROCESO INFLAMATORIO
La inflamación es una de las primeras respuestas del
sistema inmune que se da por la presencia de un
agente externo, como bacterias, radiaciones,
traumatismos, toxinas, alteraciones vasculares
(isquemia) o alteraciones inmunitarias. Los síntomas
clásicos de la inflamación son calor, dolor, rubor y
tumor. El rubor y el calor se deben a un aumento del
flujo sanguíneo en el área lesionada y a la constricción
de las vénulas. Los cambios de la microcirculación son
inducidos por mediadores químicos. Estos mediadores,
además, aumentan la permeabilidad capilar con lo que
los líquidos y las células sanguíneas pasan al espacio
extravascular provocando tumefacción y un aumento
de la presión local que es el que origina el dolor.
Ante un proceso inflamatorio se lleva a cabo la
migración o extravasación de leucocitos mediante un
proceso preciso pero complejo, en el que participan en
forma concertada y secuencial diversas moléculas tales
como histaminas, 5-hidroxitriptamina, prostaglandinas
(prostaflandina E2, PGE2), prostaciclinas, troboxanos
(troboxano A2, TXA2), leucotrienos (B4, LTB4).
Citoquinas (como TNFa, IL-1), Factores que
quimiotacticos (como IL-8) y se induce la expresión de
moléculas de adhesión, tales como las selectinas P y
E, la molécula de adhesión intercelular-1 y el receptor
de integrinas VCAM-1 que hacen posible el desarrollo
de las siguientes fases:
Interacción y adhesión inicial de los leucocitos
con el endotelio
Rodamiento de leucocitos sobre el endotelio
Activación de los leucocitos
Adhesión firme al endotelio y
Extravasación y migración transendotelial a tejidos.
Los leucocitos (neutrófilos, monocitos o linfocitos)
migran hacia otros tejidos y órganos abandonando el
torrente sanguíneo y/o retornan a él desde la periferia.
Las células que primero llegan al foco inflamatorio son
los neutrófilos, después lo hacen los monocitos y los
linfocitos.
Luego de la infiltración de las células sanguíneas, se
produce el crecimiento del tejido fibroso en días o
semanas que ayuda a la cicatrización y resolución de la
inflamación
PRINCIPIO BÁSICO DEL MÉTODO
Una óptima respuesta inflamatoria generada por una
molécula o patógeno extraño depende de los
mecanismos efectores de los mediadores de la
inflamación y de las células que participan en este
proceso de tal forma que se resalta la importancia de
conocer e identificar los principales componentes que
participan en dicha respuesta.
MATERIALES Y MÉTODO
Material que proporcionará el laboratorio
Colorante Wrigth
Portaobjetos
Agua destilada
Caja de Petri
Cubreobjetos
98

Alcohol
Material que deberá traer el alumno
Un paquete de algodón
Cinta micropore
PROCEDIMIENTO
1. Seleccionar a una persona por grupo.
2. Con un portaobjeto estéril se hará una lesión de
raspado en la piel del antebrazo previamente
desinfectado con alcohol.
3. Colocar una lámina cubreobjeto sobre la lesión.
Fijar con una cinta adhesiva micropore.
4. La lámina cubreobjeto se cambia a las 2, 6, 12, 24 y
48 horas, identificando cada una de ellas
5. Se procederá a realizar la tinción de Wrigth-Giemsa
Cuestionario:
1. Defina que es inflamación
2. Explique los tipos de inflamación
3. ¿Cuál es el fundamento de la tinción Wrigth?
4. Describa detalladamente las cuatro etapas de
extravasación de los leucocitos.
PRÁCTICA 3. DETECCIÓN DE
INMUNOGLOBULINAS POR
INMUNODIFUSIÓN RADIAL
Las inmunoglobulinas (lgs) o anticuerpos constituyen el
componente humoral de la respuesta inmune
específica en todos los vertebrados. En el humano se
reconocen cinco clases o isotipos de lgs denominados
lgG, IgA, lgM, lgD e IgE, diferenciables gracias a las
propiedades es tructurales y antigénicas particulares de
sus cadenas pesadas. Debido a su gran
heterogeneidad estructural y funcional (probablemente
la más notable de todas las proteínas séricas) las Igs
solamente pueden ser cuantificadas mediante técnicas
inmunoquímicas entre las que se se destacan tres: la
inmunodifusión radial, la inmunoelectroforesis en
cohete o electroinmunoensayo, y la
inmunonefelometría.
Fundamento de la Inmunodifusión radial:
La prueba de inmunodifusión radial para uso clínico fue
introducida por Mancini en 1965. La técnica se basa en
la difusión de la muestra conteniendo el antígeno a
medir (inmunoglobulinas ó antígenos solubles) en una
matriz semisólida de agar en la que se encuentra
disuelto el anticuerpo específico. La muestra biológica
se introduce en los orificios cilíndricos excavados en el
agar y a medida que el antígeno difunde en forma
radial, se alcanza la relación Ag-Ac que permite la
formación de precipitados visibles. Una vez finalizada
la difusión se mide el diámetro (D) de los precipitados
que es proporcional a la concentración de antígeno (C).
La concentración de proteína en la muestra biológica
(Cx) se calcula realizando una curva de calibración
10 11

