ADN recombinante. Tipos de vectorespara la clonación del ADN

1. ADN Recombinante
Tercer semestre
Medicina

2. ADN recombinante
 Es una molécula de ADN artificial formada de manera
deliberada in vitro por la unión de secuencias de ADN
provenientes de dos organismos distintos que
normalmente no se encuentran juntos.

3. El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante fue
posible gracias a varias líneas de investigación:
1) el conocimiento de las enzimas de restricción.
2) la replicación y reparación de ADN.
3) la replicación de virus y plásmidos.
4) la síntesis química de secuencias de nucleótidos.

4. Procedimiento
 Localización de genes y sus funciones.
 Clonación del ADN, y su posterior almacenamiento
en genes.
 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
 Utilización de vectores de expresión.

5. ¿Cómo encontrar el gen adecuado? Imanes
biológicos: sondas y anticuerpos
 Las sondas son fragmentos de ADN o ARN de simple
cadena complementarias a la región de ADN o ARN que
queremos encontrar.
 Se puede también utilizar colonias de bacterias con ADN
recombinante con una técnica similar, pero que usa
anticuerpos en vez de sondas.

6. Producción en bacterias
 La primera proteína recombinante que se
produjo en E. coli fue la somatostatina.
 El mayor problema que presenta la producción en
bacterias es que en ellas no existe glicosilación
proteica.

7. Producción en levaduras
 Las levaduras constituyen otro grupo de
organismos susceptibles de producir proteínas
recombinantes para uso humano.
 sí presentan glicosilación proteica, al contrario
que las bacterias.

8. Producción en células de insecto
 Se infectan a los insectos con baculovirus
modificados para que expresen la proteína
recombinante.
 las células de insecto presentan glicosilación,
pero esta es totalmente distinta a la de
mamíferos.

9. Producción en células de mamífero
 Para la producción en mamíferos se usan las
células CHO, de ovario de ratón chino.
 Además, se está intentando que los animales
secreten estas proteínas en la orina, en la leche,
etc.

10. Vector de clonación
Es un portador , una molécula de DNA cuya
misión es unirse con el fragmento de DNA que
se quiere clonar para facilitar su entrada en la
célula anfitriona y su replicación.

11. Tipos de vectores
Los vectores empleados para la clonación de insertos de DNA son
muy variados . Pueden clasificarse según varios criterios tales
como :
- Su procedencia procariota o eucariótica.
- El tamaño del inserto que admite.
- El tipo de molécula a partir de la que se prepara.
1) Plásmidos: bacterianos de levaduras o plantas
2) Virus: que infectan bacterias (bacteriófagos o fagos), plantas
, invertebrados , vertebrados
3) Cromosomas artificiales: derivados de elementos
cromosómicos de fagos (PAC), bacterias (BAC) , levaduras
(YAC).

12. PLÁSMIDOS

13. Los plásmidos son moléculas extra cromosómicas de ADN
cerradas y de doble hélice.
Pueden replicar de manera independiente del ADN
genómico.
No son necesarios para la viabilidad de la célula, sin
embargo algunos genes resultan útiles para la célula
anfitrión.
Cada plásmido tiene por lo menos una secuencia de ADN
que le sirve de origen para la replicación.

14. Características
 Es una molécula de ADN bicatenario y circular cerrada.
 Presentes en forma libre en el citosol y de algunos eucariotas
unicelulares.
 Plásmidos naturales contienen pocos genes propios, ninguno
esencial para la viabilidad de la célula, por lo que pueden ser
modificados sin afectarlos.
 Para su replicación autónoma, se requiere una secuencia de
origen de replicación ORI.
 Los plásmidos sufren replicaciones múltiples y originan varias
copias por célula.

