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Manual de prácticas guía

Este documento presenta el manual de prácticas del laboratorio de Microbiología General de la Universidad Autónoma Metropolitana. Incluye 10 prácticas sobre temas como preparación de medios de cultivo, tinción de microorganismos, métodos de cultivo bacteriano y de hongos, pruebas bioquímicas, efecto de factores ambientales en el crecimiento microbiano y curva de crecimiento. El manual proporciona instrucciones detalladas para cada práctica y recomendaciones para garantizar la seguridad en el laboratorio.

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Casa abierta al tiempo UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA manual de prácticas laboratorio MICROBIOLOGÍA GENERAL María de los Angeles Aquiahuatl Ramos María de Lourdes Pérez Chabela DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Rector General Dr. Luis Mier y Tetón Casanueva Secretario General Dr. Ricardo Solís Rosales UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA - Iztapalapa Rector Dr. José Lema Labadie Secretario Mtro. Luis Javier Melgoza Valdivia División de Ciencias Biológicas y de la Salud Director Dr. J. Gerardo Saucedo Castañeda Secretario Académico M. en C. Arturo L. Preciado López Departamento de Biotecnología jefe del Departamento Dr. J. Mariano García Garibay ISBN 970-31-0141-0 Primera Edición: 2004 Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa Av. San Rafael Atlixco No. 186 Col. Vicentina. Del. Iztapalapa, C.P. 09340 México, D.F. Impreso y hecho en México DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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Agradecemos al Director de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud Dr. Gerardo Saucedo Castañeda por todo el apoyo para la publica- ción de este manual de prácticas del laboratorio de ,¡ —*: :: ^ GENERAL Al Sr. Jorge Lodigliani por su apoyo en el procesado de las fotografías. Al Dr. Alfonso Totosaus y al Sr. Wilfrido Rodríguez por su ayuda en el diseño de las figuras. A toda la gente que revisó este manual, que con sus aportaciones enri- quecieron este trabajo. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
índice 7 PRESENTACIÓN 9 RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIANTE o •o PRÁCTICA # 1 o 12 Preparación y esterilización de materiales y medios de cultivo 14 Preparación del material de vidrio y medios de cultivo n 15 Esterilización de materiales y medios de cultivo t 15 Preparación de las cajas de Petri y tubos con medios de cultivo A a o 16 Prueba de esterilidad de materiales •o PRÁCTICA # 2 20 Preparación, fijación y coloración simple de frotis 22 Preparación de frotis 22 Fijación del frotis 23 Tinción simple 24 Observación al microscopio PRÁCTICA # 3 28 Tinción diferencial de Gram y tinciones selectivas 30 Tinción diferencial de Gram 31 Tinción selectiva de endosporas 31 Tinción negativa para observación de cápsulas 32 Observaciones al microscopio PRÁCTICA # 4 36 Métodos de cultivo y aislamiento de bacterias 38 Técnica de estría cruzada 38 Siembra en tubos con caldo y agar nutritivo 39 Siembra de cajas de Petri con medios diferenciales y selectivos 40 Condiciones de incubación PRÁCTICA # 5 46 Métodos de cultivo y descripción morfológica de hongos 48 Siembra de hongos 49 Descripción macroscópica de levaduras y mohos 49 Descripción microscópica de levaduras 49 Descripción microscópica de mohos en montaje con cinta adhesiva PRÁCTICA # 6 54 Pruebas de diferenciación bioquímica 56 Técnica de Inoculación en cajas de Petri 57 Técnicas de Inoculación en tubos 57 Evaluación de actividades metabólicas manual de prácticas del ?>l~ ' T " ; Ir fX {, f * 4#% „* } ':"'-, ;': ; f *í ," *' " J-' <-'" ^ o < , DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
PRÁCTICA # 7 64 Métodos de cuantificación de microorganismos 66 Técnica turbidimétrica 67 Técnica de cuenta directa en cámara de Neubauer 68 Técnica de dilución y siembra en placa PRÁCTICA # 8 74 Efecto del pH y la temperatura en el crecimiento microbiano 76 Efecto de la Temperatura 77 Efecto del pH PRÁCTICA # 9 (O 82 Efecto de la actividad de agua en el crecimiento microbiano a 84 Efecto de la presión osmótica y actividad de agua (aw) en hongos y bacterias 84 Efecto de la desecación PRÁCTICA # 10 90 Curva de crecimiento bacteriano 92 Inoculación e incubación del cultivo 92 Tratamiento de las muestras 97 BIBLIOGRAFÍA GENERAL 101 Anexo 1 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Y COLORANTES 105 Anexo 2 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 115 Anexo 3 ATLAS DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
La Microbiología, es una ciencia relativamente reciente con respecto a otras ramas de la Biología. El estudio de los microorganismos se inició a partir de que Antonie van Leeuwenhoek en 1670 inventó el microscopio, y que a partir de los estudios de Luis Pasteur en 1876, se logró el mayor desarrollo y reconocimiento de los microorganismos o como actores de una gran diversidad de procesos. •o Aunque durante mucho tiempo estos organismos causaron graves problemas de en- i fermedades en plantas, animales y humanos también es cierto que desde la antigüedad algunas especies microbianas han sido utilizadas en procesos de producción de alimentos fermentados como quesos, vino, pan y cerveza, entre I I o otros y actualmente se ha reconocido su importancia en diversas áreas de inves- •o tigación básica, en la industria alimentaria, ambiental y farmacéutica. El objetivo general del curso práctico de Microbiología General es que el alumno se inicie en el conocimiento de la biología básica de los microorganismos, en sus características morfológicas, nutricionales de crecimiento, control y que ad- quiera las habilidades necesarias para su manipulación en el laboratorio. Este manual está dirigido a estudiantes que iniciarán su experiencia en el manejo de los microorganismos, por lo que consideramos de gran importancia incluir al principio del mismo una serie de recomendaciones relacionadas con las reglas generales del laboratorio y los principales procedimientos que el estudiante deberá aprender, para que manipule en forma adecuada a los microorganismos y garantizar tanto su seguridad como la de sus compañeros. Este manual contiene 10 prácticas, diseñadas para que el estudiante se familiarice gradualmente con los procedimientos de cultivo y observación de bacterias y hongos. El orden de presentación, corresponde al programa del curso teórico trimestral de Microbiología General, que forma parte del plan de estudio de las carreras de Ingeniería de los Alimentos e Ingeniería Bioquímica Industrial im- partidas en la UAM-Iztapalapa. En cada práctica se presentan los Objetivos y una breve Introducción para facilitar la comprensión de los mismos, después se indican los Materiales necesarios y Procedimientos a realizarse en forma de instrucciones numeradas que se com- plementan con figuras y esquemas. Posteriormente, en cada práctica se proponen formas de presentación de los resulta- dos en cuadros, para que el alumno recopile sus observaciones. También se inclu- yen preguntas en forma de cuestionarios que el estudiante debeiá resolver con- sultando los materiales bibliográficos sugeridos al final de este manual. También se presentan tres Anexos que contienen las indicaciones para la preparación de soluciones y colorantes (anexo 1) y de medios de cultivo (anexo 2), necesa- rios para la realización de cada una de las prácticas; así como uno (anexo 3) de fotografías ilustrativas de algunos procedimientos y pruebas bioquímicas de diferenciación microbiana. manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Consideramos que este material puede ser de gran ayuda para los profesores y alumnos de la UAM en el curso de Microbiología General, está elaborado de acuerdo a la infraestructu- ra de los laboratorios y a la programación trimestral del curso, con sesiones de 4 horas/ semana. Dra. Ma. de Los Angeles Aqulahuatl Dra. Ma. de Lourdes Pérez Chabela i a o DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIA!* Reglas de laboratorio 1. Durante las sesiones, siempre deberá usar una bata de laboratorio bien abotonada, que deberá quitarse antes de abandonar el laboratorio. 2. No deberá sacar del laboratorio ningún equipo, medios o cultivos microbianos. 3. Evitar la acumulación sobre la mesa de trabajo de objetos no relacionados con la práctica de laboratorio. Colocar todos los objetos personales (libros, mochilas, etc.) en la zona especificada por el profesor. a •o 4. Se prohibe ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimento o bebida dentro del laboratorio. 5. Se prohibe fumar, aplicarse cosméticos o tocarse la cara con las manos o algún otro objeto. Se deberá lavar meticulosamente las manos con jabón y agua antes de salir del laboratorio, incluso cuando salga por breves periodos. 6. Por seguridad no debeiá pipetear oralmente ningún tipo de cultivos microbianos, esta actividad deberá realizarse con pipetas accionadas de forma mecánica o automática, tratando de evitar la formación de aerosoles. 7. No se admitirán visitas personales que distraigan la atención y pongan en riesgo la seguridad en el trabajo que se realiza. Procedimientos de laboratorio 1. Antes y después de cada sesión piáctica los alumnos deberán limpiar las mesas de trabajo con el desinfec- tante que se le proporcionará para este fin. 2. Cuando se utilice el mechero, este deberá colocarse alejado del microscopio y otros equipos así como de sus cuadernos o prendas de vestir. 3. Al concluir cada sesión el estudiante deberá asegurarse de que los materiales de desecho u objetos contami- nados sean colocados en recipientes específicos para ello, colocados en lugares apropiados, que les indicará el profesor. 4. Siempre deberá dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados (microscopios, balanzas analíticas, autoclave, potenciómetros, etc.) y reportar al maestro cualquier irregularidad en el funcionamiento. 5. En caso de producirse un incendio o una herida personal, el alumno deberá notificarlo de inmediato al profesor. En el caso de derrame de cultivos o rotura de recipientes con cultivos activos, deberá conservar la calma y además de informar al profesor, seguir inmediatamente el procedimiento: a. Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersión b. Poner abundante solución desinfectante sobre las toallas manual de prácticas del LABORATORIO PE NIICROBlOLOGt** DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
c. Dejar transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el receptáculo destinado a la eliminación de materiales contaminados. Materiales indispensables en cada sesión de laboratorio 1. Bata de laboratorio limpia y con botones 2. El protocolo de la práctica y bitácora de laboratorio 3. Un pedazo de tela sin pelusa, cerillos, tijeras, cinta de enmarcar, marcador indeleble o etiquetas pequeñas. i DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
o o o Preparación y esterilización de materiales y medios de cultivo DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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Objetivos introducción Que el alumno conozca los principios Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cam- generales de las técnicas de estéril!- bios de condiciones ambientales y en la medida en que se han podido zación de materiales de vidrio y me- adaptar a estos cambios, se han distribuido en una gran diversidad de dios de cultivo de uso común en Mi- hábitats incluyendo los de condiciones extremas sobre todo de tipo físi- crobiología. Observará el efecto de co y químico. o trol de la contaminación microbiana Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfección y este- en el laboratorio. rilización para limitar su presencia o eliminarlos. La esterilización es un método de eliminación total de todo tipo de organismo y que asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente, mientras que la desinfección es un proceso que solamente elimina formas vegetativas de los microorganismos. La esterilización con calor seco y húmedo son los procedimientos de mayor utilización en Microbiología. El calor seco desnaturaliza las enzimas y destruye a los microorganismos por oxidación, por ejem- plo al ponerlos directamente a la flama de un mechero o en horno a 150-180°C durante 2 horas. Estos métodos se aplican principal- mente en la esterilización de asas de inoculación y todo tipo de material de vidrio y quirúrgico. Los procesos con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de cul- tivo, soluciones, y cultivos bacterianos que se desechan, el más recomendable es el autoclave en el que se utiliza vapor de agua a presión para alcanzar temperaturas de 121 °C. El material se deja a esta temperatura durante 15 minutos para asegurarse de la destruc- ción de endosporas, que son las estructuras bacterianas más resis- tentes al calor. Cuando se requiere esterilizar diferentes materiales sensibles al calor como las soluciones de vitaminas, aminoácidos, etc. se esterilizan por filtración en membranas estériles de 0,2 mieras de diámetro y para el caso de materiales plásticos es recomendable el uso de gases como oxido de etileno o con radiaciones gamma. Las superficies generalmente se desinfectan con radiaciones U.V. o compuestos químicos en forma líquida como: los fenoles, compuestos cuaternarios de amonio (alquildimetil bencilamonio), formaldehído, alcoholes, halógenos y detergentes. Cada uno de estos procedimientos tienen ventajas y desventajas de uso, los sistemas de filtración son muy eficientes y rápidos para la este- rilización pero sólo se aplican en pequeños volúmenes. Los fenoles y compuestos cuaternarios de amonio son muy efectivos para la desinfección de superficies pero son muy corrosivos. Los detergentes y los alcoholes tienen actividad limitada contra espo- ras bacterianas y algunos virus por lo que sólo son desinfectantes. 13 m a n u a l d e p r á c t i c a s d e l - * . . ' . ; .,'-.*.,:;...?. ::* ' , < ; >•<*., - r - r . r - - " • * ' DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Materiales 7 tubos de cultivo de 16 x 150 mm con tapón de baquelita 3 tubos de cultivo de 16 x 150 mm sin tapón de baquelita 9 cajas de Petri de vidrio 3 pipetas de 1 o 2 mL 3 pipetas de 10 mL 1 pipeta Pasteur 3 matraces Erlenmeyer de 250 mL 1 parrilla de calentamiento con agitación (O 1 autoclave a 1 potenciómetro 1 horno de calor seco 1 mechero Fisher 1 incubadora a 35°C 1 hisopo estéril, algodón y gasa papel manila o estraza para envolver Caldo nutritivo (Anexo 2.1) Medio de agar nutritivo (Anexo 2.2) Medio de agar papa dextrosa PDA (Anexo 2. 6) Medio mínimo de sales (Anexo 2.3 ) Soluciones amortiguadoras pH 4 y 7 Procedimiento El profesor explicará los principios generales de trabajo en el laboratorio de Microbiología, enfatizando en la desinfección de áreas así como en la preparación y esterilización de los medios de cultivo y materiales necesarios para el trabajo cotidiano con microorganismos. También hará las demostraciones necesarias para que el estudian- te aprenda a envolver los materiales, así como su manejo en condiciones asépticas. Preparación del material de vidrio y medios de cultivo 1. Lavar perfectamente las cajas de Petri y pipetas con escobillón y detergente. Enjuagar con abundante agua corriente. 2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada con una piceta, por las paredes interio- res. Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel de envoltura. No debe secar el material por ningún otro medio. 3. Una vez seco el material, se procederá a envolver las cajas de Petri y pipetas con papel de estraza. Para los tubos y matraces se elaborarán tapones de algodón y gasa, procurando que ajusten con holgura, sobre los que finalmente se les colocará un capuchón de papel. 4. Preparar 20 mL de Caldo Nutritivo (CN) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y ajustar el pH a 6.5-7.0 en un potenciómetro, agregando con una pipeta Pasteur poco a poco solución de HCI 0.1 M o solución de NaOH 0.1 M, en caso de que el pH sea más alcalino o ácido respectivamente. Vaciar 5 mL en cuatro tubos de cultivo con tapón de baquelita que deberán cerrar sin llegar al tope. 14 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
5. Preparar 120 mL de Agar Nutritivo (AN), calentar la mezcla en una parrilla con agitación constante hasta ebullición, durante 1 minuto (cuidar que no se proyecte) y vaciar enseguida 5 mL de medio en tres tubos con tapón de rosca. Enjuagar inmediatamente la pipeta para evitar que se solidifique el agar. El resto se esteriliza en el autoclave. 6. Preparar 120 mL de medio de cultivo Papa dextrosa agar (PDA) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL, ajustar el pH del medio a 5.0-5.6. Colocar un magneto de agitación y calentar hasta ebullición durante 1 minuto; cuidando de que no se proyecte o derrame. Posteriormente vaciar 7 mL de medio en tres tubos que se taparán con tapón de algodón y gasa. El resto se esteriliza en el autoclave. 7. Preparar 120 mL de medio de cultivo Mínimo de sales (MM) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL a I Esterilización de materiales y medios de cultivo •o o 1. Las cajas de Petri y pipetas envueltas se colocaran en horno a 150 °C durante 2 horas. Después de sacarlas, dejarlas enfriar y abrir los paquetes únicamente en área aséptica. 2. Los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de acuerdo a las siguientes instrucciones: a. Revisar que el nivel de agua coincida con la marca en el tubo indicador. En caso necesario añadir agua destilada. b. Conectar la autoclave y poner la perilla de control en calentamiento alto. Acomodar los medios y materia- les en la canasta del autoclave y colocarla dentro. c. Cerrar la puerta, apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada y esperar a que salga el vapor de agua por el orificio de purgado. Después cerrar este orificio con la válvula de seguridad. d. Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121 °C o 15 Ibs de presión revisando continuamente la escala del manómetro. Una vez alcanzada esta temperatura deberá bajarse el nivel de calentamiento mo- viendo la perilla de control al nivel medio o bajo. e. Mantener el equipo en estas condiciones durante 15 minutos f. Apagar la autoclave y dejar que baje la presión al valor de "0". Quitar la válvula de seguridad y con la ayuda de guantes de asbesto o una jerga húmeda abrir cuidadosamente la puerta, de adelante hacia atrás para evitar quemaduras por la salida del vapor. Preparación de las cajas de Petri y tubos con medios de cultivo 1. Los tubos con medios de cultivo con agar, se deberán colocar en una superficie inclinada de tal forma que el medio se solidifique a una distancia aproximada de 1-2 cm de la boca del tubo. 2. Dejar que los medios de cultivo en matraces que se han sacado de la autoclave se enfríen a una temperatura aproximada de 40-50 °C, que coincide con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin sentir un calor excesivo. 3. Cerca del mechero, etiquetar 3 cajas con AN, 3 cajas con PDA y 3 con MM. Los medios de cultivo se vacían en las cajas de Petri (aproximadamente 25-30 mL) en zona aséptica cerca del mechero o en campana de flujo laminar. 4. Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 30 minutos) y posteriormente envolver las cajas cuidado- samente con papel estraza o acomodarlas en forma invertida en bolsa de plástico limpias. 5. Guardarlas en refrigeración hasta 24 horas antes de utilizarlas. 15 1 manual de prácticas del LABORATORIO PE «ICIlCIBiOLCIGÍJI S E Ü I A L DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Prueba de esterilidad de materiales 1. Colocar los tubos con agar inclinado y las cajas de Petri en forma invertida en una estufa de incubación ajustada a 30 °C durante 24-48 horas. 2. Revisar los tubos y cajas de Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la aparición de turbidez, nata superficial y/o depósito de material en el fondo de los tubos con medio líquido; así como la formación de colonias microbianas en la superficie de medios sólidos. 3. Si no hay contaminación de los medios, se abrirá una de las cajas de Petri de cada medio durante 1 minuto en el laboratorio o zonas accesorias al mismo y se etiquetará como"al aire". (0 CQ 0 4. La otra caja de cada medio de cultivo se abre durante 30 segundos cerca del mechero y se etiquetará "en área aséptica". 5. La tercer caja se conservará sin abrir y se etiqueta como "control". Resultados A. Hacer la descripción morfológica de las colonias obtenidas en las cajas con diferentes medios de cultivo (AN, PDA y MM) y con los distintos tratamientos en relación a la caja control. B. Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco crecimiento, (++) crecimiento regular y (+++) crecimiento abundante. C. Discuta los resultados y determine si la esterilización en el autoclave y horno fue adecuada, así como el manejo de los materiales. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Cuadro 1 Descripción morfológica de microorganismos en cajas de Petri con diferentes medios de cultivo. MEDIO Abierta al aire Abierta en área Control DE CULTIVO aséptica a AGAR t NUTRITIVO A a « MÍNIMO DE SALES PAPA DEXTROSA AGAR Cuestionario 1) ¿Cuáles son los métodos de esterilización más utilizados en Microbiología? ¿En que tipo de materiales se aplica cada uno? 2) Explique cuáles son las diferencias entre los procesos de esterilización, desinfección y asepsia. ¿Cómo se relacionan estos procedimientos con la pasteurización? 17 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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• o o Preparación, fijación y coloración simple de frotis DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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Objetivos Introducción Que el alumno aprenda las técnicas Debido al pequeño tamaño de la mayoría de los microorganismos, se de preparación de frotis, de fijación requiere de un microscopio óptico, ya sea de campo claro o de campo y coloración más utilizadas en el es- oscuro para hacer la descripción morfológica de éstos. El microscopio de tudio microscópico de cultivos uso más común es el de campo claro, en el que la observación de células o •o bacterianos, obtenidos de medios vivas es limitada debido a que las células son incoloras y permiten el paso o sólidos y líquidos. Que identifique las de una gran cantidad de luz. principales formas bacterianas y la importancia de las tinciones simples en la caracterización morfológica de La observación de frotis teñidos es más recomendable. El frotis se prepara haciendo una extensión de los microorganismos sobre una superfi- a I estos microorganismos. cie transparente, en la cuál se fijan y tiñen los microorganismos. o •o De acuerdo al número de soluciones colorantes y a los objetivos de estudio se pueden realizar diferentes tipos de tinciones como son: simple, diferencial, negativa y selectiva. Los frotis de cultivos líquidos se deberán fijar con alcohol para evitar resi- duos del medio, que al quemarse darán interferencias en las obser- vaciones y los de colonias de medios sólidos se fijan generalmente con calor. Después de la fijación, los frotis son teñidos con diferen- tes colorantes sintéticos derivados de anilina. Los colorantes más utilizados son sales formadas por iones coloridos car- gados conocidos como cromóforos. Por ejemplo: Cloruro de Azul de metileno Azul de metileno* + ci- (Cromoforo) Si el cromoforo es un ion positivo el colorante es de tipo básico, pero si la carga es negativa será de tipo ácido. La mayoría de las bacterias son teñidas por colorantes básicos, que permean la pared celular y se adhieren por enlaces iónicos débiles a moléculas con cargas nega- tivas de la célula bacteriana. La tinción de las bacterias con azul de metileno, es un ejemplo de tinción simple que facilita la observa- ción de forma, tamaño y arreglo de las células. 21 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Materiales 1 Probeta de 100 mL 1 Vaso de precipitados de 100 mL 1 mechero 1 asa de siembra 5 Portaobjetos Piceta con agua destilada Microscopio compuesto de campo claro Azul de metileno alcalino (Anexo 1.2) Alcohol etílico al 70% (Anexo 1.7) (0 Fenol al 2% (Anexo 1.9) CQ Aceite de inmersión o Procedimiento El profesor proporcionará a los alumnos cultivos líquidos y sólidos de: Escherichla col¡, Streptococcus sp., Staphylococcus sp., Badllus subtilis, Klebsi'ella sp. y Pseudomonas fluorescens. El estudiante preparará frotis de cada cepa obtenida de cultivo sólido y otros de cultivo líquido, los cuales fijará y teñirá con azul de metileno. El profesor explicará los principios de manejo del microscopio y la forma de ajustar la iluminación. Preparación de frotis 1. Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos (Figura 1). 2. Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo. 3. Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos. Después acercar al mechero el tubo de cultivo, quitarle el tapón y flamear rápidamente la boca del mismo. Introducir el asa en el tubo de cultivo y tomar cuidadosamente la muestra. 4. Para el caso de cultivos líquidos, colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extenderla suavemente en un área circular de 2 cm. de diámetro aproximadamente y esterilizar nuevamente el asa. Dejar secar el frotis al aire y repetir los procedimientos 3 y 4 por 2-3 veces más. 5. Si el cultivo es de medio sólido, previamente se colocará en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada en la que se mezcla una pequeña muestra del cultivo que se toma siguiendo las indicaciones del paso 3. Extenderla suavemente y dejar secar al aire. Fijación del frotis 1. Fijar los frotis de cultivos líquidos con dos gotas de metanol o etanol absoluto y dejar secar al aire (hacer esto en zonas alejadas al mechero). 22 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