utilizando muestras patrones de concentración
conocida.
Aplicación Clínica
La prueba de inmunodifusión radial se emplea para la
cuantificación de inmunoglobulinas, componentes del
complemento, diversas proteínas como fetoproteínas,
lactoferrinas, proteínas de fase aguda que se
encuentran presentes en plasma y otros fluidos
biológicos (saliva, líquido cefalorraquídeo), donde la
concentración de estas sustancias pueden sufrir
alteraciones debido a diversas patologías, las cuales
incluyen: enfermedades del colágeno vascular,
inmunodeficiencias primarias y secundarias y procesos
infecciosos de origen viral, bacteriano o parasitario.
Principio del método para la detección
Inmunoglobuilinas.
la inmunodifusión radial se basa en la difusión libre de
la muestra en un gel que contiene los anticuerpos
contra la Ig que se desea cuantificar, lo que da lugar a
la formación de un anillo o halo de precipitación
alrededor del punto de aplicación, cuya área guarda
proporcionalidad con la concentración de antígeno en
la muestra.
La cuantificación de las lgs séricas tiene interés tanto
desde el punto de vista clínico como de investigación.
Sus principales indicaciones clínicas son:
a) En el estudio por inmunodeficiencia, ya sea primaria
o secundaria, sugerida por infecciones frecuentes y/o
debidas a microorganismos de baja virulencia.
b) En la vigilancia de pacientes que sufren formas
graves de hipogammaglobulinemia y que reciben
terapia de sustitución con preparaciones de lgs.
c) Para distinguir las gammapatías monoclonales
idiopáticas “benignas” de las paraproteinemias
causadas por mielomas.
d) Para ayudar al diagnóstico de infecciones
congénitas, la determinación de IgM en sangre de
cordón de recién nacidos. En otras condiciones
patológicas esta determinación posee actualmente muy
poco valor diagnóstico y su realización obedece más
bien a fines de investigación.
Material que deberá traer el alumno
Papel milimetrado
Materiales, equipos y reactivos:
Materiales Equipos Reactivos
Placas plásticas de
fondo plano
Micropipetas
(5-200 µL)
Moldes para la
perforación de geles
Baño de María a
56 ºC
Cámara húmeda
Base niveladora
Visor graduado
Lámpara con
fondo oscuro
Antisuero C4
Buffer fosfato
salino (PBS)
pH 7.2
12 13

Base niveladora Baño de María
Método:
Preparar las placas plásticas de fondo plano,
dividirlas en 4 cuadrantes, rotularlas y colocarlas
sobre una superficie perfectamente nivelada.
Colocar 2 mL de agarosa (previamente
preparada VER ANEXO 1).
Dejar solidificar a temperatura ambiente e
incubarlas en cámara húmeda.
Perforar los pozos con una cánula de 12 G 5
mm de diámetro dejar una separación de unos
20 mm entre cada pozo (ver esquema)
Agregar 5 µL de las muestras y los controles en
el pozo correspondiente, tapar bien la placa,
dejarla en reposo a temperatura ambiente
durante 15 minutos.
Incubar la placa en cámara húmeda a
temperatura ambiente por 48 horas.
Placa y visor de precisión
La lectura se realiza con la ayuda del visor de
precisión, el cual permite medir el diámetro de
los halos de precipitación alrededor de cada
pozo. Anotar la lectura y determinar la
concentración de las muestras en la gráfica de
referencia (VER ANEXO 2).
Cuestionario:
1. Mencione los factores que influyen el las pruebas
de precipitación
2. Explique las diferentes pruebas de difusión pasiva
3. ¿Mencione cuales son los valores normales de IgM
y explique en que patologías puede aumentar o
disminuir?
14 15