15.  Son replicones que se transmiten y mantienen de manera
estable como círculos extra cromosómicos.
 Su tamaño varia de 2 a 5 kilopares de bases.
 Los plásmidos autorregulan su numero de copias por un
represor (proteína o ARN) que impide que se repliquen
muchas copias del plásmido.
 Estos represores pueden actuar sobre otros plásmidos
relacionados, excluyéndolos así de la célula.

17. Clasificación según su habilidad de
transferirse a otra bacteria
 Plásmidos conjugativos: tienen “tra-genes”, los
cuales ejecutan procesos de conjugación, como
la transferencia sexual de plásmidos a otra
bacteria.
 Plásmidos no conjugativos: son incapaces de
iniciar conjugación, de allí que ellos pueden
transferirse únicamente con la asistencia de los
plásmidos conjugativos.

18. Según su función
 Plásmidos de fertilidad: son capaz de conjugación.
 Plásmidos de resistencia: contienen los genes que
pueden construir una resistencia contra antibióticos o
venenos.
 Col-plásmido: contiene genes que codifican colicinas,
proteínas que pueden matar a otra bacteria.
 Plásmidos degradativos: permiten la digestión de
sustancia infrecuentes como el ácido salicílico.

19. Conformación
 Abierto circular.
 Lineal.
 Circular relajado.
 Superespiral
desnaturalizado.
 ADN superespiral.

20. Clonado de ADN
 Cortamos el ADN circular del plásmido con enzimas
de restricción.
 Cortamos el ADN que queremos multiplicar.
 Unimos el gen que queremos introducir (inserto)
por medio de la enzima ADN-ligasa y luego
introducimos el plásmido con inserto en bacterias.
 Seleccionamos las bacterias que hayan introducido
el plásmido con la ayuda de antibióticos.

22. TRANSFORMACIÓN BACTERIANA
 Transformar una bacteria o una levadura, consiste en
introducirle en ella una molécula de ADN extranjero.
 La eficiencia de la transformación es inversamente
proporcional a la talla del plásmido.
 Para identificar las bacterias transformadas, se utilizan
marcadores de selección proporcionados por plásmidos.

24. Uso de marcadores de selección
 Para las bacterias transformadas, se usan marcadores de
selección proporcionados por plásmidos.
 Los más utilizados son los genes de resistencia a
antibióticos.
 Las bacterias transformadas se cultivan en presencia del
antibiótico para evitar que la bacteria pierda el plásmido
que se le ha introducido.

25. Ejemplo del gen LacZ.
Conclusión: una colonia
blanca está constituida
por bacterias que portan
un plásmido
recombinante, mientras
que la tinción azul
representa plásmidos
intactos.

26. Usos y aplicaciones
 Los plásmidos poseen interés singular en ingeniería
genética por ser unos de los sistemas vectoriales mas
sencillos.
 Además son capaces de replicarse independientemente
del ADN cromosómico bacteriano, y son fáciles de
manipular sin alterar la célula.
 La molécula resultante de la unión del vector con el
ADN de interés se denomina ADN recombinante.

27.  TERAPIA GÉNICA:
Es una estrategia en la cual un ácido nucléico es
introducido en células humanas, modificando su
repertorio genético con el objetivo de prevenir,
tratar o curar un determinado defecto genético.

28.  VACUNACIÓN CON ADN:
El ADN también estimula y realza la respuesta del
sistema inmunológico, por lo que también pueden ser
desarrolladas vacunas a partir de genes patógenos
para proveer inmunidad contra enfermedades letales
mayor.

29.  CLONACIÓN ADN:
Es una técnica fundamental para la
obtención de grandes cantidades de
un fragmento de ADN concreto, este
fragmento debe ser unido a un ADN
vector antes de ser clonado, el cual
actuará como transporte del ADN
extranjero.

30. Cósmidos

31. Cósmidos
plasmidos fagos cosmidos

32. - Tamaño pequeño ( 5-7 kb).
- Circularidad.
- Origen de replicación.
- Algunos sitios de restricción donde se puede insertar el ADN.
Fragmento plasmídico

33. Fragmento fago
- Secuencia COS (cohesives sites)
Proporciona al cósmido capacidad del ADN del
fago empaquetarse en cápsides víricas in vitro.