2. Los frotis de cultivos sólidos, completamente secos se fijarán con calor. Para esto se pasaiá el frotis rápida- mente 2-3 veces en el interior de la parte amarilla de la flama del mechero. 3. Palpar la parte inferior del portaobjetos con el dorso de la mano izquierda para enfriar y comprobar que no hubo sobrecalentamiento. Tinción simple | i 1. Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto. 2. Eliminar el exceso de colorante con lavado suave al agua corriente o con la ayuda de la piceta con agua a destilada. o •o 3. Dejar secaral aire Marcar el área por debajo del portaobjeto CULTIVO SÓLIDO CULTIVO LIQUIDO Coloque 1 o 2 gotas de agua Colocar 1 o 2 asadas de medio de cultivo con asa estéril Con asa estéril tomar una Distribuir en la zona marcada muestra de la colonia y mezclarla con el agua Dejar secar al aire Dejar secar al aire. Repetir los procedimientos anteriores dos veces Fijar con 2 gotas de alcohol, y Pasar rápidamente sobre la dejar secar al aire flama del mechero Figura 1. Preparación y fijación de frotis bacterianos a partir de cultivos sólidos y líquidos manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Observación al microscopio 1. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda. 2. Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observación, siguiendo las indicaciones del profesor. 3. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparación con el objetivo de 10X, posterior- mente pasar al de 40X. Para la observación con el objetivo de 100X, colocar previamente una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación. 4. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de aceite y evitar incrustaciones que dañan estos sistemas. Resultados A. Reportar las observaciones de forma, agrupación y tamaño relativo de cada uno de los microorganismos en el cuadro de resultados. B. Comparar sus observaciones con las reportadas en la literatura. 24 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Cuadro 2 Observaciones microscópicas de frotis de cultivos bacterianos Escherichla coll Streptococcus sp. Cultivo: Líquido 0) (0 Aumento total: t (0 a Forma: (cocos, bacilos, etc.) Agolpamiento de las células (solos, pares, cadenas, etc.) Tamaño: Cultivo: Sólido Aumento total: Forma: (cocos, bacilos, etc. Agrupamiento de las células (solos, pares, cadenas, etc.) Tamaño: Cuestionario 1. Investigue cuáles son las estruauras celulares o moléculas responsables de la tinción simple realizada. De ejemplos de otros colorantes que podrían utilizarse. 2. ¿Por qué se recomienda fijar los frotis de cultivos líquidos con alcohol y no con calor? ¿Por qué se deben poner varias veces muestras del cultivo líquido y sólo una muestra de cultivos sólidos al preparar los frotis? 25 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
3. ¿Cuáles son las principales precauciones de manejo del microscopio y por qué se debe utilizar el aceite de inmersión al hacer el estudio microscópico de bacterias? 4. ¿Cuáles son las desventajas o limitaciones de la tinción simple? a o 5. ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la preparación de frotis? 6. Bibliografía consultada Referencias bibliográficas • Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Practicas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México. • johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings Publishing Company, Inc. USA. • Practical Handbookof Microbiology. William MO'Leary, Cornell Medical College, New York, New York, USA. CRC Press, 1989. • Holt, J. G., N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
z s ' - Í ' , -'- 0 Tinción diferencial de Gram y tinciones selectivas DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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Objetivos introducción Que el estudiante clasifique algunas La tinción propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, es una especies bacterianas en Gram positi- de las tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifi- vas o Gram negativas de acuerdo a la ca los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y tinción de Gram. Que observe estruc- Gram negativas. El método se fundamenta en el hecho de que el coloran- turas bacterianas especiales, como las te primario (cristal violeta) tiñe por igual a todas las bacterias, pero la endosporas y cápsulas con tinciones combinación con el colorante es más permanente en los gram positivos. selectivas. Que comprenda la impor- tancia que tienen estas tinciones para Para establecer la diferenciación en estos dos grupos, se aplica un disol- la caracterización e identificación de vente del colorante primario que no tiene efecto sobre el grupo de las bacterias. microorganismos que lo retienen firmemente, pero lo elimina de aquellos que no son capaces de retenerlo, quedando por lo tanto completamente decolorados. En estas circunstancias, sería muy di- fícil su observación por lo que es preciso tratarlos con otro colorante llamado secundario, como la safranina. Este colorante no modifica el color de los microorganismos que habían retenido el color prima- rio, pero tiñe a los microorganismos decolorados. Estas diferencias de tinción de las bacterias se explican por cambios en la composición química y estructura de las paredes celulares, que faci- litan la retención o eliminación del colorante primario después del proceso de decoloración. Otras tinciones que permiten obtener mayor información son la negativa y la selectiva. La tinción negativa facilita las observaciones de la morfología y tamaño de las bacterias sin alteración por efecto del calor así como de estructuras especiales, como la cápsula de algu- nas especies bacterianas. La cápsula también llamada glicocálix es una estructura externa a la célula, formada de polisacáridos o polipéptidos, que confiere protección a las bacterias contra la dese- cación y la fagocitosis. La extensión sobre un portaobjetos en forma de capa fina de una mezcla de las bacterias con tinta china o nigrosina, permite observar en el microscopio estructuras especiales como son las cápsulas, que apa- recen como una zona clara que rodea la célula bacteriana en un fondo obscuro. Las tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas como las endosporas de Bacillus y Clostridium, bacterias en las que su presencia, forma y localización son importantes criterios de clasifi- cación taxonómica. Además, debido a la resistencia al calor de las endosporas y a que algunas especies son microorganismos patógenos de gran toxicidad, su de- tección en microbiología alimentaria y médica adquiere gran interés. manual de prácticas del arabio m: DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Materiales 1 Probeta de 100 mL 1 Vaso de precipitados de 100 mL 1 Parrilla de calentamiento 1 Mechero 5 Portaobjetos 1 Piceta con agua destilada Cristal violeta (Anexo 1.3) Safranina (Anexo 1.8) Lugol (Anexo 1.5) Solución de alcohol-acetona (Anexo 1.6) en Verde de malaquita (Anexo 1.4) Tinta china Fenol 2% (Anexo 1.9) Aceite de inmersión Microscopio compuesto de campo claro Procedimiento El profesor proporcionará a los alumnos cultivos líquidos y sólidos de: Escherichia coll, Streptococcus sp., Staphylococcus sp., Badllus subtills y Klebsiella sp. El estudiante preparará frotis de cultivo sólido y de cultivo líquido de cada microorganismo y aplicará la tinción de Gram. También realizará la tinción seieaiva de endosporas en un frotis fijado al calor de Badllus subtilis y la tinción negativa en cultivos de K/ebsfef/a sp. Tinción diferencial de Gram a) Cubrir el frotis con 2 gotas de cristal violeta durante 30 segundos a 1 minuto b) Lavar cuidadosamente el frotis con agua de la llave o destilada para eliminar el exceso de colorante c) Sacudir un poco y sin dejar secar cubrir el frotis con 2 gotas de lugol por 30 segundos. d) Lavar cuidadosamente el frotis con agua. e) Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante dejando que escurra hasta que no fluya más tintura. f) Inmediatamente lavar con agua. g) Aplicar 2 gotas de safranina durante 30 segundos. h) Lavar nuevamente con agua, eliminar cuidadosamente el exceso de agua con una toalla de papel y dejar secar al aire. i DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Tinción selectiva de endosporas a) Colocar un pequeño trozo de papel filtro sobre el frotis de Bacillus subtilk (Figura 2). b) Agregar verde de malaquita sobre el papel filtro de tal manera que cubra toda la preparación. c) Colocar el portaobjetos sobre un vaso de precipitados con agua en ebullición. d) Dejar durante 5 minutos evitando que se seque el colorante (agregar un poco más sí es necesario) y eliminar el colorante con agua destilada. t e) Cubrir con safranina durante 30 segundos. a "O f) Lavar nuevamente y dejar secar al aire. (a) (b) (e) Figura 2. Tinción selectiva de endosporas bacterianas Tinción negativa para observación de cápsulas a) Colocar una pequeña gota de tinta china en el extremo de un portaobjetos; colocar junto una gota del I cultivo líquido de Klebsiella sp. (Figura 3). Si se trata de un cultivo sólido, hacer una suspensión del micro- organismo en una gota de agua destilada y mezclar cuidadosamente con la tinta china. b) Distribuir la mezcla a lo ancho del portaobjetos, colocando otro portaobjeto perpendicular en ángulo de 45° sobre la muestra. 31 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
c) Desplazar poco a poco el segundo portaobjetos a lo largo del primero para hacer una capa fina de la mezcla. d) Dejar secar al aire. (a) 10 a o (d) Figura 3. Técnica de tinción negativa Observaciones al microscopio 1. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda. 2. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparación con el objetivo de 10X, posterior- mente pasar al de 40X. Para observar con el objetivo de 100X colocar previamente una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación. 3. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de aceite y evitar incrustaciones que dañan a estos sistemas. Resultados A. Reportar las observaciones de forma, agrupación, color y tamaño relativo tal como se indica en el Cuadro 3 de resultados. Hacer los dibujos de la morfología de cada uno de los microorganismos y colorearlos. B. Comparar las observaciones realizadas con las reportadas en la literatura. 32 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Cuadro 3 Descripción microscópica de cultivos baaerianos Descripción del cultivo: (líquido •o o sólido, edad del cultivo, etc.) I o Aumento total: cu t ti Forma: cocos, bacilos a Agolpamiento de las células •o Tamaño: Reacción de Gram TINCIÓN DE ENDOSPORAS Badllus subtills Streptococcus sp Descripción del cultivo: (líquido o sólido, edad del cultivo, etc.) Aumento total: Forma: cocos, bacilos Agrupamiento de las células Tamaño: TINCIÓN DE CÁPSULA Klebsiellasp. Streptococcus sp Descripción del cultivo: (líquido o sólido, edad del cultivo, etc.) Aumento total: Cuestionario 1. Explique en forma completa la teoría que explica la tinción de Gram. Investigue otros dos ejemplos de tinción diferencial. 33 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
2. ¿Cuáles son las fuentes de error más comunes en la tinción de Gram? 3. ¿Explique que reacción de Gram darán los cultivos de levaduras? ¿Estos resultados tendrán la misma impor- tancia que para las bacterias? ¿Por qué? 4. Explique el fundamento de la tinción de endosporas. ¿Por qué se debe calentar la preparación? ¿Que dificul- tades se tendrían si no se adiciona la safranina al final de la tinción? 5. Explique el fundamento de la tinción negativa realizada en la práctica.¿Qué tipo de información se obtiene? Investigue otra técnica de tinción selectiva que permita observar estas estructuras bacterianas. 6. Bibliografía consultada Referencias bibliográficas • Johnson T.R. and C L. Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings Publishing Company, Inc. EEUUA. • Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana. México. • Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition) Edited by Francés Pouch Downes and Keith Ito, 2001. • Practical Hahdt^ic of Microbiology. William M O'Leary, Cornell Medical College, New York, New York, USA. CRC Press, 1989. • Holt, J. G., N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA. j DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
^ í - w'íV ^ Métodos de cultivo y aislamiento de bacterias DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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Objetivos Introducción Que el alumno conozca las diferen- Las bacterias deben ser cultivadas en medios de cultivo de laboratorio tes técnicas de aislamiento en me- para caracterizar su crecimiento, hacer su identificación y determinar sus dios de cultivo sólido para la obten- actividades metabólicas. Un medio de cultivo es una solución acuosa de ción de cultivos puros de bacterias, diferentes compuestos que contiene todos los elementos indispensables Que el estudiante prepare medios de que requieren los microorganismos para crecer, •o i cultivo de uso general, diferenciales y selectivos para el cultivo de dife- Generalmente las bacterias son inoculadas o introducidas en medios líquidos rentes especies bacterianas. (caldos) o solidificados con agar para su propagación y/o conserva- ción, así como para estudiar sus características de crecimiento. Es im- portante recordar que la inoculación de los microorganismos en los medios de cultivo, siempre debelan realizarse en zona aséptica (cerca i del mechero o en campana de flujo laminar), condiciones que limitan 8. •o la presencia de microorganismos indeseables o contaminantes. Las técnicas de aislamiento, permiten la obtención de microorganismos a partir de muestras complejas (suelo, agua, alimentos, etc.) en las que hay una gran diversidad microbiana, así como para comprobar la pureza de los cultivos obtenidos. Los cultivos puros están forma- dos por un solo tipo de microorganismo; y son indispensables para conocer las características morfológicas, propiedades de tinción, actividad bioquímica, patogeniddad, sensibilidad a antibióticos e identificación de las especies microbianas. El aislamiento de cultivos microbianos puede realizarse por métodos de dilución, en medios sólidos por estría en placa o en medios líqui- dos. En el primer caso se considera que cada célula bacteriana que se separa daiá origen a una población que formará una colonia ca- racterística, visible a simple vista. La limitación principal de estas técnicas de dilución, es que no es práctica para el aislamiento a partir de mezclas donde el microorganismo de interés se encuentra en pequeñas cantidades, donde solamente se obtendrán las bacterias dominantes. Para favorecer el aislamiento de cultivos de baja densidad, se aplican mé- todos de cultivo especiales, en los que se utilizan medios que con- tienen nutrientes especiales, antibióticos, altas concentraciones de sales y/o condiciones de pH, luz o temperatura para favorecer el crecimiento del microorganismo de interés y se conocen como se- lectivos o de enriquecimiento. En ocasiones se pueden agregar a los medios de cultivo otros componen- tes como: sangre, colorantes, indicadores, etc. para distinguir espe- cies bacterianas diferentes por la forma en que metabolizan los sustratos que se manifiesta por cambios en la apariencia o modifi- cación del pH del medio de cultivo. Estos medios se conocen como medios diferenciales y son de gran utilidad para la caracterización e identificación de especies bacterianas. manual de prácticas del LABORATORIO ÍJ£ MICROBIOLOGÍA GENERAL _t DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Materiales 3 cajas de Petri con Agar nutritivo (Anexo 2.2) 2 cajas de Petri con Agar de eosina azul de metileno EMB (Anexo 2.3) 2 cajas de Petri con Agar para Estafilococos 110 (Anexo 2.5) 2 cajas de Petri con Medio Mínimo de sales (Anexo 2.3) 1 tubo con agua destilada estéril 2 tubos con Caldo Nutritivo (Ver Anexo 2.1) 4 tubos con Agar Nutritivo (Ver Anexo 2.2) 1 Mechero tú 1 Asa d e inoculación 0 1 Parrilla d e agitación 1 Autoclave Procedimiento El profesor proporcionará cultivos puros de Bacillussubtilis, Escherichia colí, Staphylococcusaureus, Pseudomonas fluorescens, Klebslella sp. y Streptococcus sp. También les proporcionará una muestra problema por equipo (con dos microorganismos diferentes) en la que practicarán la técnica de aislamiento por estría cruzada. Técnica de estría cruzada a) En la parte posterior y exterior de la caja, dividirla en cuatro cuadrantes. Tomar una muestra con el asa previamente flameada y fría, inocular la muestra haciendo 4-5 estrías simples muy juntas de lado a lado sobre el primer cuadrante de la caja, cerrar la caja (Figura 4). b) Flamear el asa de inoculación y hacer girar la caja de Petri un cuarto de vuelta. Abrir nuevamente la caja y enfriar el asa de siembra tocando la superficie del medio lejos de la zona de estrías recién hechas. c) Rozar con el asa una vez la superficie del conjunto original de estrías y hacer un segundo grupo de estrías en el segundo cuadrante como en el caso anterior. d) Repetir el procedimiento 4 y 5 en el tercer cuadrante y al efectuar la siembra en el último cuadrante, no se deberá flamear el asa de siembra y se hará una estría más abierta (simple). Siembra en tubos con caldo y agar nutritivo 1. Sembrar un cultivo puro diferente en cada uno de los dos tubos con caldo Nutritivo y en tubos con agar nutritivo inclinado. 2. Sembrar con el asa extendida los mismos cultivos puros en otros dos tubos con agar nutritivo solidificado en forma recta (Figura 5). . DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
•o o I cu a 0) Figura 4. Aislamiento de bacterias por estría cruzada en placa (a) (b) Figura 5. Siembra de medios con agar por estría simple (a) en tubos inclinados y por picadura (b) en tubos solidificados en forma recta. Siembra de cajas de Petri con medios diferenciales y selectivos 1. Dividir en tres partes, una caja de Petri con EMB Agar, otra con Agar 110 y una de MM. Sembrar en cada parte un cultivo puro diferente por estría simple. 2. En otra serie de tres cajas con cada uno de los medios antes descritos, sembrar por estría cruzada la muestra problema. 39 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Condiciones de incubación 1. Incubar las cajas en forma invertida a 35°C durante 24 horas. De las cajas inoculadas por estría cruzada, seleccionar la colonia más aislada (generalmente del cuarto cuadrante). Transferir una pequeña muestra de esta colonia a tubos inclinados con agar nutritivo. 2. Incubar los tubos a 35°C durante 24-48 horas. Observar la aparición de colonias y reportar la forma en que se distribuyen a lo largo del tubo. Resultados A. Recopilar la información de la caracterización colonial de cada cepa en los cuadros 4 y 5. ce 0 B. De acuerdo a sus observaciones identifique las especies presentes en la muestra problema. 40 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Cuadro 4 Morfología colonial de cultivos bacterianos Escherichla col i Streptococcus sp MUESTRA PROBLEMA Aislamiento por Estría cruzada Forma: o Color: Tamaño (mm): (0 Borde-. a Superficie: •o Aspecto: Elevación: Luz transmitida: Luz reflejada: Consistencia: MEDKDEMB MEDÍ 0 1 1 0 MEDIO fMÍNIMO Siembra en medios (íj selectivos y diferenciales: Microorganismo 1: Forma: Color: Tamaño (mm): Elevación: Luz transmitida: Luz reflejada: Consistencia: Nota: La descripción colonial puede hacerse considerando los siguientes criterios Forma: circular, irregular, filamentosa o rizoide Borde: entero, lobulado, aserrado Superficie: lisa o rugosa Aspecto de la colonia: húmeda, seca, butirosa Elevación: convexa, plana, hundida Luz transmitida: translúcida, opaca Luz reflejada: brillante, mate Consistencia: dura, blanda, mucoide 41 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Cuadro 5 Descripción morfológica de cultivos puros en tubos de cultivo Tubos inclinados de w y w w Agar Nutritivo Crecimiento: arborescente, filiforme, rizoide, disperso, puntiforme Color: ultivo en tubo de Caldo Nutritivo Crecimiento: superficie como película, como sedi- mento, turbidez en todo el tubo Color: r~ Tubos rectos de Agar Nutritivo Crecimiento: en forma de película superficial, a lo largo de la picadura, solo en el fondo Color: i - DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Cuestionario O 1. ¿Que es el agar y de donde se obtiene? ¿Cuáles son los nutrimentos que proporciona a los microorganismos? | o II 2. ¿Cuál es la composición química de los medios EMB, 110 y MM? ¿Cuáles son los componentes o propiedades responsables de su función como medios selectivos o diferencíales? 3. ¿Porque el agar nutritivo es un medio de uso general para el cultivo de bacterias? Proponga algunas sustan- cias que se le agregarían para hacerlo selectivo para bacterias Gram negativas? 4. ¿Cuál es la información que se obtiene de las siembras de cultivos barterianos en tubos con agar inclinado y en tubos con agar solidificado en forma recta? 5. Bibliografía consultada manual de prácticas del LABORATORIO PE MlCRClBiCiLClGJA GEliERAL _k DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Referencias bibliográficas • Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Prácticas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México. • Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition). Edited by Francés Pouch Downes and Keith Ito, 200. • Practical Handbook of Microbiólogo CRC Press, 1989. William M O'Leary, Cornell Medical College, New York, New York, USA. • Bergey's Manual of Determinative Barteriology. 9th edition, The Williams and Wiikins Co., Baltimore, USA. • Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Associated (APHA), American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. Ed. (1991). DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Métodos de cultivo y descripción morfológica de hongos DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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Objetivos introducción Que el alumno aprenda las técnicas Los hongos son organismos eucarióticos y de mayor tamaño que las bac- de cultivo y manipulación de diferen- terias, se distinguen de otros eucariotes como los animales por ser inmó- tes tipos de hongos. Que el estudian- viles y de las algas y plantas por carecer de pigmentos fotosintéticos. te conozca las principales caracterís- ticas morfológicas (macroscópica y Son de nutrición heterótrofa, es decir dependen de nutrientes orgánicos microscópicas) de los hongos. que son solubilizados por sistemas enzimáticos específicos y son 5 absorbidos a través de su pared celular y membrana plasmática. Estos organismos pueden ser unicelulares (levaduras) o multice- lulares (filamentosos), sin embargo, también existen hongos (0 dimórficos principalmente patógenos que se presentan en las dos £ formas alternativamente, dependiendo de condiciones ambienta- o a les como la temperatura. "O Las levaduras son células de forma esférica u oval, ampliamente distribui- das en la naturaleza; frecuentemente se encuentran formando una cubierta polvosa fina sobre frutos y hojas. Las levaduras se reprodu- cen asexualmente por gemación, un proceso por el cuál brota una protuberancia o yema de la célula madre que posteriormente se separa como célula individual. El cuerpo o estructura vegetativa característica de los hongos filamentosos (mohos) se denomina talo, generalmente constituido de hifas ramificadas que forman el micelio. Las hifas de algunos hongos presentan tabiques transversales o septos, aunque en el caso de los Zygomycetes las hifas no presentan estos septos y se les conoce como hifas cenocíticas. El principal mecanismo de reproducción de los hongos es asexual, por fragmentación de hifas vegetativas o por la producción de abun- dantes esporas en conidióforos y esporangióforos formados en hifas aéreas llamadas hifas reproductivas. Sin embargo, la descripción de las estructuras de reproducción sexual es el principal criterio de clasificación, por el que pueden ser ubicados en tres subdivisiones o phylum: Zygomycota, Ascomycota y Basidiomycota. Se estima que puede haber 1.5 millones de especies de hongos, de las cuáles se han descrito más de 250 000 y de éstas solo se conocen 150 especies patógenas para el hombre y otras tantas para plantas y animales. Es de gran importancia conocerlos, por los beneficios que proporcionan al hombre, ya que como se mencionó la mayoría son saprobios (utilizan materia orgánica muerta), por lo que tienen una gran capacidad de reciclar materiales orgánicos de diferentes tipos, de tal forma que se pueden utilizar como agentes de biodegradación de compuestos recalcitrantes en procesos de biorremediación. 47 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Desde la antigüedad, estos microorganismos se han utilizado en procesos de producción de diferentes alimentos como: vino, cerveza, pan y queso entre otros. También se ha reportado que en la naturaleza hay diversas especies que funcionan como importantes agentes de control biológico de insectos (bioinsecticidas) y que pueden mejorar la nutrición y permanencia de la mayoría de las plantas (micorrizas). Materiales 4 Cajas de Petri con 25 mL de PDA (Anexo 2.6 ) 4 Cajas de Petri con 25 mL de medio Czapek-Dox (Anexo 2.8) 3 Tubos de cultivo inclinados con 7 mL de PDA 2 matraces Erlenmeyer de 250 mL m 1 Probeta de 100 mL 0 1 Vaso de precipitados de 100 mL 1 Mechero Fisher 5 Portaobjetos y cubreobjetos 1 Aguja de disección 1 Asa de siembra Cinta adhesiva transparente Microscopio óptico de campo claro Aceite de inmersión Autoclave Incubadora a 30 °C Azul de lactofenol (Anexo 1.1 ) Procedimiento El profesor proporcionará a los alumnos tubos de cultivo con Aspergillus niger, PenicHHum chrysogenum, Rhizopus oliQosporus, Trlchoderma viridey de la levadura Saccharomycescerevislae. El estudiante inoculará cada una de las cepas en cajas de Petri con dos medios de cultivo: a) Czapek-Dox Agar, a base de sales minerales y sacarosa y b) Papa Dextrosa Agar, que es un medio complejo. Hará la descripción macroscópica de cada especie en los dos medios de cultivo y la observación microscópica la realizará aplicando la técnica de cinta Scotch con azul de lactofenol. Siembra de hongos 1. Para sembrar los hongos filamentosos, se deberá separar una parte de micelio de los tubos de cultivo con aguja de disección, previamente calentada en la flama del mechero y enfriada. 2. Colocar el micelio en el centro de una caja de Petri con PDA y de la misma manera inocular la caja con medio de Czapek-Dox. 3. Las levaduras se inocularán por estría cruzada sobre la superficie de las cajas, en forma similar a la inocula- ción de bacterias. 4. Colocar las cajas envueltas en papel o en bolsa de plástico en forma invertida dentro de una incubadora a 28-30 °C durante 3-5 días. 48 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Descripción macroscópica de levaduras y mohos 1. Hacer la descripción de la forma, tamaño, aspecto, textura y color de las colonias de Saccharomyces cerevisiae. 2. En los cultivos de mohos describir la forma, tamaño y el tipo de colonia, así como las características del micelio (algodonoso, aterciopelado, velloso, aéreo o pegado al medio) el color del micelio, el color de esporas, cambios en el medio de cultivo, etc. Descripción microscópica de levaduras t 1. De las colonias de levaduras preparar un frotis fijado al calor y teñirlo con azul de metileno. i •o 2. Hacer observaciones al microscopio con objetivo de 40X y 100X. Descripción microscópica de mohos en montaje con cinta adhesiva 1. Se corta una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente tomándola únicamente por los extremos. 2. Cerca del mechero se abre la caja y se presiona ligeramente la cinta transparente sobre la periferia de la colonia. 3. Colocar la cinta con la muestra adherida sobre una gota de azul de lactofenol, previamente colocada en el centro de un portaobjetos. La cinta funcionará como cubreobjetos por lo que se deberá aplanar lo mejor posible, evitando la formación de burbujas y sin alterar demasiado las estructuras. 4. Dejar reposar durante 3-5 minutos y hacer las observaciones en el microscopio con los objetivos de 10X y 40X. 5. Localizar en las preparaciones hifas, estructuras especiales como conidióforos, conidias, esporangióforos, esporangios y rizoides. Determine si las hifas presentan septos o no. Resultados A. Reportar sus observaciones en el Cuadro 6. Hacer los dibujos de las observaciones morfológicas de cada uno de los microorganismos y colorearlos. B. Comparar las observaciones realizadas con los esquemas de la Figura 6. C. Investigar en la literatura como se clasifican los hongos estudiados en la práctica. 49 : m a n u a l d e p r á c t i c a s del : -. ,-*: v i . ' > : ; -*Z M ^ ; ; • * * ? ; ; < ; * : y ^ v . ; » , ? --,v.::'-í"<t f * DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