PRÁCTICA 4. INMUNODIAGNÓSTICO DE LA
INFECCIÓN POR Treponema pallidum
mendiante la prueba VDRL
La prueba de los Laboratorios de investigación de las
enfermedades venéreas VDRL por sus siglas en ingles
es de tipo tamizaje para sífilis y mide los anticuerpos
reagínicos, los cuales son producidos en la sífilis como
resultado de la interacción de la bacteria causante de
dicha enfermedad (Treponema pallidum) y el propio
cuerpo del paciente. Este examen es una herramienta
de tamizaje útil para la sífilis, aunque su capacidad de
detección depende de la etapa de la enfermedad. En la
etapa más temprana (sífilis primaria), el examen es
reactivo en aproximadamente el 60% de las ocasiones.
Su utilidad aumenta en etapas posteriores como sífilis
secundaria y sífilis latente donde puede ser positivo en
el 70 a 90% de las ocasiones; en las etapas finales
(sífilis terciaria) el examen es reactivo en sólo el 60%
de los casos.
Actualmente existen diferentes técnicas para el
diagnóstico serológico de sífilis: las pruebas no
treponémicas (reagínicas) no determinan anticuerpos
específicos frente a Treponema pallidum y se basan en
antígenos compuestos de soluciones alcohólicas con
cantidades determinadas de cardiolipina, colesterol y
lecitina. Miden anticuerpos frente a estas sustancias
que son producidas por los tejidos dañados por el T.
pallidum. Estas pruebas son: VDRL (Venereal
Research Disease Laboratory), RPR (Rapid Plasma
Reagin), TRUST (Toluidine Red Unheated Serum
Test), USR (Unheated Serum Reagin) y ELISA
(Enzimoinmunoensayo). Son de bajo costo, fáciles de
efectuar, se utilizan como pruebas de inicio en la
detección de sífilis y para evaluar la respuesta al
tratamiento. La desventaja que presentan es que,
debido a su inespecificidad, pueden arrojar falsos
resultados positivos.
Las pruebas treponémicas, en cambio, detectan
específicamente los anticuerpos de Treponema
pallidum y su utilidad en el laboratorio está orientada a
confirmar los resultados arrojados por las pruebas no
treponémicas. Las pruebas treponémicas más
conocidas son: FTA-Abs (Inmunofluorescencia
indirecta con absorción del suero), FTA-Abs 200DS
(Inmunofluorescencia indirecta con absorción y doble
tinción), TPHA (Microhemaglutinación), Captia
syphilis M (ELISA de captura anti-cadena pesada),
ELISA IgG, y WESTERN BLOT, las cuales tienen muy
bajo índice de falsos resultados, tanto positivos como
negativos. Deben realizarse con una absorción previa
del suero para eliminar la reacción cruzada con otros
treponemas. Sin embargo, carecen de utilidad para
monitorear los tratamientos, ya que suelen permanecer
positivas en el 85 a 90% de los pacientes tratados y
curados
En esta práctica el VDRL se realiza añadiendo el
suero, generalmente sobre un portaobjeto con pozos
de vidrio y se mezcla con una suspención acuosa de
antígeno de cardiolipina y lecitina purificados. Tras una
rotación de 4 min a temperatura ambiente, se lee la
prueba al microscopio, y si existe aglutinación, nos
indica que el suero es reactivo. (VER ANEXO 3,
preparación de antígeno y calibración de agujas).
16 17

Limitaciones del procedimiento
La hemólisis o hiperlipidemia pueden ocasionar
resultados erróneos. Resultados falsamente positivos
pueden ser observados en individuos con cuadros
patológicos diversos como hepatitis, influenza,
brucelosis, lepra, malaria, asma, tuberculosis, cancer,
diabetes y enfermedades autoinmunes.Estos casos
generalmente presentan reacciones con títulos muy
bajos y una historia clínica que no coincide con las
características de sifilis.
Método:
1. Identificar una lámina para VDRL y agregar en cada
círculo 0.05 mL (50 µL) de los sueros controles
(reactivo, débilmente reactivo, no reactivo) y del
paciente (previamente inactivado a 56 ºC 30
minutos)
2. Añadir una gota de la emulsión de antígeno a cada
suero con una aguja calibre 18.
3. Rotar las láminas durante 4 minutos a 180 r.p.m en
el rotador de VDRL.
4. Observar cada suero en un microscopio, usando el
objetivo de 10X.
5. Reportar los resultados usando la siguiente tabla
para interpretar los mismos:
Reactivo No Reactivo Débil Reactivo
Pipetas de
precisión para 50
µL.
Pipetas de vidrio de
0.2, 0.5,1.0 mL.
Propipeteadores.
Láminas planas
para VDRL.
Aguja despuntadas
calibre 18, 19 y 23.
Frasco para
preparar antígeno
Microscopio
con objetvo de
10X
Rotador
mecánico con
revoluciones
de 180 rpm
Sueros controles:
Reactivo, débil
reactivo y no
reactivo
Antígeno de VDRL
Reacción Reporte
Ausencia de Flóculo o de grumos No reactivo
Pequeños grumos Débilmente reactivo (DR)
Grumos medianos y grandes Reactivo (R)
18
19

PRUEBA DE VDRL CUANTITATIVA EN MUESTRAS
DE SUERO
Todos los sueros que den resultado reactivo o
débilmente reactivo al realizar la prueba cualitativa
deber ser examinados de nuevo usando el método
cuantitativo en lámina.
Método:
Se realiza según el siguiente esquema:
Nota: una gota equivale aproximadamente a 0,01 mL
Una vez que se agrega el antígeno, la lámina se lleva
al rotador durante 4 minutos y se lee inmediatamente
en el microscopio (10X).
Si todas las diluciones arrojan resultados reactivos se
realiza una dilución 1/8 y se repite el procedimiento
indicado en el esquema obteniéndose diluciones 1/8,
1/16, 1/32. El reporte de los resultados se realiza según
las normas de la OMS:
Cuestionario:
1. ¿Explique cual es la importancia de la prueba de
VDRL en embarazadas y recién nacidos?
2. Mencione cual es la importancia del VDRL y de
otras pruebas inespecíficas
3. ¿Qué se recomienda en los casos de VDRL con
resultados reactivos en personas que no presentan
clínica ni antecedentes epidemiológicos de sífilis?
4. Mencione la importancia de las pruebas específicas
Círculo 1 Círculo 2 Círculo 3
Suero 0.04 mL 0.02 mL 0.01 mL
solución
salina (aguja
21 ó 23)
- 2 gotas 3 gotas
Antígeno
(aguja 19)
1 gota 1 gota 1 gota
Dilución Sin diluir ½ ¼
Prueba
cualitativa
Prueba cuantitativa
Dilución del suero Reporte
Sin
diluir
½ ¼
Reactiva R R DR Reactivo 2 diluciones
Reactiva R R R
No reportar, seguir
diluyendo hasta
conseguir el NR
Débil Reactivo DR NR NR Débil reactivo 0 dilución
Débil Reactivo DR DR NR Débil Reactivo 1 dilución
20 21

