DRFDFGDFG

1. ADN Recombinante e
Ingieniería Genética

2. Hipercolesterolemia Familiar
� Un gen codifica una proteina que sirve como
receptor celular para LDL
� Dos alelos normales para el gen mantienen
bajos los niveles sanguíneos de LDLs.
� Dos alelos mutados producen niveles de
colesterol anormalmente altos y enfermedad
del corazón.

4. Ejemplo de Terapia Génica.
� Mujer con hipercolesterolemia familiar.
� Se le removió parte de su hígado.
� Se utilizó un virus para insertar un gen normal para el
receptor de LDL en las células del hígado cultivadas en
el laboratorio.
� Las células modificadas del hígado se pusieron de
regreso en la paciente.

5. Resultados de la terapia génica.
� Las células modificadas vivieron en el hígado de
la mujer.
� Los niveles sanguíneos de LDLs bajaron en un
20%.
� No presentó evidencias de aterosclerosis.
� Los niveles de colesterol permanecieron altos.
� Falta todavía saber si el procedimiento
prolongará su vida.

6. Cambios Genéticos.
� Los humanos han estado cambiando la
genética de otras especies por miles de
años.
� Seleccion artificial de plantas y animales.
� Los procesos naturales también han
trabajado.
� Mutaciones, crossing over.

7. Selección artificial.

9. Ingieniería Genética
� Los genes son aislados, modificados, e insertados
dentro de un organismo.
� Es posible gracias a la tecnología del ADN
recombinante.
� Corte del ADN y recombinación de piezas.
� Las piezas modificadas se pueden amplificar.

10. Descubriendo las Enzimas de
restricción.
� Hamilton Smith estaba estudiando la forma en que la bacteria
Haemophilus influenzae se defiende del ataque de los virus
bacteriófagos
� Descubrió que la bacteria tiene una enzima que corta el ADN
viral

11. Especificidad de los cortes
� Las enzimas de restricción cortan el ADN en
una secuencia específica.
� El número de cortes hecho en el ADN
dependerá del número de veces en que la
secuencia de reconocimiento existe en ese
genoma...

12. Preparando ADN recombinante
5’
3’
G
C T T A A
A A T T C
G
G A A T T C
C T T A A G
3’
5’
Fragmento de ADN
3’
5’
Otro fragmento de ADN

13. 5’
3’
3’
5’
G A A T T C
C T T A A G
nick
G A A T T C
C T T A A G
Acción del ADN recombinante

14. Usando Plásmidos
� Un plásmido es un pequeño cromosoma circular
de ADN bacteriano.
� ADN extraño puede ser insertado dentro de un
plásmido.
� Se forman plásmidos recombinantes.
� Los plásmidos pueden servir como vectores de clonación.
� Pueden enviar ADN a otra célula.

15. recombinant
plasmids
ADN recombinante + enzimas
Células huésped que contienen
plásmidos recombinantes.

16. ¿Podría escapar del laboratorio
una bacteria genéticamente
modificada?
� Las bacterias genéticamente modificadas son diseñadas para que
no puedan sobrevivir fuera del laboratorio.
� Si se liberan al medio ambiente Mueren, son dependientes de las
condiciones del laboratorio.

17. Preparando ADNc
mRNA transcriptor
mRNA–cADN híbrido
ADNc monocatenario
Cadena doble de ADNc

18. Amplificando ADN
� In vivo: Los fragmentos pueden ser insertados dentro de microorganismos
de crecimiento rápido
� In vitro: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

19. Reacción en cadena de la
Polimerasa
� Se calienta la secuencia que se desea copier.
� Se agregan los iniciadores o primers, los cuales
reconocen su secuencia complementaria y se
unen a ella.
� La ADN polimerasa usa nucleótidos para crear
la hebra complementaria.
� Se obtienen miles de copias del fragmento
deseado.

22. Huellas genéticas o DNA
Fingerprints.
� Patrón de bandas único que se obtiene después de una electroforesis
del genoma previamente cortado con alguna enzima de restricción.
� Se heredan de padres a hijos de una forma mendeliana.

23. Repeticiones en Tandem
� Cortas regiones de ADN que difieren sustancialmente entre las
personas.
� Existen muchos sitios del genoma donde existen repeticiones en
tandem.
� Cada persona es portadora de una única combinación de la
cantidad de repeticiones.

24. RFLPs
(Restriction fragment length polymorphisms)
� Polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción.
� El ADN de regiones con repeticiones en tandem se corta con enzimas de
restricción.
� Debido a la variación en la cantidad de ADN repetido, los fragmentos de
restricción varían en tamaño
� La variación se detecta por una electroforesis
Herencia de los
marcadores RFLP.
Genotipos.
Padres.
Hermanos.

25. Diferencia en la
base de la
secuencia.
ADN de dos alelos
Electroforesís de fragmentos de restricción

26. Electroforesis
� El ADN se pone en un “pozo” en uno de los extremos del gel.
� Se aplica una corriente al gel.
� Las moléculas de ADN están cargadas negativamente y se mueven
hacia el extremo positivo
� Las moléculas pequeñas se mueven más rápido que las moléculas
más grandes.