conidias conidias conidióforo 10 ^m 10 im 10 im Aspergillus flavus (O m o porangiosporas Aspergillus niger esporangióforo conidióforos 100 25 Jim conidias O • 10 Rhizopus oligosporus Penicillium roqueforti ® Saccharomyces cerevisiae conidióforos conidias conidióforos conidias OOOOooo 10 ¿un oooooo OOOOOO 10 Trichoderma viride Penicillium chrysogenum Figura 6. Descripción microscópica de estructuras de reproducción asexual de algunas especies de hongos. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Cuadro 6 Descripción morfológica de hongos liliillilltllillliilllliiilliilliii •o Descripción macroscópica o en PDA ;olor y tamaño: Aspecto: i Textura: Descripción microscópica: Aumento total: Micelio con o sin septos Tamaño: Estructuras de reproducción Tamaño: Clasificación (phylum): Descripción macroscópica en medio Czapek-Dox: Color y tamaño: Aspecto: Textura: Descripción microscópica: Aumento total: Micelio con o sin septos Tcmaño: Estructura de reproducción Tamaño: Tipo de esporas Tamaño: 51 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Cuestionario 1. ¿Cuáles son las principales estructuras caraaerísticas de levaduras y mohos? 2. Elaborar un cuadro comparativo de caraaerísticas morfológicas, nutridonales y sensibilidad a antibióticos de hongos y baaerias. Mencione las diferencias que hay entre las esporas de hongos y las endosporas baaerianas. 3. Mencione los criterios de clasificación de hongos filamentosos y levaduras. 4. Describir brevemente tres problemáticas concretas para el hombre causadas por hongos y tres ejemplos de utilización benéfica. 5. Bibliografía consultada Referencias bibliográficas • Hudson B.T. and L Sherwood. 1997. Explorations in Microbiology. Prentice-Hall, New Jersey. USA. • Herrera, T., Ulloa, M. 1990. El Reino de los Hongos. Micología Básica y Aplicada. Fondo de Cultura Económi- ca, UNAM. México. • Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana. México. 52 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
¿fe* Pruebas de diferenciación bioquímica DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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Objetivos introducción Que el alumno realice algunas prue- El metabolismo, es toda la serie de reacciones que ocurren en los bas bioquímicas en medios de cultivo seres vivos. Éstas reacciones incluyen procesos de obtención de ener- con sustratos específicos que permiti- gía como son: la descomposición de moléculas orgánicas en los rán demostrar actividades metabólicas quimiótrofos (catabolismo) o la captación de luz para el caso de los de bacterias y levaduras. Que el estu- fotótrofos, así como de síntesis de material celular a partir de nutrientes diante comprenda la importancia de las escenciales (anabolismo). Todas las reacciones metabólicas, son pruebas bioquímicas para la caracteri- catalizados por enzimas que en su mayoría funcionan dentro de la zación e identificación de estos célula por lo que se conocen como endoenzimas, hay también microorganismos. exoenzimas principalmente hidrolíticas que son liberadas por la célu- la para catalizar reacciones fuera de ésta. t (0 a En el laboratorio, es posible conocer las características metabólicas de los •o microorganismos, inoculándolos en diferentes medios de cultivo, con sustratos que pueden utilizar como fuente de energía, fuente de car- bono y de otros nutrientes escenciales para su crecimiento. La mayoría de microorganismos, utilizan la glucosa como fuente de car- bono y energía. Al entrar a la célula, la glucosa será oxidada en forma incompleta (fermentación) o completa (respiración) depen- diendo de la presencia de oxígeno y de las capacidades enzimáticas de los microorganismos. En la fermentación, los microorganismos obtienen 1-2 ATP/mol de gluco- sa y liberan ácidos orgánicos u otras pequeñas moléculas orgánicas como productos metabólicos; mientras que las bacterias y levadu- ras de catabolismo respiratorio obtienen mayor cantidad (36-38 ATP/ mol de glucosa), CO2 y agua. Algunas especies microbianas pueden ser de tipo respiratorio o fermentativo de acuerdo a las condiciones de oxigenación. Se han propuesto numerosas pruebas bioquímicas en medios de cultivo con indicadores de pH, para detectar la producción de ácido o álca- li; con inhibidores selectivos como bilis, cianuro, colorantes, sulfuros, etc., que facilitan la determinación de diferentes activida- des metabólicas como son: la capacidad para fermentar carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa), catabolizar aminoácidos y urea, la pro- ducción de enzimas específicas de tipo endo o exo como oxidasas, reductasas, amilasas, lipasas, etc. Como se ha observado en las prácticas anteriores, algunas bacterias y levaduras tienen características coloniales y microscópicas muy si- milares, lo que no permite decidir si dos cultivos bacterianos o de levaduras morfológicamente similares pertenecen a una misma especie. Con algunas pruebas bioquímicas es posible su diferen- ciación e incluso su identificación, cuando el número de pruebas es suficientemente amplio. 55 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Materiales 1 Gradilla 1 Parrilla de agitación 1 Probeta de 100 mL. 3 Matraces Erlenmeyer de 250 mL 3 Vasos de precipitados de 250 mL. 1 Mechero 1 Asa de siembra 2 cajas con agar almidón (AA) (Anexo 2.13 ) 2 tubos con campana de Durham y 5 mL de cada uno de fl los siguientes medios: glucosa-rojo de fenol lactosa-rojo 0 de fenol, sacarosa-rojo de fenol y manitol-rojo de fenol (Anexo 2.9 ). 2 tubos con 7 mL de medio SIM (Sulfuro, Indol, Motilidad) (Anexo 2.11) 2 tubos con 7 mL de medio TSI (triple azúcar hierro) solidificados en forma inclinada (Anexo 2.15) 2 tubos con 7 mL medio de citrato de Simmons solidificados en forma inclinada (Anexo 2.10 ) 2 tubos con 7 mL de caldo urea (Anexo 2.11) 2 tubos con 7 mL de leche tornasolada (Anexo 2.14) 2 tubos con 7 mL de agar gelatina solidificados en forma recta (Anexo 2.15 ) 2 tubos con 7 mL de agar nutritivo blando solidificados en forma recta (Anexo 2.17 ). Peróxido de hidrógeno 30 % ácido tricloroacético al 5% (Anexo 1). Procedimiento El profesor proporcionará cultivos puros de Bacillussubtllis, Escherichia col!, Pseudomonas fluorescens, Klebslella sp. y Saccharomyces cerevislae. A cada uno de los equipos, les corresponderá también un cultivo problema. Todos los tubos y cajas deberán etiquetarse e inocularse de acuerdo a las siguientes instrucciones. Técnica de Inoculación en cajas de Petri 1. Dividir en tres secciones por la parte de atrás las cajas con agar-almidón. 2. En una de las cajas inocular por estría simple tres cepas diferentes. 3. En la segunda caja inocular en dos secciones la muestra problema y dejar una sección sin inocular. 4. Incubar las cajas en forma invertida a 35°C durante 24-48 horas. 56 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Técnicas de inoculación en tubos 1. Los tubos de glucosa, lactosa, sacarosa y manitol rojo de fenol, caldo urea y leche tornasolada se inocularán mezclando una asada de cada uno de los microorganismos. 2. Los tubos con agar TSI se inocularán por estría simple en la superficie y por picadura hasta el fondo del tubo (Figura 5). 3. Los tubos con gelatina nutritiva y agar nutritivo blando se inocularán por picadura (con el asa recta) 4. Incubar los tubos a 35°C durante 24-48 horas. Evaluación de actividades metabólicas 1. Determinar la actividad de amiiasas en las cajas de agar almidón por el crecimiento y aparición de zonas claras alrededor de las colonias. Si no es posible observarlas a simple vista, agregar unas gotas de lugol a las cajas y observar la aparición de zonas claras sobre el medio que se coloreará de azul como indicativo de prueba (+). Comparar los resultados con la zona de la caja que se dejó sin inocular. 2. En un portaobjetos hacer una suspensión en una gota de agua de las colonias obtenidas en cajas de agar- almidón y agregar unas gotas de peróxido de hidrógeno al 30%. Observar la formación de burbujas que significan una prueba de catalasa (+). 3. Todas las pruebas en tubo deberán interpretarse en comparación con tubos control, que contienen los mismos medios de cultivo pero sin inocular 4. En los tubos de agar gelatina, observar la licuefacción del medio y agregar unas gotas de solución de TCA (ácido tricloroacético) al 5%, observar la aparición de zonas claras o nubosidad en el medio. 5. En los tubos con medios de glucosa, lactosa, sacarosa y manitol rojo de fenol, hacer observaciones a las 24 y 48 horas de incubación. Determinar si hay crecimiento, cambios en el color del indicador y producción de gas en la campana de Durham Resultados A. Reportar los resultados en el Cuadro 7. de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento (-), crece un poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++). Actividad sobre sustratos (+) o negativa (-) B. Investigar los resultados bibliográficos de cada una de las cepas y compararlos con los obtenidos en la práctica C. Investigar las reacciones enzimáticas y de color realizadas para la evaluación de actividades metabólicas D. De acuerdo a sus observaciones proponga el nombre de la especie que corresponde a su microorganismo problema. 57 manual de prácticas del M MI DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Cuadro 7 Resultados de pruebas de diferenciación bioquímica MEDIO DE CULTIVO Escherichla cotí Saccharomyces CULTIVO PROBLEMA cerevislae Agar Almidón Crecimiento: Color del medio con el ugol: Hidrólisis de almidón: Prueba de catalasa: Aparición de burbujas al agregar peróxido de hidrógeno: Reacción de catalasa: Gelatina Nutritiva: Crecimiento: Licuefacción del medio: Formación de nubosidad al agregar TCA al 5%: Hidrólisis de gelatina: Agar Nutritivo Blando: r Crecimiento: superficial, en la parte media, en el fondo: Crecimiento en la picadura Movilidad: 58 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Caldo rojo de fenol r r r r r r r r r 9 TI | Gluc 1011011 Lac Sac Man Gluc Lac Sac Man Gluc Lac Sac Man a Crecimiento: Color del medio: Ácido: Gas: Leche tornasolada (Litmus Milk) ÁddO: Álcali: Sin cambio: Reducción: Peptonización: Coagulación: Gas: Caldo Urea Crecimiento: Color: Hidrólisis de urea: 59 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Medio TSI € «i í í Crecimiento: m Cambio de color: o Producción de H2s: Producción de gas: Fermentación del azúcar: Medio de citrato de r Simmons Crecimiento: Cambio de color: Utilización de citrato: Cuestionario 1. ¿Cuáles son las rutas bioquímicas de obtención de energía de las bacterias respiradoras aerobias, las de respiración anaerobia, las fermentadoras, y las anaerobias estrictas?.¿Cuál de éstas es más eficiente? ¿Porque? DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
2. Describa brevemente las actividades enzimáticas que se identificaron en cada uno de los medios de cultivo utilizados en la práctica. ¿Cuál es la reacción bioquímica que cataliza cada una? ¿Cuáles son exoenzimas y cuáles son endoenzimas? ! 0) t ti a o> •o 3. ¿Explique por qué los tubos de fermentación de azúcares deben evaluarse a las 24 y 48 horas? ¿Qué resul- tados se observarían en los tubos en el caso de que un microorganismo metabolizara oxidativamente la glucosa? 4. ¿Explique por qué se busca la presencia de precipitados de sulfuros en el fondo del tubo de TSI y no en la superficie? 5. Bibliografía consultada manual de prácticas del LABORATORIO PE f¥li€il€>B¡€IL0CI¡Á GENERAL DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Referencias bibliográficas • McFaddin, J.F., J Mac Faddin. 2000. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 3rd ed., Lippicont, Williams & Wilkins. • Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition) Edited by Francés Pouch Downes and Keith Ito, 2001 • Practical Handbook of Microbiology. William O'Leary. Cornell Medical College, New York, USA. CRC Press, 1989. • Bergey's Manual of Determinative Bacteriólogo 9th edition, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA. • Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Associated (APHA), American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. Ed. (1991). DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Métodos de cuantificación de microorganismos DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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introducción objetivos Existen diferentes métodos para cuantificar el número o peso (biomasa) Que el alumno conozca algunas de de células microbianas en un cultivo; los métodos pueden ser directos e las técnicas de cuantificación direc- indirectos. Entre los directos se pueden mencionar a la determinación de ta e indirecta de microorganismos peso seco y el recuento de células en cámara de Neubauer. más utilizadas. Que compare las ven- tajas y desventajas de cada una en La determinación de peso seco es un método de cuantificación muy utili- función de la información que se ob- zado en cultivos de gran densidad, sobre todo para hongos y leva- tiene, del tiempo invertido y de los duras. Como los cultivos se someten a varios procesos (filtración, recursos necesarios. lavado, secado) se pueden causar pérdidas importantes de biomasa y errores en la cuantificación. a El método de cuenta direaa en cámara tiene la ventaja de ser muy rápido y •o económico, aun que no se pueden distinguir las células viables y no viables. Se puede calcular el número de microorganismos en una mues- tra a partir del volumen de la cámara y de las diluciones de la muestra que sean necesarias. Sin embargo, tiene el inconveniente de que la observación y cuantificación se dificultan en células muy pequeñas (1- 5/¿m) o en poblaciones de baja densidad debido al pequeño volumen de muestra que se utiliza (0.1-0.2 mm3). Entre los método indirectos, uno de los más utilizados es la medición de laturbidez de los cultivos en un espectrofotómetro, que es relativa- mente rápida y que se basa en la capacidad de las células microbianas de dispersar la luz que incide sobre éstas. Como el tamaño de las células en una población es casi constante, el grado de dispersión es proporcional a la concentración de células pre- sentes pero no se puede diferenciar la turbidez dada por células viables o no viables. La forma de cuantificar células viables más utilizada en Microbiología, es la de hacer diluciones y cuenta en placa con medios de cultivo es- pecíficos para la población de interés. Esta técnica se basa en la suposición de que cada bacteria incluida en un medio de agar o en su superficie se multiplicará y producirá una colonia visible, en con- secuencia el número de colonias que se observarán a simple vista será igual al número de bacterias viables o unidades formadoras de colonias (UFO inoculadas en el agar multiplicadas por la dilución. Esta técnica aplicada en muestras complejas, dará una estimación aproxi- mada del número total de microorganismos, dependiendo del me- dio de cultivo utilizado, ya que no hay un medio y condiciones de incubación que favorezcan el crecimiento de todos los microorganismos. También pueden presentarse problemas relacio- nados con falta de homogeneidad de las diluciones y en la inocula- ción de las muestras, por lo que se pueden obtener bajos valores si es que las células no se separan bien y valores elevados si la toma de las muestras se hacen del fondo del tubo donde se han concen- trado por gravedad los microorganismos. 65 m a n u a l d e p r á c t i c a s del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Materiales 6 cajas de Petri con agar nutritivo (Anexo 2.2 ) 10 Pipetas de 1-2 ml_ estériles 10 Tubos con 9 mL de ssi (solución salina isotónica= 0.89% NaCI) 1 matraz Erlenmeyer de 125 mL con 99 mL de ssi Vasos de precipitados 1 Parrilla de agitación 1 espectrofotómetro w 1 cámara de Neubauer g I pipeta Pasteur Fenol al 2% (Anexo 1.9) 1 Varilla de vidrio doblada en L 1 Microscopio compuesto Safranina (Anexo 1.8) Procedimiento El profesor proporcionará un cultivo de Saccharomyces cerevisiae y Escherichla colL El alumno medirá la turbidez de los cultivos en un espectrofotómetro (Spectronic 20); cuantificarán el número de células totales, por cuenta direaa en cámara de Neubauer y determinará el número de unidades formadoras de colonias (UFO por dilución y siembra en placa. Técnica turbidimétrica 1. Encender el aparato y dejar que el instrumento se caliente por 15 minutos. 2. Ajustar el aparato a la longitud de onda (520 nm) 3. Calibrar el instrumento a 0% de transmitancia con el botón izquierdo. Para leer en la escala, observar la aguja a nivel de los ojos y tomar el dato donde la aguja coincida sobre su reflejo en el espejo. 4. Colocar una celda con medio de cultivo estéril como testigo (sin inocular) y calibrar el instrumento a 100% de transmitancia. 5. Para medir la turbidez de una muestra, vaciarla en otra celda, limpiar perfectamente con papel suave y medir el valor de %T. 6. Calcule la absorbancia de la fórmula A= -log (%T/100) 7. En caso de disponer de un aparato digital ajustar la mediciones a absorbancia (D.O.). 66 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Técnica de cuenta directa en cámara de Neubauer 1. Se coloca 1 mL de la muestra en un tubo de ensaye. Cuando se trata de cuantificar muestras muy concentra- das (D.O > 1.5) será necesario preparar diluciones de la misma con solución salina isotónica. Agregar 0.5 mL de solución de fenol al 2% y dos gotas de safranina. Mezclar y dejar en reposo durante 5-10 minutos. o 2. Lavar cuidadosamente la cámara de Neubauer sin frotar la zona brillante del centro y el portaobjetos. Secar con papel suave. Colocar el portaobjetos sobre la zona central limitada por dos excavaciones laterales, donde se aprecian una zona cuadriculada a simple vista. I 3. Homogeneizar perfectamente la muestra en un vórtex, tomar inmediatamente una muestra con una pipeta 8. Pasteur de punta fina y depositar una gota entre la cámara y el cubreobjetos por el borde de la cámara. Dejar 4) que la muestra se distribuya por capilaridad, evitando el exceso que dificultará la evaluación precisa de la población microbiana. 4. Dejar reposar durante 5 minutos, colocar la cámara en la platina del microscopio y localizar con el objetivo seco débil (10X) la zona cuadriculada que se muestra en la Figura 7. 5. Localizar el cuadro central grande (C1) que miden 1.0 mm por lado, que se encuentra dividido en 5X5 cuadros pequeños (C2) limitados por triple línea que miden 0.2mm por lado. Estos cuadros pequeños a su vez se encuentran divididos en 16 cuadros mas pequeños (C3) de 0.05 mm de lado. 6. Hacer la cuantificación de células con el objetivo seco fuerte (40X), contando el número de células que se localicen en el cuadro C1, los cuadros de menor tamaño C2 sirven de guía para el cómputo. Se empieza a contar desde la parte superior de los cuadros C2 y se continúa hasta la base. Si las células tocan los límites de los cuadros C2; deberán contarse solamente aquellas que toquen la parte superior y el lado derecho del cuadro. Si las células tocan la parte inferior o el lado derecho no se cuentan. Este método reduce las posibilidades de contar la misma célula dos veces. 7. Cuente hasta cerca de 200 a 250 células antes de determinar el número de células por mL En el proceso de contar se pueden presentar tres situaciones diferentes que a continuación se explican: a. Si hay de 200 a 250 células por cuadro grande (C1), multiplicar directamente X 104 para reportar el número de células por mL. b- Con menos de 200 células por cuadro grande (C1), será necesario contar algunos de los cuadros de las esquinas (miden 1x1 mm de lado y divididos en 4X4). De esta manera se cuantificarán más de 200 células. Después dividir el número total de células entre el número de cuadros empleados y sacar el valor promedio por cuadro grande. Después multiplicar este valor por X 104 para reportar el número de células por mL. c. En el caso de que se observen más de 200 células por cuadro grande (C1), se deberán contar las células de los cuadros de menor tamaño (C2) hasta contar cerca de 200 células. Dividir este valor entre el número de cuadros usados para la cuenta para sacar el valor promedio por cuadro C2. Multiplicar este valor promedio por 25 para obtener el número de células aproximado en un cuadro grande (C1) y después multiplicar X104 para reportar el número de células por mL. 67 manual d eprácticas del ' ' - -.*;.:* " < < rr ><-. Í ' ^ ' V . '«/«;«: *C --'. - '*:. -•'•«' :' **< . DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
8. El factor de 104 por el cuál se debe multiplicar el número de células por cuadro grande (C1) es porque este cuadrado contiene un volumen de 0.1 mm 3 (mide 1mm por lado y la cámara tiene una profundidad de 0.1 mm). # células/cuadro C1 (25cuadros C2) = # células/ 0.1 mm 3 X 104 = # células/mL 9. En el caso de que el # de células sea muy grande, la suspensión deberá diluirse y se hará la corrección como sigue: # células/mL en la muestra diluida X (factor de dilución) = # células/ mL en la suspensión original. (O CQ 1 mm ü — 1 mm 1 m m 1 mnri 0.2 mrri ::::::::i:E2 Cuadro 2 (40X) Cuadro 1 (10X) Figura 7. Cuenta en cámara de Neubauer Técnica de dilución y siembra en placa 1. Hacer diluciones decimales del cultivo de 105 hasta 10"9 en condiciones estériles (Figura 8). Se colocarán en cajas de Petri con agar nutritivo por duplicado 0.1 mL de las últimas tres diluciones. 2. Distribuir cuidadosamente el inoculo en toda la caja con ayuda de una varilla de vidrio doblada en "L" previamente esterilizada a la flama del mechero y enfriada. 3. Dejar absorber el líquido durante 10 minutos 4. Incubar las cajas en forma invertida a 35°C durante 24-48 horas para bacterias y levaduras y de 5-7 días para hongos filamentosos. 5. Hacer la cuenta de las colonias de las placas, seleccionando la dilución donde el número de colonias sea entre 30 y 300. 68 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