PRÁCTICA 5. DETECCIÓN DE FACTOR
REUMATOIDE POR LA PRUEBA DE LÁTEX
Los factores reumatoides son inmunoglobulinas que
reaccionan con antígenos situados en la fracción
constante (Fc) de la inmunoglobulina G, existen varios
factores, que pertenecen a las cinco clases de
inmunoglobulinas, siendo la de la clase IgM el que más
se ha estudiado.
Los métodos más utilizados para la determinación del
factor reumatoide son los de aglutinación. Intervienen
en estas reacciones tres elementos:
El factor aglutinante o factor reumatoide
Partículas inertes
Gammaglobulinas sensibilizantes de estas
partículas
Estas reacciones se dividen en dos grupos según la
procedencia de las gammaglobulinas sensibilizantes.
En la prueba de Waaler-Rose se utilizan
gammaglobulinas animales (conejos) y en la prueba del
látex gammaglobulinas humanas.
El principio de estas técnicas es descubrir la presencia
de factor reumatoideo IgM con alto poder aglutinante
según su capacidad de aglutinar partículas de látex o
hematíes recubiertos de IgG.
Prueba de látex:
El método se basa en una reacción de aglutinación,
entre los factores reumatoides y sus correspondientes
anticuerpos (IgG humana) fijados en partículas de
látex. Se utilizan sueros controles positivos y negativos.
La reacción será negativa si la suspensión se mantiene
homogénea y positiva si aparece aglutinación. Las
muestras positivas deben ser valoradas mediante una
determinación cuantitativa.
Otras técnicas:
Los factores reumatoides también pueden ser
determinados por técnicas cuantitativas de
nefelometría y turbidimetría, las cuales tienen las
ventajas de la automatización.
Valores de referencia:
En la prueba de látex, se considera un valor positivo
cuando la dilución en la que se observa aglutinación es
igual o superior a 1/64.
Significado clínico:
Puede aparecer positivo en las siguientes patologías:
Artritis reumatoide Dermatomiositis
Infección viral crónica Mononucleosis infecciosa
Leucemia Lupus eritematoso sistémico
Sífilis Escleroderma
Materiales Reactivos
Micropipetas (5-200 µL)
Lámina porta-objeto
Reactivo de látex
Tampón de glicina-solución salina
concentrado (20X)
Control positivo
Control negativo
22 23

Método:
- Agregar 50 µL de la muestra, control positivo,
control negativo en cada uno de los círculos de la
lámina.
- Mezcle bien el reactivo de látex y agregué 50 µL de
este sobre cada uno de las muestras problemas.
- Mezcle bien las dos gotas que están sobre la
lámina y extienda la mezcla sobre el área de
prueba.
- Con un movimiento en forma de número 8, rote la
lámina suavemente durante dos minutos.
- Observar si hay presencia (positivo) o no
(negativo) de aglutinación.
Paciente + Control - Control+
Cuestionario:
1.- Realice un cuadro donde mencione las
enfermedades asociadas con FR positivo?
2.- ¿Explique la etiopatología de los factores
reumatoides?
3.-¿Tipos de muestras que se utilizan para determinar
Factor reumatoide?
4.- ¿Que aplicación clínica tiene esta metodología?
PRÁCTICA 6. Determinación del título de
antiestreptolisina O (ASO) mediante la
inhibición de la hemólisis
Fundamento del método:
La estreptolisina O, producida por el estreptococo β-
hemolítico de grupo A, tiene la propiedad de producir
hemólisis cuando se pone en contacto con glóbulos
rojos. Al colocar distintas diluciones de un suero que
contenga antiestreptolisina O en presencia de dosis
constantes de estreptolisina O, se produce una
reacción antígeno anticuerpo que neutraliza la
capacidad hemolítica de la misma. Este fenómeno se
evidencia por una inhibición de la hemólisis al agregar
suspensión de glóbulos rojos del 3 al 5%. El título de
antiestreptolisina será la recíproca de la máxima
dilución del suero del paciente capaz de neutralizar
totalmente la estreptolisina.
Valores de referencia
Normalmente pueden existir en suero hasta 240
unidades de antiestreptolisina O ó unidades Todd.
Títulos superiores son indicativos de un proceso
infeccioso por Streptococcus β hemolítico del grupo A.
Significado clínico
Títulos elevados indican que las secuelas por infección
estreptocóccica están presentes. Entre el 80 al 85% de
pacientes con fiebre reumática y el 95% de pacientes
con glomerulonefritis aguda, presentan títulos
representativos. En endocarditis bacteriana y
escarlatina los títulos se modifican.
23
24 25