27. Analizando huellas genéticas
� El ADN se hace visible mediante el marcaje con un isótopo de una
sonda de ADN que se hibridiza. El patrón de bandas se usa para:
� Identificar o rechazar al sospechoso de un crimen
� Identificar cuerpos
� Determinar paternidad

29. Huellas genéticas con sondas multilocus

30. Secuenciación de Genomas.
� 1995 – Primera Secuencia en ser determinada:
bacteria Haemophilus influenzae.
� Actualmente se usa la secuenciación
automática como método principal.
� La secuencia “borrador” del genoma humano
completo se determinó de esta forma.

31. Nucleotidos para secuenciación.
� Nucleótidos (A, T, C, G)
� Versiones modificadas de estos nucleótidos:
� Marcados para emitir fluorescencia
� Estructuralmente diferentes para que detengan la síntesis
cuando ellos se unen a la molécula.

32. Mezcla para la reacción.
� Copias del ADN a ser secuanciado.
� Primer.
� DNA polimerasa.
� Nucleotides.
� Nucleótidos Modificados.

33. Procedimiento de la reacción.
� Se sintetiza una hebra complementaria con los nucleótidos.
� Cuando se incorpora un nucleótido modificado, se detiene la síntesis.
� Como resultado se obtienen millones de copias de longitud variable.

34. Obtención
de la secuencia.
T C C A T G G A C C
T C C A T G G A C
T C C A T G G A
T C C A T G G
T C C A T G
T C C A T
T C C A
T C C
T C
T
electrophoresis
gel
one of the many
fragments of
DNA migrating
through the gel
one of the DNA fragments
passing through a laser beam
after moving through the gel
T C C A T G G A C C A
• ADN se pone en un gel.
• Fragmentos migran por el
gel en orden de tamaños;
pasan a través de un rayo
laser. El color de la
fluorescencia de cada
fragmento se almacena en
la computadora y se puede
imprimir .

35. Bibliotecas de genes.
� Bacterias que contienen diferentes fragmentos de ADNs
clonados :
�Bibliotecas Genomicas
�Bibliotecas de ADNs copias.

36. Usando una sonda para
encontrar un gen
� Usted desea saber cual bacteria de todas
en una librería contiene un gen específico
� Se necesita una sonda del gen
� Una secuencia de ADN del gen, marcada con radio-isótopo que
reconocerá su secuencia complementaria en la librería.

37. Uso de una sonda
Colonia en la placa.
Células se
adhieren al filtrar.
Células se alisan,
AND se pega al
filtrar.
Se añade
la sonda.
Ubicación en la sonda, se unen formas.
Mancha oscura
en la película,
indica la colonia
del gen.

38. Ingieniería de proteinas
� Las bacterias pueden ser usadas para
obtener miles o millones de copias de
moléculas de una proteina de interés
medico.
� Insulina, interferon, Factores de coagulación de la sangre.
� Vacunas.

39. Limpieza del ambiente
Bio-remediación.
� Existen microorganismos que
normalmente digieren basura
orgánica y reciclan materiales.
� Algunos pueden ser usados por la
ingieniería para digerir contaminantes
o grandas cantidades de materiales
peligrosos.

40. Gusanos que comen plástico.
Investiga en que consiste esto…

41. El plásmido Ti
� Investigadores
reemplazan
genes que
causan tumores
por genes
beneficiosos
� Los plásmidos
transfieren estos
genes a celulas
vegetales en
cultivo
foreign gene
in plasmid
plant cell
Figure 16.11
Page 261

42. Ingieniería de plantas
� Plantas de algodón pueden hacerse resistentes a
hierbicidas.
� Plantas de aspen pueden producir menos lignina y
más celulosa.
� Plantas de tabaco pueden producir proteínas
humanas.
� Células de la planta de mostaza pueden producir
plástico biodegradable.

43. Primeros mamíferos manipulados
genéticamente.
� Usaron ratones deficientes en hormona del
crecimiento (enanos).
� Los huevos fertilizados de ratón fueron
inyectados con el gen de rata para la
hormona del crecimiento.
� Gen se integró al ADN del ratón.
� Ratones modificados fueron 1,5 veces mas
grandes que sus hermanos no modificados.

44. Clonando a Dolly
1997 - Una oveja fué clonada a partir de
una célula de adulto.
� Un nucleo de una célula de la glándula mamaria fué insertado en
un ovulo sin núcleo
� El embrion fué implantado en una madre sustituta
� La oveja obtenida es una copia genética del animal del cual se
obtuvieron las celulas de las glándulas mamarias

45. Diseñando Ganado
� Embriones de ganado vacuno se pueden hacer crecer en cultivo
y modificados genéticamente para
- Crear resistencia a enfermedades.
�Hacerlos producir albúmina
humana u otras proteinas de uso
médico.