6. Si la inoculación fue por duplicado o triplicado, se calcula el número promedio de colonias por dilución y este número se multiplicará por el inverso de la dilución XI0 (por ajuste de volumen inoculado) para obte- ner la número total de unidades formadoras de colonias (UFC)/mL en la muestra original. 1 mL 1 mL 0) 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL £ (6 a •o Cultivo bacteriano 10-3 io- 4 io- 5 io- 6 io- 7 O.lmL XO.lmL Figura 8. Técnica de dilución y cuenta en placa Resultados A. Reportar los resultados de cuantificación de los cultivos, aplicando las técnicas descritas. Indicar los cálcu- los hechos para cada metodología. B. Recopilar sus resultados en el Cuadro 8 incluyendo los de los otros equipos, indicando la muestra analizada por cada equipo. Discutir en cada caso cuáles fueron las ventajas y desventajas de las metodologías de cuantificación. 69 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Cuadro 8 Cuantificación de microorganismos por técnicas directas e indirectas MICROORGANISMO Turbidez (D.O.) Cuenta en cámara de Neubauer Cuenta viable en placa (# células totales/mL) (# UFC/mL) Escherichia colí (0 a o Saccharomyces cerevisiae Cuestionario 1. Compare el método de dilución en placa con el método de cuenta direaa en cámara de Neubauer para la cuantificación de microorganismos. ¿En que casos conviene usar cada uno? 2. Explique cuáles son las ventajas y desventajas del método turbidimétrico de cuantificación de células. 70 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
3. Mencione dos aplicaciones concretas en las que se utilicen cada una de las técnicas de cuantificación realizadas. 1 (0 £ ti a •o 4. Algunos autores sugieren la medición de actividad biológica y la determinación de constituyentes celulares para la cuantificación de poblaciones microbianas. Comente sus ventajas y desventajas. 5. Bibliografía consultada 71 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Referencias bibliográficas Wistreich, G.A. and M.D. Lechtman. 1983. Prácticas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México. • Johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings Publishing Company, Inc. USA. • Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. 1998. Brock Biología de los Microorganismos. Octava Edición. Prentice Hall. España. cú ü • Prescott L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana. México. 72 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
I " O» ai* Efeao del pH y la temperatura en el crecimiento microbiano DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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Objetivos introducción Que el estudiante conozca el efecto Los microorganismos están continuamente afectados por su ambiente, ya del pH y la temperatura como paráme- que éste ejerce una influencia profunda en su desarrollo al igual que tros de control del crecimiento micro- sobre las demás formas de vida. Los factores del medio se pueden clasi- biano. Que el alumno comprenda la ficar en tres grupos: importancia de estos factores físico- químicos en la selección de pobla- a).- Físicos.- temperatura, presiones externas, humedad. ciones microbianas en los diferentes 0) ambientes en que se encuentran y b).- Químicos.- pH, disponibilidad de nutrimentos, presencia de produc- (6 los mecanismos de adaptación a ni- tos tóxicos. t vel celular y metabólicos que han ti a desarrollado. c).- Biológicos.- las interacciones microbianas entre las especies 0) "O coexistentes. Algunos microorganismos están especialmente adaptados a los habitat extremos, donde otros no pueden sobrevivir y que incluso tienen propiedades fisiológicas que restringen su crecimiento a tales si- tios. En otros habitat menos rigurosos, las fuentes de nutrimentos y las interacciones entre poblaciones adquieren mayor importancia en la selección de las poblaciones que se encontrarán. Los factores ambientales que se controlan en condiciones de laboratorio con mayor frecuencia, además de los nutrimentales son los fisicoquímicos como: la temperatura y pH. Todos los organismos tienen una temperatura óptima de crecimiento que los caracteriza; en la cual muestran las tasas más elevadas de creci- miento. También hay límites de temperatura, la temperatura míni- ma en las que son metabólicamente inactivos y una temperatura arriba de la cuál el crecimiento ya no es posible llamada tempera- tura máxima. De acuerdo a su temperatura óptima de crecimiento, los microorganismos se dividen en psicrófilos (<0°C-20°C), mesófilos (20-40°C), termófilos (40-80°C) e hipertermófilos (80-110°C). La mayoría de hiper- termófilos son arqueas como Methanococcus ¡Qneus. Las diferen- cias entre la temperatura óptima de crecimiento y los intervalos de temperatura entre los cuales es posible el crecimiento de bacterias y arqueas determinan la separación espacial en la naturaleza de estos dominios de microorganismos. La concentración de iones hidrógeno del medio afecta directamente a los microorganismos y enzimas, e influye también en la disocia- ción y solubilidad de moléculas que requieren. Sin embargo, algu- nos microorganismos se han adaptado a diferentes condiciones de acidez o alcalinidad, como Sulfolobusy Thiobacillus que crecen a pH tan ácido como 1 - 2 oxidando minerales de sulfuro para produ- cir ácido sulfúrico y son llamado acidófilos. 75 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Otros microorganismos se desarrollan en los habitat naturalmente alcalinos como lagos salados y desiertos don- de los valores de pH 10 son comunes, estos alcalófilos incluyen especies de Rhizoblum, Bacillusy algunas bacterias entéricas y cianobacterias. En general los hongos son más tolerantes a la acidez que las bacterias. Cada microorganismo tiene un rango de temperatura y pH en el cual pueden crecer, de tal manera que al modificarse estos factores se pueden alterar la velocidad de crecimiento y causar la muerte de lo mismos, por lo que se pueden utilizar como factores de control del crecimiento microbiano. Materiales 2 Cajas d e Petri con m e d i o d e Papa Dextrosa Agar (Anexo 2.6) ajustado a p H 7.0 fió 2 Cajas d e Petri con m e d i o d e Papa Dextrosa Agar ajusta- 0 do a pH 5.0 2 Cajas de Petri con medio de Papa Dextrosa Agar ajusta- do a pH 9.0 22 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación (Bioxon) ajus- tado a pH 7.0 sin amortiguar (Anexo 2.19) 4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación ajustado a pH 5.0 sin amortiguar 4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación ajustado a pH 9.0 sin amortiguador 4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación ajustado a pH 7.0 con amortiguador (Anexos 1.1, 2.19) 4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación ajustado a pH 5.0 con amortiguador 4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación ajustado a pH 9.0 con amortiguador 1 Asa de inoculación 3 pipetas de 1.0 mL. estériles 1 mechero Fisher Espectrofotómetro Microscopio estereoscópico Soluciones amortiguadoras de pH 4, 7 y 10 Procedimiento El profesor proporcionará cultivos líquidos de: Escheñchia coli, Pseudomonas fluorescensy Lactobacii/ussp., una suspensión de esporas de Aspergillus nigery Penicillium roqueforti. Cada uno de los tubos y cajas deberán etiquetarse con el nombre del microorganismo que se inoculará. Efecto de la Temperatura 1. En tres cajas de Petri con PDA divididas en dos secciones, inocular 0.1 mL. de la suspensión de esporas de hongos en cada sección. 2. Incubar una caja de Petri a 15°C, otra a 30°C y la última a 45°C en forma invertida durante 72 horas y hacer las observaciones macroscópicas. 76 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
3. Incubar nuevamente las cajas y realizar observaciones en microscopio estereoscópico después de una semana. 4. En seis tubos de caldo microinoculación ajustado a pH 7.0, inocular dos con cada una de las cepas bacterianas. 5. Incubar dos tubos en estufa a 15°C, otros dos a 30°C y los dos últimos a 45°C durante 24-48 horas. Medir la D.O. Efecto del pH 1. Preparar tres series de cuatro tubos de caldo de microinoculación ajustados a 3 diferentes valores de pH (5.0, 7.0 y 9.0) con solución de HC11.0 M o NaOH 1.0 M. i 2. Preparar otra serie de cuatro tubos ajustados a los mismos valores de pH del punto anterior pero utilizando a soluciones amortiguadoras tal como se indica en la Tabla del Anexo 1.10. •o 3. Inocular 0.1 ml_. de cada una de las cepas bacterianas en la serie de seis tubos de caldo microinoculación ajustados a diferentes pH con amortiguador y sin amortiguador, dejando uno sin inocular como testigo. 4. Incubar los tubos a 35 °C durante 24-48 horas y medir la D.O. 5. Inocular tres cajas de Petri con medio PDA ajustado a tres pH diferentes con cada una de las cepas de hongos. 6. Incubar las cajas de Petri a 30 °C durante 72-96 horas y hacer observaciones macroscópicas. 7. Después de una semana observar las cajas en microscopio estereoscópico. Resultados A. Reportar los resultados en los cuadros 8, 9 y 10 de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento (-), crece un poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++). B. Comparar sus resultados con los reportados en la bibliografía de cada una de las cepas. 77 m a n u a l d e p r á c t i c a s d e l . v> - v<; -: 1 ; ^ > 1 ^ ' ! ' ' S ^ ' n u ' , : ^ ; : < ? ' •'::;.^':,''iv>. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Cuadro 9 Efecto de la temperatura de cultivo en el crecimiento microbiano TEMPERATURA PAPA DEXTROSA AGAR 15°C 30°C 45°C Aspergí I Ius níger Morfología de la colonia a las 72 horas Morfología microscópica a la semana a o Penidllium roquefortí Morfología de la colonia a las 72 horas Morfología microscópica a la semana CALDO . MICROINOCULACIÓN Escherlchla col i Crecimiento a las 24-48 horas Absorbancia (D.O.) Pseudomonas fluorescens Crecimiento a las 24-48 horas Absorbancia (D.O.) A Lactobadllus sp. r Crecimiento a las 24-48 horas Absorbancia (D.O.) 78 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Cuadro 10 Efecto del pH de cultivo en el crecimiento microbiano PAPA DEXTROSA AGAR lili ¡1 11 Aspergí/fus n/ger Morfología de la colonia a las 72 horas I Morfología microscópica a la semana Iff Penidlllum roquefortl Morfología de la colonia a las 72 horas Morfología microscópica a la semana Con amortiguador Sin amortiguador CAtDO . PH5.0 PH7.0 PH9.0 PH5.0 PH7.0 PH9.0 MICROINOCULACIÓN Escherichia col! Crecimiento a las 24-48 horas Absorbanda(D.O.; Pseudomonas r r fíuorescens Crecimiento a las 24-48 horas Absorbancia(D.O.) Lactobadllus sp. i Crecimiento a las 24-48 horas Absorbanda(D.O.) 79 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Cuestionario 1. ¿Cuáles son las temperaturas cardinales y como se clasifican los microorganismos de acuerdo a su tempera- tura óptima de crecimiento? (0 ffl 2. ¿Como influyó el pH en el crecimiento de hongos y baaerias? ¿Que diferencias se observaron en los medios de cultivo amortiguados y sin amortiguar? 3. Explique brevemente cuáles son los mecanismos celulares que los microorganismos termófilos extremos y psicrófilos han desarrollado para adaptarse a condiciones extremas de temperatura y pH. 4. Explique cuál es la relación que existe entre condiciones óptimas de crecimiento en el laboratorio y las condiciones del habitat de origen de las poblaciones microbianas. 5. Bibliografía consultada Referencias bibliográficas •Harrigan, W.F. Laboratory Methods in Food Microbiology. 1998. Academic Press. 3a. Edition. • Jay, J.M.1994. Microbiología Moderna de los Alimentos. Tercera Edición. Editorial Acribia, Zaragoza, España. • Holt, J. C , N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative Bacteriólogo 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA. 80 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Efecto de la actividad de agua en el crecimiento microbiano DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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Objetivos introducción Que el estudiante conozca las res- El agua líquida es esencial para todos los procesos bioquímicos. Para los puestas de crecimiento de diferen- microorganismos, un factor crítico es la disponibilidad de agua líquida tes cultivos microbianos, frente al más que la cantidad total de agua presente en el ambiente. El total de estrés osmótico causado por la adi- agua realmente disponible para uso microbiano se expresa como la acti- ción de azúcares, la adición de NaCI vidad de agua (aw). y la desecación. Que el alumno com- prenda el efecto de estos factores Los efectos de las altas concentraciones de solutos sobre los microorga- sobre la actividad de agua y los me- nismos pueden deberse a los solutos mismos o a los efectos del canismos de adaptación que han de- soluto sobre la aw. Cada vez que se disuelven sustancias en el agua sarrollado los microorganismos. pura se disminuye la cantidad de agua disponible o agua libre. La actividad de agua en términos termodinámicos proporciona una medida de agua libre y es definida por la ecuación a- Po nt +n2 Donde P- la presión de vapor de la solución y Po es la presión de vapor del agua pura, n1 y n2 son el número de moles de soluto y solvente respectivamente. Así, si la concentración de soluto aumenta la aw disminuye, para agua pura la aw es igual a 1.0. La mayoría de microorganismos solo toleran pequeños disminuciones en la aw y al igual que con otros factores ambientales, hay notables excepciones de microorganismos que toleran o incluso requieren actividades de agua reducidas como: las bacterias halofílicas, hon- gos xerofíticos y las levaduras osmófilas. Las bacterias halófilas que viven en ambientes salinos son las que mejor toleran la disminu- ción de la aw independientemente del soluto utilizado para reducir- la, mientras que en las otras la tolerancia varía en función del soluto que se utiliza para disminuirla. Estas propiedades de disminución de la aw en soluciones es la base de algunos sistemas de conservación de alimentos, por ejemplo: el salado del pescado o en la adición de elevadas concentraciones de azúcares en mermeladas. manual de prácticas del tjmcmKtomo PE f¥t¡Clt€IB¡0L€lGÍA SEüEff AL . DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Materiales 1 asa de inoculación 1 Espectrofotómetro 3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 10% de sacarosa (p/v) 3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 30% sacarosa 3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 60% de sacarosa 3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 1 % NaCI (p/v) 3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 5 % NaCI 3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 10 % de NaCI 6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 10% sacarosa 6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 30% sacarosa S 6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 60% de sacarosa 6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 1 % NaCI 6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 5 % NaCI 6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 10 % NaCI 36 tubos de ensayo vacíos y estériles 5 pipetas de 1mL estériles Procedimiento El profesor proporcionará cultivos líquidos de bacterias: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseuc/omonas sp. y hongos: Saccharomyces rouxii, Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum. En series de tres cajas de Petri y 6 tubos de cada medio se inocularán por equipo tres de los microorganismos. Efecto de la presión osmótica y actividad de agua (aw) en hongos y bacterias 1. Inocular en el centro de las cajas de Petri, con una gota de cada una de las cepas de hongos. 2. Inocular con 0.1 mL de cultivo de dos de las cepas de bacterias en dos tubos de ensaye con 7mL de cada uno de los medios. 3. Incubar las cajas en forma invertida a 30°C y los tubos de caldo a 35°C durante 48 horas y hacer las observa- ciones. Incubar nuevamente y a la semana realizar observaciones de la morfología de los cultivos en cajas y en tubos medir la turbidez de los cultivos en caldo nutritivo a las 24-48 horas. Efecto de la desecación 1. En series de seis tubos de ensayo vacíos y estériles, con una pipeta estéril, colocar una gota de una suspen- sión de cada uno de los siguientes cultivos bacterianos: Bacillus subtilis, Escherichia co/iy en un tercer tubo una gota de una suspensión de esporas de Aspergillus niger 2. Cerrar los tubos y dejarlos a la temperatura ambiente durante una semana 3. En dos tubos de cada cultivo agregar 3 mL de caldo nutritivo estéril. 84 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
4. Incubar los tubos a 35 °C durante 24-48 horas. 5. Observar si hay crecimiento o no. 6. Repetir la instrucciones de los puntos 3-5, después de dos y tres semanas en los tubos restantes. Resultados A. Reportar los resultados en los Cuadros 11-13. de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento (-), crece un poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++). B. Medir la absorbancia de los tubos de cultivo en un espectrofotómetro. a o C. Investigar los resultados bibliográficos de cada una de las cepas y compararlos con los obtenidos en la •o práctica Cuadro 11 Efecto de la presión osmótica y aaividad de agua en el crecimiento de baaerias 0.990) = 0.970) 0.940) Sacarosa NaC11% Sacarosa Nací 5% Sacarosa NaCI 10% CEPA 10% 30% 60% Staphylococcus sp. A A r A Crecimiento a las 24 horas Densidad óptica: Escherichia coli r A Crecimiento a las 24 horas Densidad óptica: Baclllus subtílis A r Crecimiento a las 24 horas Densidad óptica: 85 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Cuadro 12 Efecto de la presión osmótica y actividad de agua en el crecimientos de hongos (aw = 0.990) ( ^ = 0.970) ( ^ = 0.940) Sacarosa Nací 1 % Sacarosa Nací 5% Sacarosa CEPA NaC110% 10% 30% 60% Sacharomyces rouxll Morfología de la colonia m o a las 72 horas: Morfología de la colonia después de una semana: AspergíIIus nlger Morfología de la colonia a las 72 horas: Morfología de la colonia después de una semana: Penlcllllum chrysogenum Morfología de la colonia a las 72 horas: Morfología de la colonia después de una semana: 86 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Cuadro 13 Efeao de la desecación en la recuperación de cepas microbianas de bacterias y hongos SEMANA 1 .1 > * * ! / • • • : i.;. 1 Escheríchla col! r /-> <J KJ 0) I Crecimiento: superficial, I depósito: Absorbanda (D.O.): Badilus subtilis r r r /^ <J J Crecimiento: superficial, depósito: Absorbanda (D.O.): AspergíIIus nlger r r r r r <J U Crecimiento: superficial depósito: Absorbanda (D.O.): Cuestionarlo 1. Definir brevemente los términos: osmófilo, halófilo, xerófito. manual de prácticas del LABOItJITOlIlCI OE ¡VfiCHOBiOLd&iA DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
2. ¿Cuáles son las hipótesis que tratan de explicar la osmofilia y la halofilia de poblaciones microbianas? 3. Explique ¿cuál es la importancia de controlar la artividad de agua en procesos de conservación de alimen- tos? ¿Que es la plasmoptisis? ¿Que es la plasmólisis? 0) o 4. ¿Que relación hay entre la aw y la humedad relativa ? 5. ¿Como se explica la mayor tolerancia de los hongos a valores de aw reducidos que en bacterias? 6. Bibliografía consultada Referencias bibliográficas • Johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings Publishing Company, Inc. USA. • Wistreich, G.A. and M.D. Lechtman. 1983. Prácticas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México. • Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. 1998. Brock Biología de los Microorganismos. Octava Edición. Prentice Hall. España. • Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana. México. 88 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
1O O O ^ Curva de crecimiento bacteriano DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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ú Objetivos introducción Que el estudiante conozca las fases El crecimiento y la viabilidad de los microorganismos está determinada de una curva de crecimiento en un por factores nutricionales y ambientales, y en condiciones de laboratorio cultivo en lote de Escherichla colL óptimas, es posible predecir una curva de crecimiento característica de Que el alumno aprenda a calcular cada especie microbiana. parámetros cinéticos (/*, td) caracte- •o rísticos de las especies bacterianas. Cuando una bacteria es inoculada a un medio de cultivo líquido fresco, experimentará un periodo de adaptación al medio y condiciones de cultivo y posteriormente se dividirá en forma exponencial, dan- do lugar a una curva de tipo sigmoidal que se acostumbra dividir ti en 4 partes: t es a o •o 3 o u B Oí 3 tiempo A) fase de retardo, de adaptación o fase lag, B) fase de crecimiento exponencial o fase log, C) fase estacionaria y D) fase de declina- ción o muerte. La forma de cada porción de la curva y el tiempo de duración de cada fase dependerá de: la especie de microorganis- mo, la preparación del inoculo, la composición química del medio de cultivo y las condiciones ambientales de incubación. Durante la fase de adaptación no hay división celular, la célula está sinte- tizando nuevos componentes, durante la fase exponencial los microorganismos que se dividen por fisión binaria lo hacen a inter- valos regulares, finalmente el crecimiento de la población dismi- nuye y la curva se vuelve horizontal debido al agotamiento de nutrimentos o la acumulación de productos residuales tóxicos has- ta que la población disminuye. En general las bacterias crecen con mayor rapidez que los microorganismos eucarióticos y los eucarióticos pequeños se desa- rrolla más rápidamente que los grandes. El metabolismo energético también influye sobre la velocidad de creci- miento, debido a la ganancia energética que se obtiene de cada vía 91 manual de prácticas del I O£ DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
catabólica de obtención de energía. Así, los microorganismos fermentadores crecerán mas lentamente que los respiradores. Materiales 1 Matraz Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio líquido (Anexo 2.18) 2 Matraces Erlenmeyer de 125 mL con 99 mL de solución salina isotónica estéril 6 Pipetas de 10 mL estériles 16 Pipetas de 1 mL estériles 1 Potenciómetro 1 Mechero Fisher 1 Espectrofotómetro y celdas 1 Gradilla 16 Tubos con 9 mi de solución salina isotónica estéril 1 Varilla doblada en "L" 12 Cajas de Petri con Agar Nutritivo (Anexo 2.2) Procedimiento El profesor inoculará Escherichia co/fen un matraz Erlenmeyer con medio líquido complejo 12 horas antes de iniciar la práctica, que se utilizará como inoculo para los cultivos en matraces Erlenmeyer con diferente concen- tración de glucosa. Los estudiantes cuantificarán el crecimiento periódicamente durante 6 horas de incubación. Se aplicarán los méto- dos turbidimétrico y el de diluciones y siembra en placa (práctica* 7) para cuantificar el crecimiento bacteriano. Inoculación e incubación del cultivo 1. Inocular en condiciones estériles un matraz Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio de cultivo complejo con 10 mL de un cultivo de Escherichia coli 2. Homogeneizar cuidadosamente agitando el matraz e inmediatamente tomar una muestra de 5 mL con una pipeta estéril y vaciarla en una celda del espectrofotómetro. Esta muestra corresponderá al tiempo cero (t=0). De la misma manera se tomarán muestras a las 0.5, 1, 2, 3 y 4 horas. Para el tiempo de 6 horas de incubación se tomarán 6 mL 3. Colocar el cultivo en incubadora con agitación (150 rpm) a 35°C Tratamiento de las muestras 1. Determinar la turbidez de las muestras en un espectrofotómetro a 560 nm. Leer el valor de la densidad óptica (Figura 9). 92 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
2. En la muestra de 6 horas además de evaluar la turbidez, se deberá poner 1 mL del cultivo en un matraz Erlenmeyer con 99 mL de solución salina isotónica (ssi) estéril. Del matraz con la muestra diluida, hacer una serie de diluciones en tubos con 9 mL de ssi estéril, hasta 108. Cuidando de homogeneizar las muestras cada vez que se haga una nueva dilución. 3. Enseguida inocular 0.1 mL de las últimas tres diluciones en dos cajas de Petri con agar nutritivo y distribuir la muestra con una varilla de vidrio doblada en "L". 4. Dejar que se absorba el líquido en las cajas y posteriormente incubarlas en forma invertida durante 24-48 horas. 5. Cuantificar el número de UFC/mL de Escherichia colL t (0 a o •o 10 mL 055 (5) (6) Figura 9. Tratamiento de muestras para medición del crecimiento microbiano y elaboración de una curva de crecimiento. 93 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Resultados A. Se registran los resultados de cuantificación del crecimiento de Escherichla co/ien el Cuadro 14. B. El alumno reportará también en forma gráfica la relación entre dos variables, la variable independiente siempre será el tiempo que se colocará en el eje X, para cada concentración de glucosa a. Una gráfica de D.O. contra el tiempo b. En la gráfica a) identificar las fases de crecimiento y duración c. Determinar la tasa de crecimiento promedio (k) de la fórmula k=( log N- log No)/ log 2 (t), donde No=# de UFC al tiempo "0" y N = # de UFC al final del experimento ü d. Calcular la tasa de crecimiento especifica ( JU ) de la fórmula fi = In2 (k) con este valor determinar el tiempo de generación de Escherichia co/í con la relación td= In2/fi Cuadro 14 Resultados de mediciones del crecimiento de Escherichia coll en un cultivo por lote con diferentes concentraciones de glucosa Tiempo de muestreo (h) Turbidez (D.O.) UFC/mL 0 0.5 1 2 3 4 6 94 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Cuestionario 1. ¿Cómo se define el crecimiento en Microbiología y cuáles son los eventos a nivel celular que ocurren en cada una de las etapas de crecimiento? ! a 2. ¿Qué condiciones ambientales y nutrimentales causarán una disminución o eliminación de la fase lag en la curva de crecimiento. ¿Que condiciones la incrementaría? 3. ¿Cómo se define el tiempo de duplicación? ¿Cómo se relaciona con la tasa de crecimiento específica 4. Bibliografía consultada 95 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
Referencias bibliográficas • Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. 1998. Brock Biología de los Microorganismos. Octava Edición. Prentice Hall. España. • Larpent-Gourgaud, M., J.P. Larpent, B. Boissonnet. (1988). Travaux pratiques et diriges de Microbiologie. Société Marocaine des Editeurs Réunis. Rabat, Maroc. • Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana. México. a o 96 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