Valor alto no es específico para una determinada
enfermedad. Sólo indica infección por este
estreptococo. Los valores se modifican en la
convalecencia, siendo inferiores cuando el tratamiento
es acertado. Los niveles altos de betalipoproteínas dan
falsos resultados elevados y los antibióticos y
adrenocorticoides niveles bajos. En amigdalitis, sepsis
puerperal y erisipela por estreptococos A, los valores
están elevados.
Placa de micropozos
con fondo en forma
de U
Micropropipetas
(1-200 µL)
Dispensadores de
25 µL
Estufa a
37ºC
Buffer fosfato salino (PBS)
pH 7.2
Reactivo de estreptolisina
Glóbulos rojos de carnero al
2.5%
Método
1. Por cada muestra realizar 3 diluciones en tubos de
12 x 75 mm:
1:10 (0.9 mL de buffer + 0.1 mL de suero)
1:60 (1.0 mL de buffer + 0.2 mL de la dilución
1:10)
1:85 (1.5 mLde buffer + 0.2 mL de la dilución
1:10)
2. Marcar en la placa de microtitulación 2 hileras por
cada muestra (6 pozos por cada hilera) y 3 pozos
para los controles:
a) Control de suero
b) Control de enzima
c) Control de glóbulos rojos
3. Agregar 25 µL de buffer a los pozos del 2 al 6 de
ambas hileras.
4. Añadir 25 µL de la dilución 1:60 a los pozos 1 y 2
de la hilera A.
5. Adicionar 25 µL de la dilución 1:85 a los pozos 1 y 2
de la hilera B.
6. Con una pipeta de precisión de 25 µL realizar las
diluciones al doble a partir del pozo Nº 2 de cada
hilera hasta el pozo 6.
7. Agregar 25 µL de estreptolisina O.
8. Mezclar, tapar la placa con plástico adherible o
tapas de plástico especiales para placas. Incubar en
estufa a 37ºC durante 15 minutos.
9. Añadir 25 µL de glóbulos rojos humanos o de
carnero previamente lavados y preparados al 2%.
10.Sellar nuevamente la placa y mezclar e incubar
durante 45 minutos a 37ºC, agitando la placa cada
15 minutos.
11.Guardar las placas en refrigeración durante toda la
noche o centrifugarlas durante 5 minutos a 2000
rpm.
12.Leer con ayuda del espejo visor para determinar la
más alta dilución del suero que mostró inhibición
total de hemólisis. Reportar el inverso de la dilución
en unidades Todd.
26 27

Esquema de trabajo:
Control de
suero
Control de
enzima
Control de
GR
Buffer 25 µL 50 µL 75 µL
Suero diluido 50 µL - -
Estreptolisina - 25 µL -
G. R al 2 % 25 µL 25 µL 25 µL
Lectura No hemólisis Hemólisis No hemólisis
Esquema de la lectura
Cuestionario:
1. ¿Cuales son los valores de referencia de esta
prueba segun la edad?
2. ¿Cuáles son los controles utilizados en esta prueba,
y cual es su utilidad?
3. Defina que es estreptolisina y antiestreptolisina O
4.- ¿Cuales son los factores que influyen en esta
prueba?
PRÁCTICA 7.- DETERMINACIÓN DE
ANTICUERPOS ANTI- Toxoplasma gondii
POR INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
Fundamento de la Inmunofluorescencia:
La Inmunofluorescencia se basa en una reacción
antígeno-anticuerpo, la cual se hace visible por la
incorporación de un marcador fluorescente
(fluorocromo) que no modifica la especificidad del
anticuerpo. Esta técnica fue introducida por Coons y
colaboradores en 1941 y desde entonces se ha
utilizado tanto en el diagnóstico como en la
investigación. Puede ser aplicada a técnicas
histoquímicas para la detección y localización de
antígenos en células o tejidos.
Los marcadores fluorescentes mediante combinaciones
químicas pueden marcar proteínas, incluyendo
anticuerpos, sin producir efectos en las propiedades
biológicas o inmunológicas de las proteínas; pudiendo
ser observadas en preparaciones microscópicas
mediante el uso de microscopios de fluorescencia.
Aplicación Clínica
En el diagnóstico de laboratorio la Inmunofluorescencia
desempeña un rol importante en las pruebas de rutina
como por ejemplo, el test de anticuerpos fluorescentes
anti-treponema, para confirmar el diagnóstico
serológico de sífilis, o pruebas de anticuerpos en
enfermedades autoinmunes, reconocimiento de
depósitos de inmunoglobulinas en biopsias renales,
demostrar microorganismos o células relacionados
antigénicamente o específicos, además permite
detectar y cuantificar drogas, hormonas, proteínas,
péptidos en fluidos biológicos; menos común es el uso
28
29