36. DEFINICIÓN
Es un vehiculizador de ADN, que
pretende imitar las características de un
cromosoma normal de
una levadura (eucariota).
Esto permite clonar en levaduras
(microorganismos eucariotas) secuencias
de ADN de hasta un millón de pares
de bases o más, al comportarse como un
cromosoma propio de la levadura.

37. EL YAC SE CONSTRUYE A PARTIR DE UN PLÁSMIDO
Para construir un YAC, se introducen en un plásmido las unidades
funcionales principales de un cromosoma de levadura:
1. Un centrómero (CEN4)
2. Una secuencia de replicación autónoma (ARS o Autonomous
Replicating Sequence).
3. Dos secuencias indispensables para la formación
de télomèros (TEL).
4. Varios marcadores de selección metabólica.
5. Un sitio de clonaje.

38. PARA HACER AL CROMOSOMA SE ABRE EL PLÁSMIDO
La construcción es dirigida por BamHI y SmaI, dando 3 fragmentos:
• El brazo izquierdo del cromosoma: contiene el centrómero; la
ARS y el telómero izquierdo.
• El brazo derecho del cromosoma contiene el telómero derecho.
• un fragmento central que separa los 2 telómeros en un plásmido
circular.
Los fragmentos del
vector así abiertos son
sometidos a la acción
de la fosfatasa alcalina
para impedir que se
vuelvan a unir. Cada
uno de los 3 fragmentos
porta un marcador de
selección (verde) y
cada uno de os brazos
porta un telómetro
(azúl).

39. PROCEDIMIENTO DE CLONACION
1. Digestión con BamHI y EcoRI. Desfosforilación de los extremos
5’. Esto linealiza el vector, dejando funcionales las secuencias
teloméricas. Se eliminan los marcadores His3 y Sup4.
2. Digestión de nuestra muestra con EcoRI. Selección de los
fragmentos por electroforesis y purificación.
3. Reacción de ligación: Da una molécula con
un centrómero y telómeros terminales.

40. 4. Se induce su entrada en células por electroporación. Se
clonan en gran cantidad en bacterias. Luego se extraen y
purifican y se introducen en levaduras por electroporación.
5. Se seleccionan las levaduras que portan el vector
mediante cultivo en un medio de cultivo sin Trp, sin Ura, con
His y con Adenina.
6. El vector se comporta como un cromosoma más de la
levadura.

44. APLICACIONES
 Las aplicaciones científicas más importantes sintéticas
será la producción de medicamentos poco usuales o
algunas vacunas, por ejemplo, la que se emplea para
combatir la hepatitis B.
 El objetivo de la biología sintética es utilizar esta
levadura como una “fábrica viva” de productos químicos.
 Sus futuras aplicaciones biotecnológicas incluyen la
fabricación de biocombustibles, medicamentos, e incluso
desarrollar organismos para la degradación de vertidos de
hidrocarburos o productos de desecho.

45. CROMOSOMA ARTIFICIAL
BACTERIANO (BAC)

46. ¿Qué es un cromosoma artificial
bacteriano?
 Es una molécula de ADN (vector de clonación)
utilizada para clonar secuencias de ADN en
las células bacterianas (por ejemplo, E. coli),
basado en el plásmido factor-F encontrado de
modo natural en la bacteria E. coli.

47. Plásmido de la fertilidad(Factor F)
 También son conocidos
como factores F los cuales
contienen tra-genes, son
capaces de conjugarse.
Importante papel con la
conjugación de la E coli.
 Contiene genes responsables
de la unión a la célula, y de la
transferencia del plásmido
ubicado entre cepas
bacterianas especificas en el
proceso de conjugación.
El factor F es un plásmido
que se replica
independientemente y que
transfiere información
genéticamente durante la
conjugación bacteriana.