o o DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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Brooks, G.F., ButelJ.S., Morse, S.A. 1999. Microbiología médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Editorial el Manual Moderno. 16a. Edición. | Harrigan, W.F. Laboratory Methods in Food Microbiology. 1998. Academic Press. 3a. Edition. £ Jay, J.M.1994. Microbiología Moderna de los Alimentos. Tercera Edición. Editorial Acribia, Zaragoza, ti España. a •o Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. 1998. Brock Biología de los Microorganismos. Octava Edición. Prentice Hall. España. Larpent-Gourgaud, M., J.P. Larpent., B. Boissonnet. (1988). Travaux pratiques et diriges de Microbiologie. Société Marocaine des Editeurs Réunis. Rabat, Maroc. Manual de Medios de Cultivo. Bioxon. Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana. México. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods 2001 (4th Edition) Edited by Francés Pouch Downes and Keith Ito. American Public Health Assosiation. Practical Handbook of Microbiology. 1989 William M O'Leary (Ed), Cornell Medical College, New York, New York, USA. CRC Press. Holt, J. G., N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Associated (APHA), American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. Ed. (1991). 99 manual de prácticas del / ^ K / f - u v ^ Y ;-: i-;-;:". ' " ;",:' '* DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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'J$fF*F 0 0 Preparación de soluciones y colorantes DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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1. Azul de lactofenol 4. Verde de malaquita Disolver 5.0 g del colorante verde de malaquita Disolver cuidadosamente 10 g de fenol (cristales) en 100 mL de agua destilada. en 20 ml_ de agua destilada, agregar 20 g de áci- do láctico y 40 g de glicerol. Posteriormente di- 5. Solución de lugol solver 0.05 g de azul de metilo. En un matraz aforado de 50 mL, disolver 0.333 de yoduro de potasio en 20 mL de agua destilada y 2. Azul de metileno alcalino enseguida agregar lentamente 0.166 g de yodo, mezclar completamente y aforar con agua desti- Disolver 0.3 g de azul de metileno en 30 mL de lada. alcohol etílico al 95% y mezclarlo con 100 mL de solución de hidróxido de potasio al 0.01% 6. Solución decolorante alcohol-acetona Colocar en una probeta de 50 mL, 30 mL de alco- 3. Cristal violeta hol etílico y 20 mL de acetona, mezclar perfecta- Este colorante se prepara en dos partes, mente. a. Solución a: en un vaso de precipitados de 50 7. Alcohol al 70% mL colocar 10 mL de alcohol etílico y disolver 1 g de cristal violeta. Solución b: en otro vaso 8. Safranina se disuelven 0.4 g de oxalato de amonio en En un matraz aforado de 50 mL colocar 5 mL de 40 mL de agua destilada. alcohol etilico y disolver 0.125 g de safranina. Afo- rar con agua destilada b. Mezclar cuidadosamente las soluciones a) y b) 9. Solución de Fenol al 2% En un matraz aforado de 100 mL colocar 2.0 g de c. Guardar la mezcla en un frasco ámbar en fenol cristales y disolver con un poco de agua poco obscuridad durante 24 hrs. Filtrar en papel a poco, después aforar con agua destilada. Whatman No. 1 antes de utilizarlo. 10. Soluciones amortiguadoras para controlar el pH de medios de cultivo PH K2HPO4 Ácido Cítrico Ácido Bórico NaOH Caldo Nutritivo 0.2 M (mL) 0.1 M (mL) 0.2 M (mL) 0.2 M (mL) (mL) 2.8 0.3 1.7 - 8.0 3.6 0.6 1.4 - - 8.0 4.4 0.9 1.1 - - 8.0 5.2 1.1 0.9 - - 8.0 6.0 1.3 0.7 - - 8.0 6.8 1.5 0.5 - - 8.0 7.6 1.9 0.1 - - 8.0 8.4 - - 1.7 0.3 8.0 9.2 - - 1.3 0.7 8.0 10 - - 1.0 1.0 8.0 103 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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1. Caldo nutritivo (CN). Es un medio líquido complejo de uso general para el cultivo de bacterias ingredientes <g/L) Peptona de caseína 5.0 NaCI 8.0 Extracto de carne 3.0 PH 6.5-7.0 a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado b. Ajustar el pH c. Distribuir en tubos de ensaye con tapón de rosca d. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos 2. Agar nutritivo (AN). Es un medio sólido complejo de uso general para el cultivo de bacterias exigentes ingredientes (g/t) Peptona de caseína 5.0 NaCI 8.0 Extracto de carne 3.0 Agar 15.0 PH 6.5-7.0 a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado, menos el agar. b. Ajustar el pH c. Agregar el agar y calentar a ebullición durante 1 minuto d. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos e. Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones asépticas. 3.Medio Mínimo de Sales (MM). Es un medio químicamente definido de uso general para el cultivo de bacterias poco exigentes. ingredientes (g/L) Medio 1. Glucosa" 10.0 (NH4)2SO4 5.0 MgSO4«7H2O 2.0 K2HPO4 2.0 FeSO4-7H2O 0.1 DH 6.5-7.0 a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado, excepto la glucosa. b. La glucosa debeiá disolverse en recipiente separado de las sales. c. Ajustar el pH en el medio de sales. d. Agregar el agar (15 g/L) y calentar a ebullición durante 1 minuto. e. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos las dos soluciones. f. Dejar enfriar a 40°C y cerca del mechero mezclar las soluciones. g. Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones asépticas. 107 manual de prácticas del - ".": ¿ ¿ ?í VaO :*T: DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
4. Agar de Eosina azul de metileno (EMB-agar). Es un medio de cultivo comercial utilizado para identifica- ción y diferenciación de enterobacterias. Ingredientes <g/L) Peptona de gelatina 10.0 Lactosa 5.0 Sacarosa 5.0 K2HPO4 2.0 Eosina 0.4 Azul de metileno 0.065 Agar 13.5 (0 ca a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco. b. Calentar a ebullición durante 1 minuto c. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos d. Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones asépticas. 5. Agar para Estafilococos No. 110. Es un medio selectivo comercial para el aislamiento e identificación de estafilococos. ingredientes (g/L) Extracto de levadura 2.5 Peptona de caseína 10.0 Gelatina 30.0 Lactosa 2.0 D-Manitol 10.0 NaCI 75.0 K2HPO4 5.0 Agar 15.0 pH final 7.0 a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco. b. Calentar a ebullición durante 1 minuto c. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos d. Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones asépticas. 6. Papa-Dextrosa Agar (PDA). Es un medio sólido complejo comercial de uso general para el cultivo de hongos. Ingredientes (g/L) Glucosa 20.0 Extracto de papa 4.0 Agar 15.0 PH 5.6 a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco. b. Ajustar el pH c. Calentar a ebullición durante 1 minuto d. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos e. Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones asépticas. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
7. Papa Dextrosa Agar rosa de bengala Es un medio sólido complejo de uso general para el aislamiento de hongos Ingredientes (g/L) Glucosa 20.0 Extracto de papa 4.0 Rosa de bengala 0.03 Agar 15.0 pH 5.6 a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado, menos el agar b. Ajustar el pH (0 c. Agregar el agar y calentar a ebullición durante 1 minuto a d. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos •o e. Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones asépticas. 8. Czapek-Dox Agar (CDA) Es un medio de sales, de uso general para el cultivo de hongos poco exigentes. Ingredientes <g/u Sacarosa 30.0 NaNO3 2.0 KH2PO4 1.0 MaSO4-7H2O 0.5 KCI 0.5 FeSO4-7H2O 0.01 Agar 15.0 PH 5.6 a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado. Ajustar el pH b. Agregar el agar y calentar a ebullición durante 1 minuto c. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos d. Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones asépticas. 9. Caldo rojo de fenol Es un medio con diferentes azucares (glucosa, sacarosa, manitol) para pruebas de fermentación Ingredientes (g/L) Azúcar 20.0 KH 2 PO 4 9.1 K 2 HPO 4 9.5 Extracto de levadura 0.1 Rojo de fenol 0.01 pH final 6.8-7 a. Disolver cuidadosamente las sustancias b. Ajustar el pH c. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca d. Colocar un tubo de Durham invertido e. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos 109 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
10. Medio citrato de Simmons Agar. Medio complejo de prueba de utilización de citrato en enterobacterias Ingredientes (g/U Citrato de Sodio 2.0 K2HPO4 1.0 NH4H2PO4 1.0 MgSCy7H 2 O 0.2 NaCI 5.0 FeSCy 7H2O 0.01 Agar 15.0 Azul de bromotimol 0.08 (0 PH 7.0 CQ 0 a. Disolver cuidadosamente las sustancias b. Ajustar el pH c. Calentar a ebullición durante 1 minuto. d. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca. e. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos f. Dejar solidificar el medio en forma inclinada. 11. Caldo urea. Se emplea para la identificación de bacterias, particularmente para diferenciar los miembros del género Proteus de Salmonella yShlgella Ingredientes <g/U Urea 20.0 KH2PO4 9.1 K2HPO4 9.5 Extracto de levadura 0.1 Rojo de fenol 0.01 pH final 6.8 a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco. b. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca. c. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. 12. Medio SIM. Medio semisóiido usado rutinariamente en la diferenciación e identificación de cultivos de Enterobacterias y que detecta la producción de sulfuras, indol y movilidad de las mismas. Ingredientes (g/L) Peptona de caseína 20.0 Peptona de carne 6.1 Sulfato de hierro y amonio 0.2 Tiosulfato de sodio 0.2 Agar 3.5 pH final 7.3 a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco. b. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca. c. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. 110 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
13. Agar almidón. Para determinar actividad amilolítica ingredientes (g/U Almidón 10.0 Peptona de caseína 5.0 NaCI 8.0 Extracto de carne 3.0 Agar 15.0 pH 6.5-7.0 ti a. Disolver cuidadosamente las sustancias t b. Ajustar el pH (8 a c. Calentar a ebullición durante 1 minuto. o d. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos T3 14. Medio de leche con tornasol. Medio comercial para diferenciar microorganismos sobre la base de sus múltiples reacciones metabólicas en un medio lácteo ingredientes (g/L) Leche descremada deshidratada 100 Polvo de tornasol 0.75 a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco. b. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca. c. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. 15. Agar de hierro y triple azúcar TSI. Medio comercial para identificar y diferenciar enterobacterias. Se basa en la formación de sulfuros y fermentación de glucosa, sacarosa y lactosa. ingredientes (g/L) Mezcla de peptonas 20.0 NaCI 5.0 Lactosa 10.0 Sacarosa 10.0 Dextrosa 1.0 Sulfato de amonio férrico 0.2 Tiosulfato de sodio 0.2 Rojo fenol 0.025 Agar 13.0 pH final 7.3 a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco. b. Calentar a ebullición durante 1 minuto. c. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca. d. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos e. Dejar solidificar el medio en forma inclinada. 111 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
16. Medio de gelatina. Medio comercial para determinar actividad de proteasas Ingredientes (g/U Peptona de gelatina 5.0 Extracto de carne de res 3.0 Gelatina 120.0 pH final 6.8 a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco. b. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca. c. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos QQ 17. Medio de agar nutritivo blando.- Es un medio semisóiido complejo de uso general para determinar movi- lidad de bacterias Ingredientes (0/L) Peptona de caseína 5.0 NaCI 8.0 Extracto de carne 3.0 Agar 3.5 PH 6.5-7.0 a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado b. Ajustar el pH c. Calentar a ebullición durante 1 minuto d. Distribuir en tubos de ensaye con tapón de rosca e. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos 18. Medio de cultivo complejo. Para la curva de crecimiento microbiano probando diferentes concentraciones de sustrato carbonado. (1-20 g/L) Ingredientes (g/L) Glucosa 10.0 Peptona de caseína 2.0 Extracto de levadura 0.5 K2HPO4 0.5 PH 6.5 a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado. b. Agregar la cantidad de glucosa correspondiente c. Ajustar el pH d. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. 112 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
19. Caldo microinoculación. Medio comercial para cultivar y preparar inóculos de Lactobacilos y otros microorganismos utilizados en ensayos microbiológicos. ingredientes <g/U Extracto de levadura 20.0 Mezcla de peptonas 5.0 Dextrosa 10.0 •o KH2PO4 2.0 o Polisorbato 80 0.1 PH 6.5 a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado. w { b. Ajustar el pH o c. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. 113 manual de prácticas del *> > , DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
114 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
• ;; • - Atlas de pruebas bioquímicas DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
116 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
CITRATO DE SIMMONS USINA DESCARBOXILASA TRIPLE A Z Ú C A R H I E R R O a: negativo, b: y c: positiva a: negativo, b:, c: y d: positiva a: negativo, b: ácido/ácido c: ácido/alcalino con gas PRODUCCIÓN DE GAS EN CAMPANA DE DURHAM SULFURO INDOL MOHLIDAD a: negativo, b: positivo con gas, c: positivo sin gas a: sin inocular, b: microorganismo no móvil, c: microorganismo móvil LECHE TORNASOLADA AISLAMIENTO DE Rhodotorula a: negativo, b:, c: y d: positiva sp. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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Manual de prácticas del Laboratorio de Microbiología General, se terminó de imprimir en el mes de junio de 2004 en la Sección de Talleres Gráficos del Departamento de Publica- }** -> ¿0 ciones de Rectoría General de la Universidad Autónoma Metropolitana. Se tiraron 1000 ejem- *> #^ #n piares sobre papel gráfico bond de 60 kgs., en tipos Castle de 11 y 13 pts., en interiores y de »O * * 32 y 17 pts., para portada. Diagramación, formación y portada, diseñados por D.G. Liliana Hidalgo Sánchez de Tagle, de la Sección de Textos y Formación del mismo Departamento. kfQ ** 0 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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N.E. 0534 $17.00 9 789703 101412 Manual de prac. lab de microbiología general, publicaciones CBS UAM-Iztapalapa Librería DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com

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Manual de prácticas guía

  • 1.
    Casa abierta altiempo UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA manual de prácticas laboratorio MICROBIOLOGÍA GENERAL María de los Angeles Aquiahuatl Ramos María de Lourdes Pérez Chabela DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  • 2.
    Rector General Dr. Luis Mier y Tetón Casanueva Secretario General Dr. Ricardo Solís Rosales UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA - Iztapalapa Rector Dr. José Lema Labadie Secretario Mtro. Luis Javier Melgoza Valdivia División de Ciencias Biológicas y de la Salud Director Dr. J. Gerardo Saucedo Castañeda Secretario Académico M. en C. Arturo L. Preciado López Departamento de Biotecnología jefe del Departamento Dr. J. Mariano García Garibay ISBN 970-31-0141-0 Primera Edición: 2004 Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa Av. San Rafael Atlixco No. 186 Col. Vicentina. Del. Iztapalapa, C.P. 09340 México, D.F. Impreso y hecho en México DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  • 3.
    DERECHOS RESERVADOS ©2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  • 4.
    DERECHOS RESERVADOS ©2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  • 5.
    . ><,• - ? . ' - ' " - '-', laboratorio MICROBIOLOGÍA GENERAL w de los Angeles Aquiahuatl Ramos María de Lourdes Pérez Chabela DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  • 6.
    Agradecemos al Directorde la División de Ciencias Biológicas y de la Salud Dr. Gerardo Saucedo Castañeda por todo el apoyo para la publica- ción de este manual de prácticas del laboratorio de ,¡ —*: :: ^ GENERAL Al Sr. Jorge Lodigliani por su apoyo en el procesado de las fotografías. Al Dr. Alfonso Totosaus y al Sr. Wilfrido Rodríguez por su ayuda en el diseño de las figuras. A toda la gente que revisó este manual, que con sus aportaciones enri- quecieron este trabajo. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  • 7.
    índice 7 PRESENTACIÓN 9 RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIANTE o •o PRÁCTICA # 1 o 12 Preparación y esterilización de materiales y medios de cultivo 14 Preparación del material de vidrio y medios de cultivo n 15 Esterilización de materiales y medios de cultivo t 15 Preparación de las cajas de Petri y tubos con medios de cultivo A a o 16 Prueba de esterilidad de materiales •o PRÁCTICA # 2 20 Preparación, fijación y coloración simple de frotis 22 Preparación de frotis 22 Fijación del frotis 23 Tinción simple 24 Observación al microscopio PRÁCTICA # 3 28 Tinción diferencial de Gram y tinciones selectivas 30 Tinción diferencial de Gram 31 Tinción selectiva de endosporas 31 Tinción negativa para observación de cápsulas 32 Observaciones al microscopio PRÁCTICA # 4 36 Métodos de cultivo y aislamiento de bacterias 38 Técnica de estría cruzada 38 Siembra en tubos con caldo y agar nutritivo 39 Siembra de cajas de Petri con medios diferenciales y selectivos 40 Condiciones de incubación PRÁCTICA # 5 46 Métodos de cultivo y descripción morfológica de hongos 48 Siembra de hongos 49 Descripción macroscópica de levaduras y mohos 49 Descripción microscópica de levaduras 49 Descripción microscópica de mohos en montaje con cinta adhesiva PRÁCTICA # 6 54 Pruebas de diferenciación bioquímica 56 Técnica de Inoculación en cajas de Petri 57 Técnicas de Inoculación en tubos 57 Evaluación de actividades metabólicas manual de prácticas del ?>l~ ' T " ; Ir fX {, f * 4#% „* } ':"'-, ;': ; f *í ," *' " J-' <-'" ^ o < , DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  • 8.
    PRÁCTICA # 7 64 Métodos de cuantificación de microorganismos 66 Técnica turbidimétrica 67 Técnica de cuenta directa en cámara de Neubauer 68 Técnica de dilución y siembra en placa PRÁCTICA # 8 74 Efecto del pH y la temperatura en el crecimiento microbiano 76 Efecto de la Temperatura 77 Efecto del pH PRÁCTICA # 9 (O 82 Efecto de la actividad de agua en el crecimiento microbiano a 84 Efecto de la presión osmótica y actividad de agua (aw) en hongos y bacterias 84 Efecto de la desecación PRÁCTICA # 10 90 Curva de crecimiento bacteriano 92 Inoculación e incubación del cultivo 92 Tratamiento de las muestras 97 BIBLIOGRAFÍA GENERAL 101 Anexo 1 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Y COLORANTES 105 Anexo 2 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 115 Anexo 3 ATLAS DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  • 9.
    La Microbiología, esuna ciencia relativamente reciente con respecto a otras ramas de la Biología. El estudio de los microorganismos se inició a partir de que Antonie van Leeuwenhoek en 1670 inventó el microscopio, y que a partir de los estudios de Luis Pasteur en 1876, se logró el mayor desarrollo y reconocimiento de los microorganismos o como actores de una gran diversidad de procesos. •o Aunque durante mucho tiempo estos organismos causaron graves problemas de en- i fermedades en plantas, animales y humanos también es cierto que desde la antigüedad algunas especies microbianas han sido utilizadas en procesos de producción de alimentos fermentados como quesos, vino, pan y cerveza, entre I I o otros y actualmente se ha reconocido su importancia en diversas áreas de inves- •o tigación básica, en la industria alimentaria, ambiental y farmacéutica. El objetivo general del curso práctico de Microbiología General es que el alumno se inicie en el conocimiento de la biología básica de los microorganismos, en sus características morfológicas, nutricionales de crecimiento, control y que ad- quiera las habilidades necesarias para su manipulación en el laboratorio. Este manual está dirigido a estudiantes que iniciarán su experiencia en el manejo de los microorganismos, por lo que consideramos de gran importancia incluir al principio del mismo una serie de recomendaciones relacionadas con las reglas generales del laboratorio y los principales procedimientos que el estudiante deberá aprender, para que manipule en forma adecuada a los microorganismos y garantizar tanto su seguridad como la de sus compañeros. Este manual contiene 10 prácticas, diseñadas para que el estudiante se familiarice gradualmente con los procedimientos de cultivo y observación de bacterias y hongos. El orden de presentación, corresponde al programa del curso teórico trimestral de Microbiología General, que forma parte del plan de estudio de las carreras de Ingeniería de los Alimentos e Ingeniería Bioquímica Industrial im- partidas en la UAM-Iztapalapa. En cada práctica se presentan los Objetivos y una breve Introducción para facilitar la comprensión de los mismos, después se indican los Materiales necesarios y Procedimientos a realizarse en forma de instrucciones numeradas que se com- plementan con figuras y esquemas. Posteriormente, en cada práctica se proponen formas de presentación de los resulta- dos en cuadros, para que el alumno recopile sus observaciones. También se inclu- yen preguntas en forma de cuestionarios que el estudiante debeiá resolver con- sultando los materiales bibliográficos sugeridos al final de este manual. También se presentan tres Anexos que contienen las indicaciones para la preparación de soluciones y colorantes (anexo 1) y de medios de cultivo (anexo 2), necesa- rios para la realización de cada una de las prácticas; así como uno (anexo 3) de fotografías ilustrativas de algunos procedimientos y pruebas bioquímicas de diferenciación microbiana. manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  • 10.
    Consideramos que estematerial puede ser de gran ayuda para los profesores y alumnos de la UAM en el curso de Microbiología General, está elaborado de acuerdo a la infraestructu- ra de los laboratorios y a la programación trimestral del curso, con sesiones de 4 horas/ semana. Dra. Ma. de Los Angeles Aqulahuatl Dra. Ma. de Lourdes Pérez Chabela i a o DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  • 11.
    RECOMENDACIONES PARA ELESTUDIA!* Reglas de laboratorio 1. Durante las sesiones, siempre deberá usar una bata de laboratorio bien abotonada, que deberá quitarse antes de abandonar el laboratorio. 2. No deberá sacar del laboratorio ningún equipo, medios o cultivos microbianos. 3. Evitar la acumulación sobre la mesa de trabajo de objetos no relacionados con la práctica de laboratorio. Colocar todos los objetos personales (libros, mochilas, etc.) en la zona especificada por el profesor. a •o 4. Se prohibe ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimento o bebida dentro del laboratorio. 5. Se prohibe fumar, aplicarse cosméticos o tocarse la cara con las manos o algún otro objeto. Se deberá lavar meticulosamente las manos con jabón y agua antes de salir del laboratorio, incluso cuando salga por breves periodos. 6. Por seguridad no debeiá pipetear oralmente ningún tipo de cultivos microbianos, esta actividad deberá realizarse con pipetas accionadas de forma mecánica o automática, tratando de evitar la formación de aerosoles. 7. No se admitirán visitas personales que distraigan la atención y pongan en riesgo la seguridad en el trabajo que se realiza. Procedimientos de laboratorio 1. Antes y después de cada sesión piáctica los alumnos deberán limpiar las mesas de trabajo con el desinfec- tante que se le proporcionará para este fin. 2. Cuando se utilice el mechero, este deberá colocarse alejado del microscopio y otros equipos así como de sus cuadernos o prendas de vestir. 3. Al concluir cada sesión el estudiante deberá asegurarse de que los materiales de desecho u objetos contami- nados sean colocados en recipientes específicos para ello, colocados en lugares apropiados, que les indicará el profesor. 4. Siempre deberá dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados (microscopios, balanzas analíticas, autoclave, potenciómetros, etc.) y reportar al maestro cualquier irregularidad en el funcionamiento. 5. En caso de producirse un incendio o una herida personal, el alumno deberá notificarlo de inmediato al profesor. En el caso de derrame de cultivos o rotura de recipientes con cultivos activos, deberá conservar la calma y además de informar al profesor, seguir inmediatamente el procedimiento: a. Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersión b. Poner abundante solución desinfectante sobre las toallas manual de prácticas del LABORATORIO PE NIICROBlOLOGt** DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  • 12.
    c. Dejar transcurriral menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el receptáculo destinado a la eliminación de materiales contaminados. Materiales indispensables en cada sesión de laboratorio 1. Bata de laboratorio limpia y con botones 2. El protocolo de la práctica y bitácora de laboratorio 3. Un pedazo de tela sin pelusa, cerillos, tijeras, cinta de enmarcar, marcador indeleble o etiquetas pequeñas. i DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  • 13.
    o o o Preparación y esterilización de materiales y medios de cultivo DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  • 14.