de la fluorescencia donde proteínas coloreadas con
fluorocromos son inyectadas dentro de animales,
determinando su distribución en el cuerpo mediante
secciones subsecuentemente observadas al
microscopio.
Fundamento para anticuerpos anti-Toxoplasma
gondii:
Es una prueba que se usa para determinar anticuerpos
específicos de la clase IgG o IgM. Los anticuerpos anti-
Toxoplasma gondii presentes en el suero de los
pacientes reaccionarán contra los antígenos del
parásito fijado sobre una lámina portaobjeto. La
reacción antígeno-anticuerpo se pondrá de manifiesto
mediante la adición de un suero de conejo o cabra que
contiene anti-inmunoglobulina humana anti IgG o anti
IgM conjugada con Isotiocianato de Fluoresceína. Al
observar en el microscopio de fluorescencia, en las
muestras positivas, los parásitos emitirán fluorescencia
de color verde manzana; en las muestras negativas, se
observarán de color rojo.
Significado Clínico:
Anticuepos IgM
Clásicamente, su detección es marcador de la fase
aguda de la enfermedad. El principal valor de las IgM
radica en que su ausencia prácticamente descarta la
infección reciente. La presencia de IgM, por el
contrario, implica la necesidad de proseguir el estudio
de un paciente determinado.
Anticuerpos IgG
La presencia de anticuerpos IgG implica que ha habido
contacto entre el paciente y el parásito en algún
momento de la vida. Si existe la evidencia de una
seroconversión o de un aumento significativo del título
de IgG entre dos muestras separadas 3-4 semanas, es
diagnóstico de infección reciente. En las embarazadas
y en los pacientes con inmunodeficiencia grave, el
principal valor de las IgG consiste en la discriminación
de individuos seronegativos.
Láminas
portaobjeto
fijadas con la
suspensión de
Toxoplasma
gondii.
Micropipetas
(1-200 µL)
Estufa a 37
ºC
Microscopio
de
fluorescencia
Cámara
húmeda
Anti-inmunoglobulina humana
IgG o IgM obtenida en cabra y
conjugada con isotiocianato
de fluoresceína
Buffer fosfato salino (PBS) pH
7.2
Sueros controles positivos y
negativos
Azul de Evans diluido
Líquido de montaje
Método:
1. Identificar una hilera de 8 pozos de la microplaca
para cada paciente.
2. Realizar diluciones seriadas al doble a partir de 1/2
con un volumen final de 25 µL en cada pozo (desde
el pozo 1 al pozo 8)
3. Agregar 10 µL de las diluciones 1/64 (pozo 6) y
1/256 (pozo 8) de cada paciente al círculo
30 31

previamente identificado en la lámina que contiene
Toxoplasma gondii.
4. Incubar en cámara húmeda, durante 30 minutos a
37ºC
5. Introducir las láminas en un envase con PBS 7.2
durante 10 minutos. Repetir el procedimiento una
vez más.
6. Preparar la dilución óptima del conjugado
fluorescente anti-IgG o anti-IgM. Una vez preparada
la dilución, colocar 10 µL de azul de Evans y
agregarlo a cada círculo de la lámina.
7. Repetir los pasos 4 y 5
8. Secar la lámina, aplicar una gota del fluido de
montaje, colocar el cubreobjeto y observar al
microscopio de fluorescencia a 40X.
9. Reportar los resultados.
Muestra positiva Muestra Negativa
Cuestionario:
1. Esquematice la tinción de inmunofluorescencia
indirecta
2. ¿Mencione cual es el antígeno que se utiliza en la
prueba de inmunofluorescencia?
3. Cual es la importancia de detectar anticuerpos de
tipo IgM e IgG en mujeres embarazadas?
4. Cuál es la utilidad del azul de Evans
PRÁCTICA 8. DETERMINACIÓN DE
ANTICUERPOS ANTI- Toxoplasma gondii
POR HEMOAGLUTINACIÓN PASIVA
Fundamento de la aglutinación:
Se denomina aglutinación a la interacción secundaria in
vitro de un antígeno particulado (por lo general células)
con su anticuerpo específico. Cuando la molécula
antigénica con la que interacciona el anticuerpo
específico no forma parte de la estructura nativa de la
partícula, sino que se incluye artificialmente en su
superficie, la aglutinación que tiene lugar se denomina
genéricamente aglutinación pasiva o indirecta. Los
soportes utilizados pueden ser inertes como partículas
de látex o glóbulos rojos, en cuyo caso el método
recibe el nombre de hemoaglutinación pasiva o
indirecta. Estas metodologías son ampliamente
utilizadas en el laboratorio clínico para la detección
serológica de anticuerpos en diferentes patologías
infecciosas
Fundamento del método:
Se basa en la propiedad que tienen los anticuerpos
anti-T gondii de producir aglutinación en presencia de
glóbulos rojos sensibilizados con antígenos
citoplasmáticos y de membrana del parasito. El empleo
de ambos tipos de antígenos incrementa la sensibilidad
del método permitiendo la detección precoz de la
infección. Tanto la presencia de anticuerpos heterófilos
como la aparición de IgM, características del período
agudo de la parasitosis, se investigan empleando
tratamiento con 2 mercaptoetanol (2 ME) y eritrocitos
no sensibilizados para control y absorción de
32
33