48. Oveja Dolly.

49. Azules Belgas

50. Proyecto del Genoma Humano, U.S.A.
Human Genome Organization HUGO, 1988.
� 1990 planeado para 15 años:
� Mapear y secuenciar el genoma humano.
� Desarrollar tecnologías y métodos.
� Mapear y secuenciar genes de 5
organismos modelos: E.coli, Saccharomyses
cerevisiae, C. elegans, D. melanogaster y el
ratón.
� Estudiar las implicaciones éticas y legales
del proyecto (Subproyecto ELSI).

51. Anormalidad
es
cromosómica
s
CLONES Enfermedades
ADNc ADNg Familias
Ligamiento
Híbridos celulares
FISH
Clones contiguos
etc.
MAPA DEL GENOMA HUMANO
Mapa físico
Mapa genético
Secuenciación Identificación de genes
Mapa
RATON
P
o
l
i
m
o
r
f
i
s
m
o
s

52. Proyecto del Genoma Humano
� Se hizo en centros con capacidad
industrial de secuenciar:
� Wellcome Trust Sanger Institute en Reino
Unido.
� The Whitehead Institute y el Institute of
Technology of Massachussetts.
� Washington University
� DoE Joint Genome Institute.
� Baylor College of Medicine
� Y una red de pequeños laboratorios en
todo el mundo

53. 08_01.jpg

54. Proyecto del Genoma Humano
� Se desarrollaron grandes bases de datos
de acceso gratuito por Internet, para los
datos obtenidos con fondos públicos:
� Datos de mapeo y secuenciación de ADN
y proteínas. Ej Genome database (GDB).
Estos pueden ser accesados y analizados
desde cualquier parte del mundo.
� Datos de interés local obtenidos por cada
laboratorio.

55. Fechas importantes en el Mapeo y
Secuenciación del Genoma Humano
� 1977: Fred Sanger: Metodo de secuenciación usando
dideoxinucleótidos.
� 1980: Bolstein et al propuso mapear con RFLPs.
� 1981: Sanger publicó la secuencia mitocondrial
completa.
� 1987: El departamento de energía de los Estados Unidos
ve la necesidad de hacer el proyecto del genoma
humano.
� 1988: Se crea el Centro Nacional para el estudio del
Genoma Humano adscrito a los Institutos Nacionales de
Salud. USA.
� 1990: lanzamiento oficial del proyecto.
� 2001: Publicación del primer borrador de la secuencia
del genoma humano (90%), por parte de Celera
Genomics.
� 2003: Secuencia completa del genoma Humano.

56. Proyecto del Genoma Humano.
� Se necesitaron más de 10 años,
más de 1.000 científicos y
aproximadamente 2.000 millones
de dólares, de los cuales
solamente entre un 3-5% se han
destinado al sub-proyecto ELSI, el
cual financia investigaciones
sobre los aspectos éticos, legales,
y sociales asociados al nuevo
conocimiento.

57. Beneficio v/s riesgos
� Como cualquier conocimiento científico o avance
tecnológico, éste puede traernos gran cantidad de
beneficios, si se maneja con una visión humanista y
solidaria, obedeciendo valores fundamentales como el
respeto a la vida, a la privacidad, el derecho a la salud y
de aspirar cada día a una mejor calidad de vida; y el
derecho de proteger la identidad genética.
� Por el contrario si es usado en forma inescrupulosa, con
fines comerciales o raciales podría conducirnos a una
sociedad cada día más deshumanizada.

58. Temores.
� Los ciéntificos y el público en general han manifestado
preocupaciones: el posible irrespeto a la dignidad humana, la
discriminación contra personas con desbalances genéticos, o
portadoras de alguna mutación que les confiere un riesgo mayor
de llegar a desarrollar alguna enfermedad degenerativa,
incapacitante o que les acorte la vida. Esta discriminación se
podría traducir en
� 1. Pago de mayores primas en seguros de salud o total ausencia
de cobertura, en los países donde la salud es asegurada por
empresas privadas (afortunadamente, todavía no es el caso de
Costa Rica).

59. Temores
2. Obstáculo para obtener un trabajo, etc.
� Los expertos del sub-proyecto ELSI recomendaron
legislar urgentemente con el fin de proteger la
información genética de los individuos porque los
temores mencionados tienen fundamento, y porque
los incentivos económicos para cometer
discriminaciones aumentarán, conforme aumente la
investigación genética y bajen los costos del tipeo
genético de los individuos. Por lo que se deben
penalizar las acciones de discriminación.

60. Desafíos
� Existen aspectos éticos que están en discusión y que atañen a
toda la sociedad, se pueden señalar: el uso de la información, la
privacía y confidencialidad, quién es el dueño de la información, el
impacto sicológico y la estigmatización social, el tamizaje genético
individual (por pertenecer a una familia con historia de
enfermedad genética) o poblacional (recién nacidos,
prematrimonial y ocupacional), aspectos reproductivos, derecho a
la reproducción, terapia génica, intervenciones genéticas,
disponibilidad del uso de las tecnologías genéticas, acceso y
financiamiento, aspectos clínicos, comercialización,. implicaciones
filosóficas y conceptuales.