    DERECHOS RESERVADOS ©2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  • 15.
    Objetivos introducción Que el alumno conozca los principios Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cam- generales de las técnicas de estéril!- bios de condiciones ambientales y en la medida en que se han podido zación de materiales de vidrio y me- adaptar a estos cambios, se han distribuido en una gran diversidad de dios de cultivo de uso común en Mi- hábitats incluyendo los de condiciones extremas sobre todo de tipo físi- crobiología. Observará el efecto de co y químico. o trol de la contaminación microbiana Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfección y este- en el laboratorio. rilización para limitar su presencia o eliminarlos. La esterilización es un método de eliminación total de todo tipo de organismo y que asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente, mientras que la desinfección es un proceso que solamente elimina formas vegetativas de los microorganismos. La esterilización con calor seco y húmedo son los procedimientos de mayor utilización en Microbiología. El calor seco desnaturaliza las enzimas y destruye a los microorganismos por oxidación, por ejem- plo al ponerlos directamente a la flama de un mechero o en horno a 150-180°C durante 2 horas. Estos métodos se aplican principal- mente en la esterilización de asas de inoculación y todo tipo de material de vidrio y quirúrgico. Los procesos con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de cul- tivo, soluciones, y cultivos bacterianos que se desechan, el más recomendable es el autoclave en el que se utiliza vapor de agua a presión para alcanzar temperaturas de 121 °C. El material se deja a esta temperatura durante 15 minutos para asegurarse de la destruc- ción de endosporas, que son las estructuras bacterianas más resis- tentes al calor. Cuando se requiere esterilizar diferentes materiales sensibles al calor como las soluciones de vitaminas, aminoácidos, etc. se esterilizan por filtración en membranas estériles de 0,2 mieras de diámetro y para el caso de materiales plásticos es recomendable el uso de gases como oxido de etileno o con radiaciones gamma. Las superficies generalmente se desinfectan con radiaciones U.V. o compuestos químicos en forma líquida como: los fenoles, compuestos cuaternarios de amonio (alquildimetil bencilamonio), formaldehído, alcoholes, halógenos y detergentes. Cada uno de estos procedimientos tienen ventajas y desventajas de uso, los sistemas de filtración son muy eficientes y rápidos para la este- rilización pero sólo se aplican en pequeños volúmenes. Los fenoles y compuestos cuaternarios de amonio son muy efectivos para la desinfección de superficies pero son muy corrosivos. Los detergentes y los alcoholes tienen actividad limitada contra espo- ras bacterianas y algunos virus por lo que sólo son desinfectantes. 13 m a n u a l d e p r á c t i c a s d e l - * . . ' . ; .,'-.*.,:;...?. ::* ' , < ; >•<*., - r - r . r - - " • * ' DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  • 16.
    Materiales 7 tubos de cultivo de 16 x 150 mm con tapón de baquelita 3 tubos de cultivo de 16 x 150 mm sin tapón de baquelita 9 cajas de Petri de vidrio 3 pipetas de 1 o 2 mL 3 pipetas de 10 mL 1 pipeta Pasteur 3 matraces Erlenmeyer de 250 mL 1 parrilla de calentamiento con agitación (O 1 autoclave a 1 potenciómetro 1 horno de calor seco 1 mechero Fisher 1 incubadora a 35°C 1 hisopo estéril, algodón y gasa papel manila o estraza para envolver Caldo nutritivo (Anexo 2.1) Medio de agar nutritivo (Anexo 2.2) Medio de agar papa dextrosa PDA (Anexo 2. 6) Medio mínimo de sales (Anexo 2.3 ) Soluciones amortiguadoras pH 4 y 7 Procedimiento El profesor explicará los principios generales de trabajo en el laboratorio de Microbiología, enfatizando en la desinfección de áreas así como en la preparación y esterilización de los medios de cultivo y materiales necesarios para el trabajo cotidiano con microorganismos. También hará las demostraciones necesarias para que el estudian- te aprenda a envolver los materiales, así como su manejo en condiciones asépticas. Preparación del material de vidrio y medios de cultivo 1. Lavar perfectamente las cajas de Petri y pipetas con escobillón y detergente. Enjuagar con abundante agua corriente. 2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada con una piceta, por las paredes interio- res. Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel de envoltura. No debe secar el material por ningún otro medio. 3. Una vez seco el material, se procederá a envolver las cajas de Petri y pipetas con papel de estraza. Para los tubos y matraces se elaborarán tapones de algodón y gasa, procurando que ajusten con holgura, sobre los que finalmente se les colocará un capuchón de papel. 4. Preparar 20 mL de Caldo Nutritivo (CN) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y ajustar el pH a 6.5-7.0 en un potenciómetro, agregando con una pipeta Pasteur poco a poco solución de HCI 0.1 M o solución de NaOH 0.1 M, en caso de que el pH sea más alcalino o ácido respectivamente. Vaciar 5 mL en cuatro tubos de cultivo con tapón de baquelita que deberán cerrar sin llegar al tope. 14 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  • 17.
    5. Preparar 120 mL de Agar Nutritivo (AN), calentar la mezcla en una parrilla con agitación constante hasta ebullición, durante 1 minuto (cuidar que no se proyecte) y vaciar enseguida 5 mL de medio en tres tubos con tapón de rosca. Enjuagar inmediatamente la pipeta para evitar que se solidifique el agar. El resto se esteriliza en el autoclave. 6. Preparar 120 mL de medio de cultivo Papa dextrosa agar (PDA) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL, ajustar el pH del medio a 5.0-5.6. Colocar un magneto de agitación y calentar hasta ebullición durante 1 minuto; cuidando de que no se proyecte o derrame. Posteriormente vaciar 7 mL de medio en tres tubos que se taparán con tapón de algodón y gasa. El resto se esteriliza en el autoclave. 7. Preparar 120 mL de medio de cultivo Mínimo de sales (MM) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL a I Esterilización de materiales y medios de cultivo •o o 1. Las cajas de Petri y pipetas envueltas se colocaran en horno a 150 °C durante 2 horas. Después de sacarlas, dejarlas enfriar y abrir los paquetes únicamente en área aséptica. 2. Los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de acuerdo a las siguientes instrucciones: a. Revisar que el nivel de agua coincida con la marca en el tubo indicador. En caso necesario añadir agua destilada. b. Conectar la autoclave y poner la perilla de control en calentamiento alto. Acomodar los medios y materia- les en la canasta del autoclave y colocarla dentro. c. Cerrar la puerta, apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada y esperar a que salga el vapor de agua por el orificio de purgado. Después cerrar este orificio con la válvula de seguridad. d. Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121 °C o 15 Ibs de presión revisando continuamente la escala del manómetro. Una vez alcanzada esta temperatura deberá bajarse el nivel de calentamiento mo- viendo la perilla de control al nivel medio o bajo. e. Mantener el equipo en estas condiciones durante 15 minutos f. Apagar la autoclave y dejar que baje la presión al valor de "0". Quitar la válvula de seguridad y con la ayuda de guantes de asbesto o una jerga húmeda abrir cuidadosamente la puerta, de adelante hacia atrás para evitar quemaduras por la salida del vapor. Preparación de las cajas de Petri y tubos con medios de cultivo 1. Los tubos con medios de cultivo con agar, se deberán colocar en una superficie inclinada de tal forma que el medio se solidifique a una distancia aproximada de 1-2 cm de la boca del tubo. 2. Dejar que los medios de cultivo en matraces que se han sacado de la autoclave se enfríen a una temperatura aproximada de 40-50 °C, que coincide con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin sentir un calor excesivo. 3. Cerca del mechero, etiquetar 3 cajas con AN, 3 cajas con PDA y 3 con MM. Los medios de cultivo se vacían en las cajas de Petri (aproximadamente 25-30 mL) en zona aséptica cerca del mechero o en campana de flujo laminar. 4. Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 30 minutos) y posteriormente envolver las cajas cuidado- samente con papel estraza o acomodarlas en forma invertida en bolsa de plástico limpias. 5. Guardarlas en refrigeración hasta 24 horas antes de utilizarlas. 15 1 manual de prácticas del LABORATORIO PE «ICIlCIBiOLCIGÍJI S E Ü I A L DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  • 18.
    Prueba de esterilidadde materiales 1. Colocar los tubos con agar inclinado y las cajas de Petri en forma invertida en una estufa de incubación ajustada a 30 °C durante 24-48 horas. 2. Revisar los tubos y cajas de Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la aparición de turbidez, nata superficial y/o depósito de material en el fondo de los tubos con medio líquido; así como la formación de colonias microbianas en la superficie de medios sólidos. 3. Si no hay contaminación de los medios, se abrirá una de las cajas de Petri de cada medio durante 1 minuto en el laboratorio o zonas accesorias al mismo y se etiquetará como"al aire". (0 CQ 0 4. La otra caja de cada medio de cultivo se abre durante 30 segundos cerca del mechero y se etiquetará "en área aséptica". 5. La tercer caja se conservará sin abrir y se etiqueta como "control". Resultados A. Hacer la descripción morfológica de las colonias obtenidas en las cajas con diferentes medios de cultivo (AN, PDA y MM) y con los distintos tratamientos en relación a la caja control. B. Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco crecimiento, (++) crecimiento regular y (+++) crecimiento abundante. C. Discuta los resultados y determine si la esterilización en el autoclave y horno fue adecuada, así como el manejo de los materiales. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  • 19.
    Cuadro 1 Descripción morfológica de microorganismos en cajas de Petri con diferentes medios de cultivo. MEDIO Abierta al aire Abierta en área Control DE CULTIVO aséptica a AGAR t NUTRITIVO A a « MÍNIMO DE SALES PAPA DEXTROSA AGAR Cuestionario 1) ¿Cuáles son los métodos de esterilización más utilizados en Microbiología? ¿En que tipo de materiales se aplica cada uno? 2) Explique cuáles son las diferencias entre los procesos de esterilización, desinfección y asepsia. ¿Cómo se relacionan estos procedimientos con la pasteurización? 17 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  • 20.
    DERECHOS RESERVADOS ©2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  • 21.
    • o o Preparación, fijación y coloración simple de frotis DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
  • 22.
    DERECHOS RESERVADOS ©2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Objetivos Introducción Que el alumno aprenda las técnicas Debido al pequeño tamaño de la mayoría de los microorganismos, se de preparación de frotis, de fijación requiere de un microscopio óptico, ya sea de campo claro o de campo y coloración más utilizadas en el es- oscuro para hacer la descripción morfológica de éstos. El microscopio de tudio microscópico de cultivos uso más común es el de campo claro, en el que la observación de células o •o bacterianos, obtenidos de medios vivas es limitada debido a que las células son incoloras y permiten el paso o sólidos y líquidos. Que identifique las de una gran cantidad de luz. principales formas bacterianas y la importancia de las tinciones simples en la caracterización morfológica de La observación de frotis teñidos es más recomendable. El frotis se prepara haciendo una extensión de los microorganismos sobre una superfi- a I estos microorganismos. cie transparente, en la cuál se fijan y tiñen los microorganismos. o •o De acuerdo al número de soluciones colorantes y a los objetivos de estudio se pueden realizar diferentes tipos de tinciones como son: simple, diferencial, negativa y selectiva. Los frotis de cultivos líquidos se deberán fijar con alcohol para evitar resi- duos del medio, que al quemarse darán interferencias en las obser- vaciones y los de colonias de medios sólidos se fijan generalmente con calor. Después de la fijación, los frotis son teñidos con diferen- tes colorantes sintéticos derivados de anilina. Los colorantes más utilizados son sales formadas por iones coloridos car- gados conocidos como cromóforos. Por ejemplo: Cloruro de Azul de metileno Azul de metileno* + ci- (Cromoforo) Si el cromoforo es un ion positivo el colorante es de tipo básico, pero si la carga es negativa será de tipo ácido. La mayoría de las bacterias son teñidas por colorantes básicos, que permean la pared celular y se adhieren por enlaces iónicos débiles a moléculas con cargas nega- tivas de la célula bacteriana. La tinción de las bacterias con azul de metileno, es un ejemplo de tinción simple que facilita la observa- ción de forma, tamaño y arreglo de las células. 21 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Materiales 1 Probeta de 100 mL 1 Vaso de precipitados de 100 mL 1 mechero 1 asa de siembra 5 Portaobjetos Piceta con agua destilada Microscopio compuesto de campo claro Azul de metileno alcalino (Anexo 1.2) Alcohol etílico al 70% (Anexo 1.7) (0 Fenol al 2% (Anexo 1.9) CQ Aceite de inmersión o Procedimiento El profesor proporcionará a los alumnos cultivos líquidos y sólidos de: Escherichla col¡, Streptococcus sp., Staphylococcus sp., Badllus subtilis, Klebsi'ella sp. y Pseudomonas fluorescens. El estudiante preparará frotis de cada cepa obtenida de cultivo sólido y otros de cultivo líquido, los cuales fijará y teñirá con azul de metileno. El profesor explicará los principios de manejo del microscopio y la forma de ajustar la iluminación. Preparación de frotis 1. Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos (Figura 1). 2. Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo. 3. Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos. Después acercar al mechero el tubo de cultivo, quitarle el tapón y flamear rápidamente la boca del mismo. Introducir el asa en el tubo de cultivo y tomar cuidadosamente la muestra. 4. Para el caso de cultivos líquidos, colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extenderla suavemente en un área circular de 2 cm. de diámetro aproximadamente y esterilizar nuevamente el asa. Dejar secar el frotis al aire y repetir los procedimientos 3 y 4 por 2-3 veces más. 5. Si el cultivo es de medio sólido, previamente se colocará en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada en la que se mezcla una pequeña muestra del cultivo que se toma siguiendo las indicaciones del paso 3. Extenderla suavemente y dejar secar al aire. Fijación del frotis 1. Fijar los frotis de cultivos líquidos con dos gotas de metanol o etanol absoluto y dejar secar al aire (hacer esto en zonas alejadas al mechero). 22 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    2. Los frotis de cultivos sólidos, completamente secos se fijarán con calor. Para esto se pasaiá el frotis rápida- mente 2-3 veces en el interior de la parte amarilla de la flama del mechero. 3. Palpar la parte inferior del portaobjetos con el dorso de la mano izquierda para enfriar y comprobar que no hubo sobrecalentamiento. Tinción simple | i 1. Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto. 2. Eliminar el exceso de colorante con lavado suave al agua corriente o con la ayuda de la piceta con agua a destilada. o •o 3. Dejar secaral aire Marcar el área por debajo del portaobjeto CULTIVO SÓLIDO CULTIVO LIQUIDO Coloque 1 o 2 gotas de agua Colocar 1 o 2 asadas de medio de cultivo con asa estéril Con asa estéril tomar una Distribuir en la zona marcada muestra de la colonia y mezclarla con el agua Dejar secar al aire Dejar secar al aire. Repetir los procedimientos anteriores dos veces Fijar con 2 gotas de alcohol, y Pasar rápidamente sobre la dejar secar al aire flama del mechero Figura 1. Preparación y fijación de frotis bacterianos a partir de cultivos sólidos y líquidos manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Observación al microscopio 1. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda. 2. Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observación, siguiendo las indicaciones del profesor. 3. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparación con el objetivo de 10X, posterior- mente pasar al de 40X. Para la observación con el objetivo de 100X, colocar previamente una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación. 4. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de aceite y evitar incrustaciones que dañan estos sistemas. Resultados A. Reportar las observaciones de forma, agrupación y tamaño relativo de cada uno de los microorganismos en el cuadro de resultados. B. Comparar sus observaciones con las reportadas en la literatura. 24 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Cuadro 2 Observaciones microscópicas de frotis de cultivos bacterianos Escherichla coll Streptococcus sp. Cultivo: Líquido 0) (0 Aumento total: t (0 a Forma: (cocos, bacilos, etc.) Agolpamiento de las células (solos, pares, cadenas, etc.) Tamaño: Cultivo: Sólido Aumento total: Forma: (cocos, bacilos, etc. Agrupamiento de las células (solos, pares, cadenas, etc.) Tamaño: Cuestionario 1. Investigue cuáles son las estruauras celulares o moléculas responsables de la tinción simple realizada. De ejemplos de otros colorantes que podrían utilizarse. 2. ¿Por qué se recomienda fijar los frotis de cultivos líquidos con alcohol y no con calor? ¿Por qué se deben poner varias veces muestras del cultivo líquido y sólo una muestra de cultivos sólidos al preparar los frotis? 25 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    3. ¿Cuáles son las principales precauciones de manejo del microscopio y por qué se debe utilizar el aceite de inmersión al hacer el estudio microscópico de bacterias? 4. ¿Cuáles son las desventajas o limitaciones de la tinción simple? a o 5. ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la preparación de frotis? 6. Bibliografía consultada Referencias bibliográficas • Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Practicas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México. • johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings Publishing Company, Inc. USA. • Practical Handbookof Microbiology. William MO'Leary, Cornell Medical College, New York, New York, USA. CRC Press, 1989. • Holt, J. G., N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    z s ' - Í ' , -'- 0 Tinción diferencial de Gram y tinciones selectivas DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    DERECHOS RESERVADOS ©2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Objetivos introducción Que el estudiante clasifique algunas La tinción propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, es una especies bacterianas en Gram positi- de las tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifi- vas o Gram negativas de acuerdo a la ca los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y tinción de Gram. Que observe estruc- Gram negativas. El método se fundamenta en el hecho de que el coloran- turas bacterianas especiales, como las te primario (cristal violeta) tiñe por igual a todas las bacterias, pero la endosporas y cápsulas con tinciones combinación con el colorante es más permanente en los gram positivos. selectivas. Que comprenda la impor- tancia que tienen estas tinciones para Para establecer la diferenciación en estos dos grupos, se aplica un disol- la caracterización e identificación de vente del colorante primario que no tiene efecto sobre el grupo de las bacterias. microorganismos que lo retienen firmemente, pero lo elimina de aquellos que no son capaces de retenerlo, quedando por lo tanto completamente decolorados. En estas circunstancias, sería muy di- fícil su observación por lo que es preciso tratarlos con otro colorante llamado secundario, como la safranina. Este colorante no modifica el color de los microorganismos que habían retenido el color prima- rio, pero tiñe a los microorganismos decolorados. Estas diferencias de tinción de las bacterias se explican por cambios en la composición química y estructura de las paredes celulares, que faci- litan la retención o eliminación del colorante primario después del proceso de decoloración. Otras tinciones que permiten obtener mayor información son la negativa y la selectiva. La tinción negativa facilita las observaciones de la morfología y tamaño de las bacterias sin alteración por efecto del calor así como de estructuras especiales, como la cápsula de algu- nas especies bacterianas. La cápsula también llamada glicocálix es una estructura externa a la célula, formada de polisacáridos o polipéptidos, que confiere protección a las bacterias contra la dese- cación y la fagocitosis. La extensión sobre un portaobjetos en forma de capa fina de una mezcla de las bacterias con tinta china o nigrosina, permite observar en el microscopio estructuras especiales como son las cápsulas, que apa- recen como una zona clara que rodea la célula bacteriana en un fondo obscuro. Las tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas como las endosporas de Bacillus y Clostridium, bacterias en las que su presencia, forma y localización son importantes criterios de clasifi- cación taxonómica. Además, debido a la resistencia al calor de las endosporas y a que algunas especies son microorganismos patógenos de gran toxicidad, su de- tección en microbiología alimentaria y médica adquiere gran interés. manual de prácticas del arabio m: DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Materiales 1 Probeta de 100 mL 1 Vaso de precipitados de 100 mL 1 Parrilla de calentamiento 1 Mechero 5 Portaobjetos 1 Piceta con agua destilada Cristal violeta (Anexo 1.3) Safranina (Anexo 1.8) Lugol (Anexo 1.5) Solución de alcohol-acetona (Anexo 1.6) en Verde de malaquita (Anexo 1.4) Tinta china Fenol 2% (Anexo 1.9) Aceite de inmersión Microscopio compuesto de campo claro Procedimiento El profesor proporcionará a los alumnos cultivos líquidos y sólidos de: Escherichia coll, Streptococcus sp., Staphylococcus sp., Badllus subtills y Klebsiella sp. El estudiante preparará frotis de cultivo sólido y de cultivo líquido de cada microorganismo y aplicará la tinción de Gram. También realizará la tinción seieaiva de endosporas en un frotis fijado al calor de Badllus subtilis y la tinción negativa en cultivos de K/ebsfef/a sp. Tinción diferencial de Gram a) Cubrir el frotis con 2 gotas de cristal violeta durante 30 segundos a 1 minuto b) Lavar cuidadosamente el frotis con agua de la llave o destilada para eliminar el exceso de colorante c) Sacudir un poco y sin dejar secar cubrir el frotis con 2 gotas de lugol por 30 segundos. d) Lavar cuidadosamente el frotis con agua. e) Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante dejando que escurra hasta que no fluya más tintura. f) Inmediatamente lavar con agua. g) Aplicar 2 gotas de safranina durante 30 segundos. h) Lavar nuevamente con agua, eliminar cuidadosamente el exceso de agua con una toalla de papel y dejar secar al aire. i DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Tinción selectiva deendosporas a) Colocar un pequeño trozo de papel filtro sobre el frotis de Bacillus subtilk (Figura 2). b) Agregar verde de malaquita sobre el papel filtro de tal manera que cubra toda la preparación. c) Colocar el portaobjetos sobre un vaso de precipitados con agua en ebullición. d) Dejar durante 5 minutos evitando que se seque el colorante (agregar un poco más sí es necesario) y eliminar el colorante con agua destilada. t e) Cubrir con safranina durante 30 segundos. a "O f) Lavar nuevamente y dejar secar al aire. (a) (b) (e) Figura 2. Tinción selectiva de endosporas bacterianas Tinción negativa para observación de cápsulas a) Colocar una pequeña gota de tinta china en el extremo de un portaobjetos; colocar junto una gota del I cultivo líquido de Klebsiella sp. (Figura 3). Si se trata de un cultivo sólido, hacer una suspensión del micro- organismo en una gota de agua destilada y mezclar cuidadosamente con la tinta china. b) Distribuir la mezcla a lo ancho del portaobjetos, colocando otro portaobjeto perpendicular en ángulo de 45° sobre la muestra. 31 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    c) Desplazar poco a poco el segundo portaobjetos a lo largo del primero para hacer una capa fina de la mezcla. d) Dejar secar al aire. (a) 10 a o (d) Figura 3. Técnica de tinción negativa Observaciones al microscopio 1. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda. 2. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparación con el objetivo de 10X, posterior- mente pasar al de 40X. Para observar con el objetivo de 100X colocar previamente una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación. 3. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de aceite y evitar incrustaciones que dañan a estos sistemas. Resultados A. Reportar las observaciones de forma, agrupación, color y tamaño relativo tal como se indica en el Cuadro 3 de resultados. Hacer los dibujos de la morfología de cada uno de los microorganismos y colorearlos. B. Comparar las observaciones realizadas con las reportadas en la literatura. 