48.  Dado el gran tamaño de los BAC recombinantes las estrategias de
introducción más eficientes han sido mediante electroporación.
 Un BAC típico consta de:
 OriS: origen de replicación del factor F.
 repE: control de la replicación del plásmido.
 parA, B, C: control de la replicación.
 CMr: cloranfenicol acetil-transferasa (CAT) (gen de resistencia
a cloranfenicol).
 LacZ’: con un polilinker en su interior.

50. PROCEDIMIENTO DE CLONACIÓN
 a) Se corta el vector con HindIII para linealizarlo.
 b) Se desfosforilan los extremos 5’ del vector para evitar autoligación.
 c) Se digiere nuestra muestra con HindIII o compatible. Se seleccionan
los fragmentos según su tamaño por electroforesis y se purifican.
 d) Llevamos a cabo la reacción de ligación.
 e) Transferencia de los vectores a una célula por electroporación.
 f) Selección de los clones en un medio con cloranfenicol y X-gal (son
positivos los que sobreviven en cloranfenicol y carecen de
actividad beta-galactosidasa).

52. APLICACIONES
 Los BAC se suelen utilizar en la secuenciación del ADN. Los segmentos
de ADN de un organismo, que van de 100.000 a cerca de 300.000 pares
de bases, se pueden insertar en BACs.
 Son introducidos en células bacterianas. A medida que las células
bacterianas crecen y se dividen, amplifican también el ADN de los
BACs, que después pueden ser aislados y utilizados en la
secuenciación del ADN.
 Los BACs son muy utilizados como vectores de clonación para la
construcción de genotecas genómicas, como en el Proyecto Genoma
Humano

53. TRANSPOSONES

54. TRANSPOSONES DE ADN
 Son regiones que en cuyos extremos hay pequeñas repeticiones
invertidas.
 Son secuencias de reconocimiento para la enzima TRANSPOSASA.

55. RETROTRANSPOSONES

56. RETROTRANSPOSONES
 Elementos transponibles.
 Casi la mitad del genoma humano está compuesto por 4
clases de elementos transponibles.
-SINE: Elementos cortos de ADN disperso.
-LINE: elementos largos de ADN disperso.
-LTR: elementos con repeticiones terminales largas.
-transposones de ADN.
Siendo los mas importantes Alus (SINE) y LINE1 (LINE).

57. PROCESO DE RETROTRANSPOSICION
 Tanto Alu como LINE1 son retrotransposones, por lo que su
replicación se da por transcripcion inerversa de un ARN
intermediario usando polimerasa II Y III.
 Se requiere intervención de enzimas como :
-Trasncriptasa inversa.
-Endonucleasa.

58. LINE1
 Longitud: 900pb
 866600 copias, 15.4% del genoma
 Tiene dos marcos de lectura
- ORF1: Fija el ARN del elemento LINE1 para su
transposición.
-ORF2: Codifica una transcriptasa inversa que posee dominio
de endonucleasa.
 Autonomos.

59. Alus
 1300000 copias, 11% del genoma humano.
 Longitud: 300pb.
 No codifica proteinas siendo ORF2 crucial para su replicación.
 En lugar de ORF1 utilizan SRP9/14 (guían al ribosoma) del SRP.
 Modelo del "gen maestro“.
- Pocas Alus en el genoma tienen la capacidad de hacer copias de si
misma y diseminarlas por el genoma, transponerse.
 Mutación diagnóstica. Permite clasificar Alu:
-AluJ (antiguos).
-AluS (medios).
AlusY (jóvenes).

60. LTR
 El genoma de ARN de los retrovirus acaba en repeticiones
directas y el proceso de retrotranscripción los convierte
en repeticiones terminales largas (LTR), parecidas a
repeticiones invertidas de los transposones de clase.
 Los provirus pueden ser considerados elementos
transponibles porque tienen el poder de transposarse de
un lugar a otro.