heterofilia. Los anticuerpos heterófilos se absorben con
eritrocitos no sensibilizados. En los sueros de
pacientes con infección aguda se observa una caída
del título en por lo menos 2 diluciones comparado con
los mismos sueros sin tratar con 2 ME.
Las muestras de suero que contienen anticuerpos
específicos anti-toxoplasma gondii reaccionan con
hematíes sensibilizados con antígenos solubles del
parásito, provocando su aglutinación (formación de una
malla).
Significado Clínico:
Una muestra considerada como positiva, indica
que el paciente está o estuvo en contacto con el
parásito
Una muestra negativa o ausencia de
aglutinación demuestra que el paciente no está
o estuvo en contacto con el parásito
Materiales y reactivos:
Materiales Reactivos
Placa de micropozos
Buffer fosfato salino (PBS)
pH 7.2
Células sensiblizadas
Células No sensibilizadas
Suero control positivo
Suero control negativo
Método:
1. Identificar una hilera de la placa de micropozos
para cada paciente y para los respectivos
controles
2. Preparar las diluciones seriadas desde 1:2 hasta
1:64 de la siguiente manera: agregar 25 µL de
solución buffer desde el pozo 1 al 6, en el pozo 1
agregar 25 µL del suero, transferir 25 µL desde el
pozo 1 al 2, mezclar y repetir el procedimiento
hasta el pozo 6, en este pozo descartar 25 µL.
3. Adicionar 25 µL de las células no sensibilizadas
(previamente resuspendidas con movimientos de
frotación) a los pozos 1 y 2.
4. Agregar 25 µL de las células sensibilizadas
(previamente resuspendidas con movimientos de
frotación) al resto de los pozos .
5. Mezclar, colocando la placa sobre un rotador o
apoyándola sobre el mesón para darle ligeros
golpes con el dedo.
6. Tapar la microplaca e incubarla a temperatura
ambiente entre 1-2 horas.
34
35

7. Observar la reacción de los sueros problema y
compararlo con los sueros controles. Las
muestras que en la dilución 1:16 presenten
sedimentación de los glóbulos rojos formando
un botón en el fondo del micropozo, se
consideran negativas y se reportan. Las
muestras que presenten aglutinación en las
células sensibilizadas y botón en las no
sensibilizadas, se procesan de nuevo,
aumentando las diluciones hasta obtener la mayor
dilución del suero que muestre aglutinación.
Las muestras que presentan aglutinación en la
dilución 1:16 para las células sensibilizadas y para
las no sensibilizadas, deben ser sometidas al
proceso de absorción para eliminar los
anticuerpos heterófilos.
Absorción de los anticuerpos heterófilos:
1. Mezclar con suavidad el frasco identificado como
absorbente (es una suspensión al 10% de
glóbulos rojos no sensibilizados) o el de células
no sensibilizadas.
2. En un tubo de 12 x 75 mm, mezclar volúmenes
iguales del suero y de las células absorbentes
3. Tapar el tubo, mezclar bien y dejar en reposo a
temperatura ambiente entre 2-24 horas.
4. Centrifugar durante 5 minutos.
5. En un vial, separar el sobrenadante y procesar
de nuevo siguiendo el protocolo de la prueba de
descarte.
6. Los sueros deben presentar un botón en el pozo
de las células no sensibilizadas como indicativo
de absorción efectiva. La reacción en las células
sensibilizadas, dependerá de la presencia o
ausencia de anticuerpos específicos para los
antígenos de Toxoplasma gondii.
Cuestionario:
1. Defina: Células sensibilizadas
Células no sensibilizadas
Anticuerpos heterófilos
Absorbente
Suero control Positivo
Suero control negativo
2. ¿Qué importancia tiene detectar anticuerpos
contra toxoplasma gondii de tipo IgG en
pacientes con VIH?
35
36 37

PRÁCTICA 9. ELISA (enzyme linked inmuno
sorbent assay) para la detección de IgE
La técnica de ELISA (enzyme linked inmuno sorbent
assay) es un procedimiento de ensayo
inmunoenzimatico, concebida independientemente en
1971 por Engvall y Perlmann, en Suecia y por Van
Weemen y Schuurs, en Holanda, siendo aplicada
posteriormente a la revelación y a la cuantificación de
diversos tipos de sustancias presentes en líquidos
orgánicos.
Se fundamenta en la reacción antígeno-anticuerpo, en
donde el anticuerpo (o el antígeno) se fijan a una
superficie, ya sea un contenedor de una placa de
microtitulación o una partícula de plástico. El
especimen a prueba se aplica y el material adherido se
detecta y caracteriza través de un anticuerpo
secundario marcado enzimáticamente.
Las reacciones alérgicas, por ejemplo el asma, la
dermatitis y alergia al polen son usualmente
diagnosticada en base a la historia medica y a los
síntomas clínicos.
La medición de la Inmunoglobulina E (IgE) es muy
importante para comprobar las suposiciones clínicas.
Altas concentraciones de IgE pueden ocasionar
hipersensibilidad contra si misma, lo que puede ser
causa de diferentes reacciones alérgicas. Además
algunas infecciones parasitarias también pueden
incrementar los niveles de IgE
Aplicación Clínica del ELISA:
Sus aplicaciones se han expandido en forma
sostenida, siendo utilizadas actualmente en
endocrinología para la cuantificación de hormonas, en
inmunología para la medición de inmunoglobulinas,
C1q e inmunocomplejos y en microbiología para la
identificación y cuantificación de antígenos o
anticuerpos en infecciones bacterianas, micóticas,
parasitarias o virales.
Método:
1. Dispensar 20 µL de calibradores, controles y
muestras en el pozo correspondiente.
2. Dispensar 100 µL del buffer Zero en cada uno de
los pozos.
3. Mezclar por 30 seg.
4. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente
(TA).
5. Descartar el contenido de los micropozos y lavar 5
veces con 300 µL de agua destilada.
6. Agregar 150 µL del conjugado enzimático en cada
pozo, mezclar por 10 seg.
7. Incubar durante 30 min a TA.
8. Descartar el contenido de los micropozos y lavar 5
veces con 300 µL de agua destilada.
9. Agregar 100 µL de sustrato por pozo
Placas plásticas de
fondo plano
Pipetas graduadas
Lector de
ELISA
Buffer fosfato salino
(PBS) pH 7.2
38 39