32 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Cuadro 3 Descripción microscópica de cultivos baaerianos Descripción del cultivo: (líquido •o o sólido, edad del cultivo, etc.) I o Aumento total: cu t ti Forma: cocos, bacilos a Agolpamiento de las células •o Tamaño: Reacción de Gram TINCIÓN DE ENDOSPORAS Badllus subtills Streptococcus sp Descripción del cultivo: (líquido o sólido, edad del cultivo, etc.) Aumento total: Forma: cocos, bacilos Agrupamiento de las células Tamaño: TINCIÓN DE CÁPSULA Klebsiellasp. Streptococcus sp Descripción del cultivo: (líquido o sólido, edad del cultivo, etc.) Aumento total: Cuestionario 1. Explique en forma completa la teoría que explica la tinción de Gram. Investigue otros dos ejemplos de tinción diferencial. 33 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    2. ¿Cuáles son las fuentes de error más comunes en la tinción de Gram? 3. ¿Explique que reacción de Gram darán los cultivos de levaduras? ¿Estos resultados tendrán la misma impor- tancia que para las bacterias? ¿Por qué? 4. Explique el fundamento de la tinción de endosporas. ¿Por qué se debe calentar la preparación? ¿Que dificul- tades se tendrían si no se adiciona la safranina al final de la tinción? 5. Explique el fundamento de la tinción negativa realizada en la práctica.¿Qué tipo de información se obtiene? Investigue otra técnica de tinción selectiva que permita observar estas estructuras bacterianas. 6. Bibliografía consultada Referencias bibliográficas • Johnson T.R. and C L. Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings Publishing Company, Inc. EEUUA. • Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana. México. • Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition) Edited by Francés Pouch Downes and Keith Ito, 2001. • Practical Hahdt^ic of Microbiology. William M O'Leary, Cornell Medical College, New York, New York, USA. CRC Press, 1989. • Holt, J. G., N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA. j DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    ^ í -w'íV ^ Métodos de cultivo y aislamiento de bacterias DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Objetivos Introducción Que el alumno conozca las diferen- Las bacterias deben ser cultivadas en medios de cultivo de laboratorio tes técnicas de aislamiento en me- para caracterizar su crecimiento, hacer su identificación y determinar sus dios de cultivo sólido para la obten- actividades metabólicas. Un medio de cultivo es una solución acuosa de ción de cultivos puros de bacterias, diferentes compuestos que contiene todos los elementos indispensables Que el estudiante prepare medios de que requieren los microorganismos para crecer, •o i cultivo de uso general, diferenciales y selectivos para el cultivo de dife- Generalmente las bacterias son inoculadas o introducidas en medios líquidos rentes especies bacterianas. (caldos) o solidificados con agar para su propagación y/o conserva- ción, así como para estudiar sus características de crecimiento. Es im- portante recordar que la inoculación de los microorganismos en los medios de cultivo, siempre debelan realizarse en zona aséptica (cerca i del mechero o en campana de flujo laminar), condiciones que limitan 8. •o la presencia de microorganismos indeseables o contaminantes. Las técnicas de aislamiento, permiten la obtención de microorganismos a partir de muestras complejas (suelo, agua, alimentos, etc.) en las que hay una gran diversidad microbiana, así como para comprobar la pureza de los cultivos obtenidos. Los cultivos puros están forma- dos por un solo tipo de microorganismo; y son indispensables para conocer las características morfológicas, propiedades de tinción, actividad bioquímica, patogeniddad, sensibilidad a antibióticos e identificación de las especies microbianas. El aislamiento de cultivos microbianos puede realizarse por métodos de dilución, en medios sólidos por estría en placa o en medios líqui- dos. En el primer caso se considera que cada célula bacteriana que se separa daiá origen a una población que formará una colonia ca- racterística, visible a simple vista. La limitación principal de estas técnicas de dilución, es que no es práctica para el aislamiento a partir de mezclas donde el microorganismo de interés se encuentra en pequeñas cantidades, donde solamente se obtendrán las bacterias dominantes. Para favorecer el aislamiento de cultivos de baja densidad, se aplican mé- todos de cultivo especiales, en los que se utilizan medios que con- tienen nutrientes especiales, antibióticos, altas concentraciones de sales y/o condiciones de pH, luz o temperatura para favorecer el crecimiento del microorganismo de interés y se conocen como se- lectivos o de enriquecimiento. En ocasiones se pueden agregar a los medios de cultivo otros componen- tes como: sangre, colorantes, indicadores, etc. para distinguir espe- cies bacterianas diferentes por la forma en que metabolizan los sustratos que se manifiesta por cambios en la apariencia o modifi- cación del pH del medio de cultivo. Estos medios se conocen como medios diferenciales y son de gran utilidad para la caracterización e identificación de especies bacterianas. manual de prácticas del LABORATORIO ÍJ£ MICROBIOLOGÍA GENERAL _t DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Materiales 3 cajas de Petri con Agar nutritivo (Anexo 2.2) 2 cajas de Petri con Agar de eosina azul de metileno EMB (Anexo 2.3) 2 cajas de Petri con Agar para Estafilococos 110 (Anexo 2.5) 2 cajas de Petri con Medio Mínimo de sales (Anexo 2.3) 1 tubo con agua destilada estéril 2 tubos con Caldo Nutritivo (Ver Anexo 2.1) 4 tubos con Agar Nutritivo (Ver Anexo 2.2) 1 Mechero tú 1 Asa d e inoculación 0 1 Parrilla d e agitación 1 Autoclave Procedimiento El profesor proporcionará cultivos puros de Bacillussubtilis, Escherichia colí, Staphylococcusaureus, Pseudomonas fluorescens, Klebslella sp. y Streptococcus sp. También les proporcionará una muestra problema por equipo (con dos microorganismos diferentes) en la que practicarán la técnica de aislamiento por estría cruzada. Técnica de estría cruzada a) En la parte posterior y exterior de la caja, dividirla en cuatro cuadrantes. Tomar una muestra con el asa previamente flameada y fría, inocular la muestra haciendo 4-5 estrías simples muy juntas de lado a lado sobre el primer cuadrante de la caja, cerrar la caja (Figura 4). b) Flamear el asa de inoculación y hacer girar la caja de Petri un cuarto de vuelta. Abrir nuevamente la caja y enfriar el asa de siembra tocando la superficie del medio lejos de la zona de estrías recién hechas. c) Rozar con el asa una vez la superficie del conjunto original de estrías y hacer un segundo grupo de estrías en el segundo cuadrante como en el caso anterior. d) Repetir el procedimiento 4 y 5 en el tercer cuadrante y al efectuar la siembra en el último cuadrante, no se deberá flamear el asa de siembra y se hará una estría más abierta (simple). Siembra en tubos con caldo y agar nutritivo 1. Sembrar un cultivo puro diferente en cada uno de los dos tubos con caldo Nutritivo y en tubos con agar nutritivo inclinado. 2. Sembrar con el asa extendida los mismos cultivos puros en otros dos tubos con agar nutritivo solidificado en forma recta (Figura 5). . DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    •o o I cu a 0) Figura 4. Aislamiento de bacterias por estría cruzada en placa (a) (b) Figura 5. Siembra de medios con agar por estría simple (a) en tubos inclinados y por picadura (b) en tubos solidificados en forma recta. Siembra de cajas de Petri con medios diferenciales y selectivos 1. Dividir en tres partes, una caja de Petri con EMB Agar, otra con Agar 110 y una de MM. Sembrar en cada parte un cultivo puro diferente por estría simple. 2. En otra serie de tres cajas con cada uno de los medios antes descritos, sembrar por estría cruzada la muestra problema. 39 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Condiciones de incubación 1. Incubar las cajas en forma invertida a 35°C durante 24 horas. De las cajas inoculadas por estría cruzada, seleccionar la colonia más aislada (generalmente del cuarto cuadrante). Transferir una pequeña muestra de esta colonia a tubos inclinados con agar nutritivo. 2. Incubar los tubos a 35°C durante 24-48 horas. Observar la aparición de colonias y reportar la forma en que se distribuyen a lo largo del tubo. Resultados A. Recopilar la información de la caracterización colonial de cada cepa en los cuadros 4 y 5. ce 0 B. De acuerdo a sus observaciones identifique las especies presentes en la muestra problema. 40 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Cuadro 4 Morfología colonial de cultivos bacterianos Escherichla col i Streptococcus sp MUESTRA PROBLEMA Aislamiento por Estría cruzada Forma: o Color: Tamaño (mm): (0 Borde-. a Superficie: •o Aspecto: Elevación: Luz transmitida: Luz reflejada: Consistencia: MEDKDEMB MEDÍ 0 1 1 0 MEDIO fMÍNIMO Siembra en medios (íj selectivos y diferenciales: Microorganismo 1: Forma: Color: Tamaño (mm): Elevación: Luz transmitida: Luz reflejada: Consistencia: Nota: La descripción colonial puede hacerse considerando los siguientes criterios Forma: circular, irregular, filamentosa o rizoide Borde: entero, lobulado, aserrado Superficie: lisa o rugosa Aspecto de la colonia: húmeda, seca, butirosa Elevación: convexa, plana, hundida Luz transmitida: translúcida, opaca Luz reflejada: brillante, mate Consistencia: dura, blanda, mucoide 41 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Cuadro 5 Descripción morfológica de cultivos puros en tubos de cultivo Tubos inclinados de w y w w Agar Nutritivo Crecimiento: arborescente, filiforme, rizoide, disperso, puntiforme Color: ultivo en tubo de Caldo Nutritivo Crecimiento: superficie como película, como sedi- mento, turbidez en todo el tubo Color: r~ Tubos rectos de Agar Nutritivo Crecimiento: en forma de película superficial, a lo largo de la picadura, solo en el fondo Color: i - DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Cuestionario O 1. ¿Que es el agar y de donde se obtiene? ¿Cuáles son los nutrimentos que proporciona a los microorganismos? | o II 2. ¿Cuál es la composición química de los medios EMB, 110 y MM? ¿Cuáles son los componentes o propiedades responsables de su función como medios selectivos o diferencíales? 3. ¿Porque el agar nutritivo es un medio de uso general para el cultivo de bacterias? Proponga algunas sustan- cias que se le agregarían para hacerlo selectivo para bacterias Gram negativas? 4. ¿Cuál es la información que se obtiene de las siembras de cultivos barterianos en tubos con agar inclinado y en tubos con agar solidificado en forma recta? 5. Bibliografía consultada manual de prácticas del LABORATORIO PE MlCRClBiCiLClGJA GEliERAL _k DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Referencias bibliográficas • Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Prácticas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México. • Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition). Edited by Francés Pouch Downes and Keith Ito, 200. • Practical Handbook of Microbiólogo CRC Press, 1989. William M O'Leary, Cornell Medical College, New York, New York, USA. • Bergey's Manual of Determinative Barteriology. 9th edition, The Williams and Wiikins Co., Baltimore, USA. • Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Associated (APHA), American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. Ed. (1991). DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Métodos de cultivoy descripción morfológica de hongos DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    DERECHOS RESERVADOS ©2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Objetivos introducción Que el alumno aprenda las técnicas Los hongos son organismos eucarióticos y de mayor tamaño que las bac- de cultivo y manipulación de diferen- terias, se distinguen de otros eucariotes como los animales por ser inmó- tes tipos de hongos. Que el estudian- viles y de las algas y plantas por carecer de pigmentos fotosintéticos. te conozca las principales caracterís- ticas morfológicas (macroscópica y Son de nutrición heterótrofa, es decir dependen de nutrientes orgánicos microscópicas) de los hongos. que son solubilizados por sistemas enzimáticos específicos y son 5 absorbidos a través de su pared celular y membrana plasmática. Estos organismos pueden ser unicelulares (levaduras) o multice- lulares (filamentosos), sin embargo, también existen hongos (0 dimórficos principalmente patógenos que se presentan en las dos £ formas alternativamente, dependiendo de condiciones ambienta- o a les como la temperatura. "O Las levaduras son células de forma esférica u oval, ampliamente distribui- das en la naturaleza; frecuentemente se encuentran formando una cubierta polvosa fina sobre frutos y hojas. Las levaduras se reprodu- cen asexualmente por gemación, un proceso por el cuál brota una protuberancia o yema de la célula madre que posteriormente se separa como célula individual. El cuerpo o estructura vegetativa característica de los hongos filamentosos (mohos) se denomina talo, generalmente constituido de hifas ramificadas que forman el micelio. Las hifas de algunos hongos presentan tabiques transversales o septos, aunque en el caso de los Zygomycetes las hifas no presentan estos septos y se les conoce como hifas cenocíticas. El principal mecanismo de reproducción de los hongos es asexual, por fragmentación de hifas vegetativas o por la producción de abun- dantes esporas en conidióforos y esporangióforos formados en hifas aéreas llamadas hifas reproductivas. Sin embargo, la descripción de las estructuras de reproducción sexual es el principal criterio de clasificación, por el que pueden ser ubicados en tres subdivisiones o phylum: Zygomycota, Ascomycota y Basidiomycota. Se estima que puede haber 1.5 millones de especies de hongos, de las cuáles se han descrito más de 250 000 y de éstas solo se conocen 150 especies patógenas para el hombre y otras tantas para plantas y animales. Es de gran importancia conocerlos, por los beneficios que proporcionan al hombre, ya que como se mencionó la mayoría son saprobios (utilizan materia orgánica muerta), por lo que tienen una gran capacidad de reciclar materiales orgánicos de diferentes tipos, de tal forma que se pueden utilizar como agentes de biodegradación de compuestos recalcitrantes en procesos de biorremediación. 47 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Desde la antigüedad,estos microorganismos se han utilizado en procesos de producción de diferentes alimentos como: vino, cerveza, pan y queso entre otros. También se ha reportado que en la naturaleza hay diversas especies que funcionan como importantes agentes de control biológico de insectos (bioinsecticidas) y que pueden mejorar la nutrición y permanencia de la mayoría de las plantas (micorrizas). Materiales 4 Cajas de Petri con 25 mL de PDA (Anexo 2.6 ) 4 Cajas de Petri con 25 mL de medio Czapek-Dox (Anexo 2.8) 3 Tubos de cultivo inclinados con 7 mL de PDA 2 matraces Erlenmeyer de 250 mL m 1 Probeta de 100 mL 0 1 Vaso de precipitados de 100 mL 1 Mechero Fisher 5 Portaobjetos y cubreobjetos 1 Aguja de disección 1 Asa de siembra Cinta adhesiva transparente Microscopio óptico de campo claro Aceite de inmersión Autoclave Incubadora a 30 °C Azul de lactofenol (Anexo 1.1 ) Procedimiento El profesor proporcionará a los alumnos tubos de cultivo con Aspergillus niger, PenicHHum chrysogenum, Rhizopus oliQosporus, Trlchoderma viridey de la levadura Saccharomycescerevislae. El estudiante inoculará cada una de las cepas en cajas de Petri con dos medios de cultivo: a) Czapek-Dox Agar, a base de sales minerales y sacarosa y b) Papa Dextrosa Agar, que es un medio complejo. Hará la descripción macroscópica de cada especie en los dos medios de cultivo y la observación microscópica la realizará aplicando la técnica de cinta Scotch con azul de lactofenol. Siembra de hongos 1. Para sembrar los hongos filamentosos, se deberá separar una parte de micelio de los tubos de cultivo con aguja de disección, previamente calentada en la flama del mechero y enfriada. 2. Colocar el micelio en el centro de una caja de Petri con PDA y de la misma manera inocular la caja con medio de Czapek-Dox. 3. Las levaduras se inocularán por estría cruzada sobre la superficie de las cajas, en forma similar a la inocula- ción de bacterias. 4. Colocar las cajas envueltas en papel o en bolsa de plástico en forma invertida dentro de una incubadora a 28-30 °C durante 3-5 días. 48 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Descripción macroscópica delevaduras y mohos 1. Hacer la descripción de la forma, tamaño, aspecto, textura y color de las colonias de Saccharomyces cerevisiae. 2. En los cultivos de mohos describir la forma, tamaño y el tipo de colonia, así como las características del micelio (algodonoso, aterciopelado, velloso, aéreo o pegado al medio) el color del micelio, el color de esporas, cambios en el medio de cultivo, etc. Descripción microscópica de levaduras t 1. De las colonias de levaduras preparar un frotis fijado al calor y teñirlo con azul de metileno. i •o 2. Hacer observaciones al microscopio con objetivo de 40X y 100X. Descripción microscópica de mohos en montaje con cinta adhesiva 1. Se corta una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente tomándola únicamente por los extremos. 2. Cerca del mechero se abre la caja y se presiona ligeramente la cinta transparente sobre la periferia de la colonia. 3. Colocar la cinta con la muestra adherida sobre una gota de azul de lactofenol, previamente colocada en el centro de un portaobjetos. La cinta funcionará como cubreobjetos por lo que se deberá aplanar lo mejor posible, evitando la formación de burbujas y sin alterar demasiado las estructuras. 4. Dejar reposar durante 3-5 minutos y hacer las observaciones en el microscopio con los objetivos de 10X y 40X. 5. Localizar en las preparaciones hifas, estructuras especiales como conidióforos, conidias, esporangióforos, esporangios y rizoides. Determine si las hifas presentan septos o no. Resultados A. Reportar sus observaciones en el Cuadro 6. Hacer los dibujos de las observaciones morfológicas de cada uno de los microorganismos y colorearlos. B. Comparar las observaciones realizadas con los esquemas de la Figura 6. C. Investigar en la literatura como se clasifican los hongos estudiados en la práctica. 49 : m a n u a l d e p r á c t i c a s del : -. ,-*: v i . ' > : ; -*Z M ^ ; ; • * * ? ; ; < ; * : y ^ v . ; » , ? --,v.::'-í"<t f * DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    conidias conidias conidióforo 10 ^m 10 im 10 im Aspergillus flavus (O m o porangiosporas Aspergillus niger esporangióforo conidióforos 100 25 Jim conidias O • 10 Rhizopus oligosporus Penicillium roqueforti ® Saccharomyces cerevisiae conidióforos conidias conidióforos conidias OOOOooo 10 ¿un oooooo OOOOOO 10 Trichoderma viride Penicillium chrysogenum Figura 6. Descripción microscópica de estructuras de reproducción asexual de algunas especies de hongos. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Cuadro 6 Descripción morfológica de hongos liliillilltllillliilllliiilliilliii •o Descripción macroscópica o en PDA ;olor y tamaño: Aspecto: i Textura: Descripción microscópica: Aumento total: Micelio con o sin septos Tamaño: Estructuras de reproducción Tamaño: Clasificación (phylum): Descripción macroscópica en medio Czapek-Dox: Color y tamaño: Aspecto: Textura: Descripción microscópica: Aumento total: Micelio con o sin septos Tcmaño: Estructura de reproducción Tamaño: Tipo de esporas Tamaño: 51 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Cuestionario 1. ¿Cuáles son las principales estructuras caraaerísticas de levaduras y mohos? 2. Elaborar un cuadro comparativo de caraaerísticas morfológicas, nutridonales y sensibilidad a antibióticos de hongos y baaerias. Mencione las diferencias que hay entre las esporas de hongos y las endosporas baaerianas. 3. Mencione los criterios de clasificación de hongos filamentosos y levaduras. 4. Describir brevemente tres problemáticas concretas para el hombre causadas por hongos y tres ejemplos de utilización benéfica. 5. Bibliografía consultada Referencias bibliográficas • Hudson B.T. and L Sherwood. 1997. Explorations in Microbiology. Prentice-Hall, New Jersey. USA. • Herrera, T., Ulloa, M. 1990. El Reino de los Hongos. Micología Básica y Aplicada. Fondo de Cultura Económi- ca, UNAM. México. • Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana. México. 52 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    ¿fe* Pruebas de diferenciación bioquímica DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    DERECHOS RESERVADOS ©2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Objetivos introducción Que el alumno realice algunas prue- El metabolismo, es toda la serie de reacciones que ocurren en los bas bioquímicas en medios de cultivo seres vivos. Éstas reacciones incluyen procesos de obtención de ener- con sustratos específicos que permiti- gía como son: la descomposición de moléculas orgánicas en los rán demostrar actividades metabólicas quimiótrofos (catabolismo) o la captación de luz para el caso de los de bacterias y levaduras. Que el estu- fotótrofos, así como de síntesis de material celular a partir de nutrientes diante comprenda la importancia de las escenciales (anabolismo). Todas las reacciones metabólicas, son pruebas bioquímicas para la caracteri- catalizados por enzimas que en su mayoría funcionan dentro de la zación e identificación de estos célula por lo que se conocen como endoenzimas, hay también microorganismos. exoenzimas principalmente hidrolíticas que son liberadas por la célu- la para catalizar reacciones fuera de ésta. t (0 a En el laboratorio, es posible conocer las características metabólicas de los •o microorganismos, inoculándolos en diferentes medios de cultivo, con sustratos que pueden utilizar como fuente de energía, fuente de car- bono y de otros nutrientes escenciales para su crecimiento. La mayoría de microorganismos, utilizan la glucosa como fuente de car- bono y energía. Al entrar a la célula, la glucosa será oxidada en forma incompleta (fermentación) o completa (respiración) depen- diendo de la presencia de oxígeno y de las capacidades enzimáticas de los microorganismos. En la fermentación, los microorganismos obtienen 1-2 ATP/mol de gluco- sa y liberan ácidos orgánicos u otras pequeñas moléculas orgánicas como productos metabólicos; mientras que las bacterias y levadu- ras de catabolismo respiratorio obtienen mayor cantidad (36-38 ATP/ mol de glucosa), CO2 y agua. Algunas especies microbianas pueden ser de tipo respiratorio o fermentativo de acuerdo a las condiciones de oxigenación. Se han propuesto numerosas pruebas bioquímicas en medios de cultivo con indicadores de pH, para detectar la producción de ácido o álca- li; con inhibidores selectivos como bilis, cianuro, colorantes, sulfuros, etc., que facilitan la determinación de diferentes activida- des metabólicas como son: la capacidad para fermentar carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa), catabolizar aminoácidos y urea, la pro- ducción de enzimas específicas de tipo endo o exo como oxidasas, reductasas, amilasas, lipasas, etc. Como se ha observado en las prácticas anteriores, algunas bacterias y levaduras tienen características coloniales y microscópicas muy si- milares, lo que no permite decidir si dos cultivos bacterianos o de levaduras morfológicamente similares pertenecen a una misma especie. Con algunas pruebas bioquímicas es posible su diferen- ciación e incluso su identificación, cuando el número de pruebas es suficientemente amplio. 55 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Materiales 1 Gradilla 1 Parrilla de agitación 1 Probeta de 100 mL. 3 Matraces Erlenmeyer de 250 mL 3 Vasos de precipitados de 250 mL. 1 Mechero 1 Asa de siembra 2 cajas con agar almidón (AA) (Anexo 2.13 ) 2 tubos con campana de Durham y 5 mL de cada uno de fl los siguientes medios: glucosa-rojo de fenol lactosa-rojo 0 de fenol, sacarosa-rojo de fenol y manitol-rojo de fenol (Anexo 2.9 ). 2 tubos con 7 mL de medio SIM (Sulfuro, Indol, Motilidad) (Anexo 2.11) 2 tubos con 7 mL de medio TSI (triple azúcar hierro) solidificados en forma inclinada (Anexo 2.15) 2 tubos con 7 mL medio de citrato de Simmons solidificados en forma inclinada (Anexo 2.10 ) 2 tubos con 7 mL de caldo urea (Anexo 2.11) 2 tubos con 7 mL de leche tornasolada (Anexo 2.14) 2 tubos con 7 mL de agar gelatina solidificados en forma recta (Anexo 2.15 ) 2 tubos con 7 mL de agar nutritivo blando solidificados en forma recta (Anexo 2.17 ). Peróxido de hidrógeno 30 % ácido tricloroacético al 5% (Anexo 1). Procedimiento El profesor proporcionará cultivos puros de Bacillussubtllis, Escherichia col!, Pseudomonas fluorescens, Klebslella sp. y Saccharomyces cerevislae. A cada uno de los equipos, les corresponderá también un cultivo problema. Todos los tubos y cajas deberán etiquetarse e inocularse de acuerdo a las siguientes instrucciones. Técnica de Inoculación en cajas de Petri 1. Dividir en tres secciones por la parte de atrás las cajas con agar-almidón. 