10.Incubar durante 20 min a TA.
11.Detener la reacción agregando 100 µL de solución
stop por pozo.
12.Leer a 450 nm
Cuestionario:
1. Mencione los métodos para determinar
anticuerpos por ELISA
2. Defina: Conjugados
Sustratos
3. ¿Que muestras se pueden usar para la prueba?
4. ¿Como se determinan los valores positivos y
negativos de las Muestras?
ANEXOS
40

ANEXO 1. PREPARACIÓN DE LA AGAROSA
Materiales para preparar 100 mL de agarosa:
85 mL de Buffer fosfato salino (pH 7.0; 0,1 M)
1.4 g de Agarosa (Sigma Chemical reactive)
g de Dextrán (Sigma Chemical reactive)
10 mL de EDTA Na2 (pH 7.7; 0,1 M)
5 mL de Azida de sodio (0.65%)
0.5 mL de Antisuero anti-PCR
Procedimiento:
Disolver la agarosa en el buffer fosfato salino sobre
una plancha magnética con calor, con agitación
constante, agregar el dextrán; una vez disueltos,
agregar el EDTA y la azida de sodio (para evitar la
evaporación colocar sobre el elenmeyer un embudo
con una perla de cristal)
Una vez preparada la agarosa colocar en baño de
maría a 56 ºC, al estabilizar la temperatura, agregar
el antisuero anti-PCR en volúmenes proporcionales
para obtener una concentración al 0.5%
ANEXO 2.- DETERMINACIÓN DE LA CURVA
PATRÓN DE CONCENTRACIÓN DE PCR
Para cada lote de placas se debe realizar una curva
patrón de concentración de Proteina C Reactiva,
donde se podrá determinar la concentración de
PCR en las muestras que presenten halos de
precipitación. Se usa un suero de referencia de
concentración conocida (120 µg/mL) al cual se le
realizan diluciones seriadas al doble es decir 1:2,
1:4, 1:8, 1:16; 1:24 obteniéndose concentraciones
de 60, 30, 15, 7.5 y 5 mg/mL respectivamente.
Tomar una placa del lote recien preparado y
comprobar que no este deshidratada, ni
contaminada y perforar los pozos con una cánula
de 12 G, 5 mm de diámetro, dejar una separación
de unos 20 mm entre cada pozo. Agregar 5 µL de
cada dilución en cada pozo, tapar bien la placa,
dejar reposar 15 minutos. Incubar la placa en
cámara húmeda a temperatura ambiente por 48
horas. Realizar la lectura con la ayuda del visor de
precisión y anotar los resultados. Graficar en papel
milimetrado colocando en el eje de las ordenadas
el diámetro al cuadrado y en el eje de las abscisas
la concentración de los controles. Unir los puntos y
escoger la línea que abarque el mayor rango de
valores.
Ejemplo:
41 42

Diluciones del
suero de
referencia
Concentración
g/mL
Diámetro
mm
Diámetro
2
1:2 60 7.0 49
1:4 30 5.0 30.25
1:8 15 3.9 15.21
1:16 7.5 3.0 9.0
1:24 5.0 2.0 4.0
ANEXO 3.- PREPARACIÓN DE LA EMULSIÓN DE
ANTÍGENO:
1. Agregar 0.4 mL de solución salina en el fondo de un
frasco de tapa de rosca de 30 ml de capacidad.
2. Añadir 0.5 mL del antígeno directamente sobre la
solución salina, mientras se agita la botella con
movimientos rotatorios suaves sobre una superficie
plana. El antígeno se debe añadir gota a gota pero
rápidamente.
3. Rotar el frasco rápidamente durante 30 seg
4. Añadir 4.1 mL de la solución salina
5. Tapar el frasco y agitar la solucion unas 30 veces
CALIBRACIÓN DE LAS AGUJAS:
Es importante que se use una cantidad apropiada
de la emulsión del antígeno, por esto que la aguja
que se usa para agregarla, debe chequearse
periodicamente, para obtener gotas de tamaño
constante.
1. En la prueba cualitativa, la emulsión de antigeno se
agrega con una aguja de calibre 18 sin punta, la
cual descarga 60 gotas por mL de la emulsión de
antígeno, cuando la jeringa este colocada en
posición vertical.
2. En la prueba cualitativa, la emulsión del antígeno
debe ser repartida con una aguja de calibre 19 sin
punta, la cual descargará 75 gotas por mL de la
emulsión de antígeno, cuando la jeringa este
colocada en posicion vertical.
3. La solución salina usada para la prueba cuantitativa
debe ser repartida con una aguja de calibre 21 o 23,
esta descargará 100 gotas por ml de solución salina
cuando la jeringa este colocada en posición vertical.
43 44

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