2. En una de las cajas inocular por estría simple tres cepas diferentes. 3. En la segunda caja inocular en dos secciones la muestra problema y dejar una sección sin inocular. 4. Incubar las cajas en forma invertida a 35°C durante 24-48 horas. 56 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Técnicas de inoculaciónen tubos 1. Los tubos de glucosa, lactosa, sacarosa y manitol rojo de fenol, caldo urea y leche tornasolada se inocularán mezclando una asada de cada uno de los microorganismos. 2. Los tubos con agar TSI se inocularán por estría simple en la superficie y por picadura hasta el fondo del tubo (Figura 5). 3. Los tubos con gelatina nutritiva y agar nutritivo blando se inocularán por picadura (con el asa recta) 4. Incubar los tubos a 35°C durante 24-48 horas. Evaluación de actividades metabólicas 1. Determinar la actividad de amiiasas en las cajas de agar almidón por el crecimiento y aparición de zonas claras alrededor de las colonias. Si no es posible observarlas a simple vista, agregar unas gotas de lugol a las cajas y observar la aparición de zonas claras sobre el medio que se coloreará de azul como indicativo de prueba (+). Comparar los resultados con la zona de la caja que se dejó sin inocular. 2. En un portaobjetos hacer una suspensión en una gota de agua de las colonias obtenidas en cajas de agar- almidón y agregar unas gotas de peróxido de hidrógeno al 30%. Observar la formación de burbujas que significan una prueba de catalasa (+). 3. Todas las pruebas en tubo deberán interpretarse en comparación con tubos control, que contienen los mismos medios de cultivo pero sin inocular 4. En los tubos de agar gelatina, observar la licuefacción del medio y agregar unas gotas de solución de TCA (ácido tricloroacético) al 5%, observar la aparición de zonas claras o nubosidad en el medio. 5. En los tubos con medios de glucosa, lactosa, sacarosa y manitol rojo de fenol, hacer observaciones a las 24 y 48 horas de incubación. Determinar si hay crecimiento, cambios en el color del indicador y producción de gas en la campana de Durham Resultados A. Reportar los resultados en el Cuadro 7. de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento (-), crece un poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++). Actividad sobre sustratos (+) o negativa (-) B. Investigar los resultados bibliográficos de cada una de las cepas y compararlos con los obtenidos en la práctica C. Investigar las reacciones enzimáticas y de color realizadas para la evaluación de actividades metabólicas D. De acuerdo a sus observaciones proponga el nombre de la especie que corresponde a su microorganismo problema. 57 manual de prácticas del M MI DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Cuadro 7 Resultados de pruebas de diferenciación bioquímica MEDIO DE CULTIVO Escherichla cotí Saccharomyces CULTIVO PROBLEMA cerevislae Agar Almidón Crecimiento: Color del medio con el ugol: Hidrólisis de almidón: Prueba de catalasa: Aparición de burbujas al agregar peróxido de hidrógeno: Reacción de catalasa: Gelatina Nutritiva: Crecimiento: Licuefacción del medio: Formación de nubosidad al agregar TCA al 5%: Hidrólisis de gelatina: Agar Nutritivo Blando: r Crecimiento: superficial, en la parte media, en el fondo: Crecimiento en la picadura Movilidad: 58 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Caldo rojo defenol r r r r r r r r r 9 TI | Gluc 1011011 Lac Sac Man Gluc Lac Sac Man Gluc Lac Sac Man a Crecimiento: Color del medio: Ácido: Gas: Leche tornasolada (Litmus Milk) ÁddO: Álcali: Sin cambio: Reducción: Peptonización: Coagulación: Gas: Caldo Urea Crecimiento: Color: Hidrólisis de urea: 59 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Medio TSI € «i í í Crecimiento: m Cambio de color: o Producción de H2s: Producción de gas: Fermentación del azúcar: Medio de citrato de r Simmons Crecimiento: Cambio de color: Utilización de citrato: Cuestionario 1. ¿Cuáles son las rutas bioquímicas de obtención de energía de las bacterias respiradoras aerobias, las de respiración anaerobia, las fermentadoras, y las anaerobias estrictas?.¿Cuál de éstas es más eficiente? ¿Porque? DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    2. Describa brevemente las actividades enzimáticas que se identificaron en cada uno de los medios de cultivo utilizados en la práctica. ¿Cuál es la reacción bioquímica que cataliza cada una? ¿Cuáles son exoenzimas y cuáles son endoenzimas? ! 0) t ti a o> •o 3. ¿Explique por qué los tubos de fermentación de azúcares deben evaluarse a las 24 y 48 horas? ¿Qué resul- tados se observarían en los tubos en el caso de que un microorganismo metabolizara oxidativamente la glucosa? 4. ¿Explique por qué se busca la presencia de precipitados de sulfuros en el fondo del tubo de TSI y no en la superficie? 5. Bibliografía consultada manual de prácticas del LABORATORIO PE f¥li€il€>B¡€IL0CI¡Á GENERAL DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Referencias bibliográficas • McFaddin, J.F., J Mac Faddin. 2000. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 3rd ed., Lippicont, Williams & Wilkins. • Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition) Edited by Francés Pouch Downes and Keith Ito, 2001 • Practical Handbook of Microbiology. William O'Leary. Cornell Medical College, New York, USA. CRC Press, 1989. • Bergey's Manual of Determinative Bacteriólogo 9th edition, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA. • Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Associated (APHA), American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. Ed. (1991). DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Métodos de cuantificación de microorganismos DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    DERECHOS RESERVADOS ©2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    introducción objetivos Existen diferentes métodos para cuantificar el número o peso (biomasa) Que el alumno conozca algunas de de células microbianas en un cultivo; los métodos pueden ser directos e las técnicas de cuantificación direc- indirectos. Entre los directos se pueden mencionar a la determinación de ta e indirecta de microorganismos peso seco y el recuento de células en cámara de Neubauer. más utilizadas. Que compare las ven- tajas y desventajas de cada una en La determinación de peso seco es un método de cuantificación muy utili- función de la información que se ob- zado en cultivos de gran densidad, sobre todo para hongos y leva- tiene, del tiempo invertido y de los duras. Como los cultivos se someten a varios procesos (filtración, recursos necesarios. lavado, secado) se pueden causar pérdidas importantes de biomasa y errores en la cuantificación. a El método de cuenta direaa en cámara tiene la ventaja de ser muy rápido y •o económico, aun que no se pueden distinguir las células viables y no viables. Se puede calcular el número de microorganismos en una mues- tra a partir del volumen de la cámara y de las diluciones de la muestra que sean necesarias. Sin embargo, tiene el inconveniente de que la observación y cuantificación se dificultan en células muy pequeñas (1- 5/¿m) o en poblaciones de baja densidad debido al pequeño volumen de muestra que se utiliza (0.1-0.2 mm3). Entre los método indirectos, uno de los más utilizados es la medición de laturbidez de los cultivos en un espectrofotómetro, que es relativa- mente rápida y que se basa en la capacidad de las células microbianas de dispersar la luz que incide sobre éstas. Como el tamaño de las células en una población es casi constante, el grado de dispersión es proporcional a la concentración de células pre- sentes pero no se puede diferenciar la turbidez dada por células viables o no viables. La forma de cuantificar células viables más utilizada en Microbiología, es la de hacer diluciones y cuenta en placa con medios de cultivo es- pecíficos para la población de interés. Esta técnica se basa en la suposición de que cada bacteria incluida en un medio de agar o en su superficie se multiplicará y producirá una colonia visible, en con- secuencia el número de colonias que se observarán a simple vista será igual al número de bacterias viables o unidades formadoras de colonias (UFO inoculadas en el agar multiplicadas por la dilución. Esta técnica aplicada en muestras complejas, dará una estimación aproxi- mada del número total de microorganismos, dependiendo del me- dio de cultivo utilizado, ya que no hay un medio y condiciones de incubación que favorezcan el crecimiento de todos los microorganismos. También pueden presentarse problemas relacio- nados con falta de homogeneidad de las diluciones y en la inocula- ción de las muestras, por lo que se pueden obtener bajos valores si es que las células no se separan bien y valores elevados si la toma de las muestras se hacen del fondo del tubo donde se han concen- trado por gravedad los microorganismos. 65 m a n u a l d e p r á c t i c a s del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Materiales 6 cajas de Petri con agar nutritivo (Anexo 2.2 ) 10 Pipetas de 1-2 ml_ estériles 10 Tubos con 9 mL de ssi (solución salina isotónica= 0.89% NaCI) 1 matraz Erlenmeyer de 125 mL con 99 mL de ssi Vasos de precipitados 1 Parrilla de agitación 1 espectrofotómetro w 1 cámara de Neubauer g I pipeta Pasteur Fenol al 2% (Anexo 1.9) 1 Varilla de vidrio doblada en L 1 Microscopio compuesto Safranina (Anexo 1.8) Procedimiento El profesor proporcionará un cultivo de Saccharomyces cerevisiae y Escherichla colL El alumno medirá la turbidez de los cultivos en un espectrofotómetro (Spectronic 20); cuantificarán el número de células totales, por cuenta direaa en cámara de Neubauer y determinará el número de unidades formadoras de colonias (UFO por dilución y siembra en placa. Técnica turbidimétrica 1. Encender el aparato y dejar que el instrumento se caliente por 15 minutos. 2. Ajustar el aparato a la longitud de onda (520 nm) 3. Calibrar el instrumento a 0% de transmitancia con el botón izquierdo. Para leer en la escala, observar la aguja a nivel de los ojos y tomar el dato donde la aguja coincida sobre su reflejo en el espejo. 4. Colocar una celda con medio de cultivo estéril como testigo (sin inocular) y calibrar el instrumento a 100% de transmitancia. 5. Para medir la turbidez de una muestra, vaciarla en otra celda, limpiar perfectamente con papel suave y medir el valor de %T. 6. Calcule la absorbancia de la fórmula A= -log (%T/100) 7. En caso de disponer de un aparato digital ajustar la mediciones a absorbancia (D.O.). 66 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Técnica de cuentadirecta en cámara de Neubauer 1. Se coloca 1 mL de la muestra en un tubo de ensaye. Cuando se trata de cuantificar muestras muy concentra- das (D.O > 1.5) será necesario preparar diluciones de la misma con solución salina isotónica. Agregar 0.5 mL de solución de fenol al 2% y dos gotas de safranina. Mezclar y dejar en reposo durante 5-10 minutos. o 2. Lavar cuidadosamente la cámara de Neubauer sin frotar la zona brillante del centro y el portaobjetos. Secar con papel suave. Colocar el portaobjetos sobre la zona central limitada por dos excavaciones laterales, donde se aprecian una zona cuadriculada a simple vista. I 3. Homogeneizar perfectamente la muestra en un vórtex, tomar inmediatamente una muestra con una pipeta 8. Pasteur de punta fina y depositar una gota entre la cámara y el cubreobjetos por el borde de la cámara. Dejar 4) que la muestra se distribuya por capilaridad, evitando el exceso que dificultará la evaluación precisa de la población microbiana. 4. Dejar reposar durante 5 minutos, colocar la cámara en la platina del microscopio y localizar con el objetivo seco débil (10X) la zona cuadriculada que se muestra en la Figura 7. 5. Localizar el cuadro central grande (C1) que miden 1.0 mm por lado, que se encuentra dividido en 5X5 cuadros pequeños (C2) limitados por triple línea que miden 0.2mm por lado. Estos cuadros pequeños a su vez se encuentran divididos en 16 cuadros mas pequeños (C3) de 0.05 mm de lado. 6. Hacer la cuantificación de células con el objetivo seco fuerte (40X), contando el número de células que se localicen en el cuadro C1, los cuadros de menor tamaño C2 sirven de guía para el cómputo. Se empieza a contar desde la parte superior de los cuadros C2 y se continúa hasta la base. Si las células tocan los límites de los cuadros C2; deberán contarse solamente aquellas que toquen la parte superior y el lado derecho del cuadro. Si las células tocan la parte inferior o el lado derecho no se cuentan. Este método reduce las posibilidades de contar la misma célula dos veces. 7. Cuente hasta cerca de 200 a 250 células antes de determinar el número de células por mL En el proceso de contar se pueden presentar tres situaciones diferentes que a continuación se explican: a. Si hay de 200 a 250 células por cuadro grande (C1), multiplicar directamente X 104 para reportar el número de células por mL. b- Con menos de 200 células por cuadro grande (C1), será necesario contar algunos de los cuadros de las esquinas (miden 1x1 mm de lado y divididos en 4X4). De esta manera se cuantificarán más de 200 células. Después dividir el número total de células entre el número de cuadros empleados y sacar el valor promedio por cuadro grande. Después multiplicar este valor por X 104 para reportar el número de células por mL. c. En el caso de que se observen más de 200 células por cuadro grande (C1), se deberán contar las células de los cuadros de menor tamaño (C2) hasta contar cerca de 200 células. Dividir este valor entre el número de cuadros usados para la cuenta para sacar el valor promedio por cuadro C2. Multiplicar este valor promedio por 25 para obtener el número de células aproximado en un cuadro grande (C1) y después multiplicar X104 para reportar el número de células por mL. 67 manual d eprácticas del ' ' - -.*;.:* " < < rr ><-. Í ' ^ ' V . '«/«;«: *C --'. - '*:. -•'•«' :' **< . DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    8. El factor de 104 por el cuál se debe multiplicar el número de células por cuadro grande (C1) es porque este cuadrado contiene un volumen de 0.1 mm 3 (mide 1mm por lado y la cámara tiene una profundidad de 0.1 mm). # células/cuadro C1 (25cuadros C2) = # células/ 0.1 mm 3 X 104 = # células/mL 9. En el caso de que el # de células sea muy grande, la suspensión deberá diluirse y se hará la corrección como sigue: # células/mL en la muestra diluida X (factor de dilución) = # células/ mL en la suspensión original. (O CQ 1 mm ü — 1 mm 1 m m 1 mnri 0.2 mrri ::::::::i:E2 Cuadro 2 (40X) Cuadro 1 (10X) Figura 7. Cuenta en cámara de Neubauer Técnica de dilución y siembra en placa 1. Hacer diluciones decimales del cultivo de 105 hasta 10"9 en condiciones estériles (Figura 8). Se colocarán en cajas de Petri con agar nutritivo por duplicado 0.1 mL de las últimas tres diluciones. 2. Distribuir cuidadosamente el inoculo en toda la caja con ayuda de una varilla de vidrio doblada en "L" previamente esterilizada a la flama del mechero y enfriada. 3. Dejar absorber el líquido durante 10 minutos 4. Incubar las cajas en forma invertida a 35°C durante 24-48 horas para bacterias y levaduras y de 5-7 días para hongos filamentosos. 5. Hacer la cuenta de las colonias de las placas, seleccionando la dilución donde el número de colonias sea entre 30 y 300. 68 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    6. Si la inoculación fue por duplicado o triplicado, se calcula el número promedio de colonias por dilución y este número se multiplicará por el inverso de la dilución XI0 (por ajuste de volumen inoculado) para obte- ner la número total de unidades formadoras de colonias (UFC)/mL en la muestra original. 1 mL 1 mL 0) 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL £ (6 a •o Cultivo bacteriano 10-3 io- 4 io- 5 io- 6 io- 7 O.lmL XO.lmL Figura 8. Técnica de dilución y cuenta en placa Resultados A. Reportar los resultados de cuantificación de los cultivos, aplicando las técnicas descritas. Indicar los cálcu- los hechos para cada metodología. B. Recopilar sus resultados en el Cuadro 8 incluyendo los de los otros equipos, indicando la muestra analizada por cada equipo. Discutir en cada caso cuáles fueron las ventajas y desventajas de las metodologías de cuantificación. 69 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Cuadro 8 Cuantificación de microorganismos por técnicas directas e indirectas MICROORGANISMO Turbidez (D.O.) Cuenta en cámara de Neubauer Cuenta viable en placa (# células totales/mL) (# UFC/mL) Escherichia colí (0 a o Saccharomyces cerevisiae Cuestionario 1. Compare el método de dilución en placa con el método de cuenta direaa en cámara de Neubauer para la cuantificación de microorganismos. ¿En que casos conviene usar cada uno? 2. Explique cuáles son las ventajas y desventajas del método turbidimétrico de cuantificación de células. 70 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    3. Mencione dos aplicaciones concretas en las que se utilicen cada una de las técnicas de cuantificación realizadas. 1 (0 £ ti a •o 4. Algunos autores sugieren la medición de actividad biológica y la determinación de constituyentes celulares para la cuantificación de poblaciones microbianas. Comente sus ventajas y desventajas. 5. Bibliografía consultada 71 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Referencias bibliográficas Wistreich, G.A. and M.D. Lechtman. 1983. Prácticas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México. • Johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings Publishing Company, Inc. USA. • Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. 1998. Brock Biología de los Microorganismos. Octava Edición. Prentice Hall. España. cú ü • Prescott L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana. México. 72 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    I " O» ai* Efeao del pH y la temperatura en el crecimiento microbiano DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Objetivos introducción Que el estudiante conozca el efecto Los microorganismos están continuamente afectados por su ambiente, ya del pH y la temperatura como paráme- que éste ejerce una influencia profunda en su desarrollo al igual que tros de control del crecimiento micro- sobre las demás formas de vida. Los factores del medio se pueden clasi- biano. Que el alumno comprenda la ficar en tres grupos: importancia de estos factores físico- químicos en la selección de pobla- a).- Físicos.- temperatura, presiones externas, humedad. ciones microbianas en los diferentes 0) ambientes en que se encuentran y b).- Químicos.- pH, disponibilidad de nutrimentos, presencia de produc- (6 los mecanismos de adaptación a ni- tos tóxicos. t vel celular y metabólicos que han ti a desarrollado. c).- Biológicos.- las interacciones microbianas entre las especies 0) "O coexistentes. Algunos microorganismos están especialmente adaptados a los habitat extremos, donde otros no pueden sobrevivir y que incluso tienen propiedades fisiológicas que restringen su crecimiento a tales si- tios. En otros habitat menos rigurosos, las fuentes de nutrimentos y las interacciones entre poblaciones adquieren mayor importancia en la selección de las poblaciones que se encontrarán. Los factores ambientales que se controlan en condiciones de laboratorio con mayor frecuencia, además de los nutrimentales son los fisicoquímicos como: la temperatura y pH. Todos los organismos tienen una temperatura óptima de crecimiento que los caracteriza; en la cual muestran las tasas más elevadas de creci- miento. También hay límites de temperatura, la temperatura míni- ma en las que son metabólicamente inactivos y una temperatura arriba de la cuál el crecimiento ya no es posible llamada tempera- tura máxima. De acuerdo a su temperatura óptima de crecimiento, los microorganismos se dividen en psicrófilos (<0°C-20°C), mesófilos (20-40°C), termófilos (40-80°C) e hipertermófilos (80-110°C). La mayoría de hiper- termófilos son arqueas como Methanococcus ¡Qneus. Las diferen- cias entre la temperatura óptima de crecimiento y los intervalos de temperatura entre los cuales es posible el crecimiento de bacterias y arqueas determinan la separación espacial en la naturaleza de estos dominios de microorganismos. La concentración de iones hidrógeno del medio afecta directamente a los microorganismos y enzimas, e influye también en la disocia- ción y solubilidad de moléculas que requieren. Sin embargo, algu- nos microorganismos se han adaptado a diferentes condiciones de acidez o alcalinidad, como Sulfolobusy Thiobacillus que crecen a pH tan ácido como 1 - 2 oxidando minerales de sulfuro para produ- cir ácido sulfúrico y son llamado acidófilos. 75 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Otros microorganismos sedesarrollan en los habitat naturalmente alcalinos como lagos salados y desiertos don- de los valores de pH 10 son comunes, estos alcalófilos incluyen especies de Rhizoblum, Bacillusy algunas bacterias entéricas y cianobacterias. En general los hongos son más tolerantes a la acidez que las bacterias. Cada microorganismo tiene un rango de temperatura y pH en el cual pueden crecer, de tal manera que al modificarse estos factores se pueden alterar la velocidad de crecimiento y causar la muerte de lo mismos, por lo que se pueden utilizar como factores de control del crecimiento microbiano. Materiales 2 Cajas d e Petri con m e d i o d e Papa Dextrosa Agar (Anexo 2.6) ajustado a p H 7.0 fió 2 Cajas d e Petri con m e d i o d e Papa Dextrosa Agar ajusta- 0 do a pH 5.0 2 Cajas de Petri con medio de Papa Dextrosa Agar ajusta- do a pH 9.0 22 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación (Bioxon) ajus- tado a pH 7.0 sin amortiguar (Anexo 2.19) 4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación ajustado a pH 5.0 sin amortiguar 4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación ajustado a pH 9.0 sin amortiguador 4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación ajustado a pH 7.0 con amortiguador (Anexos 1.1, 2.19) 4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación ajustado a pH 5.0 con amortiguador 4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación ajustado a pH 9.0 con amortiguador 1 Asa de inoculación 3 pipetas de 1.0 mL. estériles 1 mechero Fisher Espectrofotómetro Microscopio estereoscópico Soluciones amortiguadoras de pH 4, 7 y 10 Procedimiento El profesor proporcionará cultivos líquidos de: Escheñchia coli, Pseudomonas fluorescensy Lactobacii/ussp., una suspensión de esporas de Aspergillus nigery Penicillium roqueforti. Cada uno de los tubos y cajas deberán etiquetarse con el nombre del microorganismo que se inoculará. Efecto de la Temperatura 1. En tres cajas de Petri con PDA divididas en dos secciones, inocular 0.1 mL. de la suspensión de esporas de hongos en cada sección. 2. Incubar una caja de Petri a 15°C, otra a 30°C y la última a 45°C en forma invertida durante 72 horas y hacer las observaciones macroscópicas. 76 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    3. Incubar nuevamente las cajas y realizar observaciones en microscopio estereoscópico después de una semana. 4. En seis tubos de caldo microinoculación ajustado a pH 7.0, inocular dos con cada una de las cepas bacterianas. 5. Incubar dos tubos en estufa a 15°C, otros dos a 30°C y los dos últimos a 45°C durante 24-48 horas. Medir la D.O. Efecto del pH 1. Preparar tres series de cuatro tubos de caldo de microinoculación ajustados a 3 diferentes valores de pH (5.0, 7.0 y 9.0) con solución de HC11.0 M o NaOH 1.0 M. i 2. Preparar otra serie de cuatro tubos ajustados a los mismos valores de pH del punto anterior pero utilizando a soluciones amortiguadoras tal como se indica en la Tabla del Anexo 1.10. •o 3. Inocular 0.1 ml_. de cada una de las cepas bacterianas en la serie de seis tubos de caldo microinoculación ajustados a diferentes pH con amortiguador y sin amortiguador, dejando uno sin inocular como testigo. 4. Incubar los tubos a 35 °C durante 24-48 horas y medir la D.O. 5. Inocular tres cajas de Petri con medio PDA ajustado a tres pH diferentes con cada una de las cepas de hongos. 6. Incubar las cajas de Petri a 30 °C durante 72-96 horas y hacer observaciones macroscópicas. 7. Después de una semana observar las cajas en microscopio estereoscópico. Resultados A. Reportar los resultados en los cuadros 8, 9 y 10 de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento (-), crece un poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++). B. Comparar sus resultados con los reportados en la bibliografía de cada una de las cepas. 77 m a n u a l d e p r á c t i c a s d e l . v> - v<; -: 1 ; ^ > 1 ^ ' ! ' ' S ^ ' n u ' , : ^ ; : < ? ' •'::;.^':,''iv>. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Cuadro 9 Efecto de la temperatura de cultivo en el crecimiento microbiano TEMPERATURA PAPA DEXTROSA AGAR 15°C 30°C 45°C Aspergí I Ius níger Morfología de la colonia a las 72 horas Morfología microscópica a la semana a o Penidllium roquefortí Morfología de la colonia a las 72 horas Morfología microscópica a la semana CALDO . MICROINOCULACIÓN Escherlchla col i Crecimiento a las 24-48 horas Absorbancia (D.O.) Pseudomonas fluorescens Crecimiento a las 24-48 horas Absorbancia (D.O.) A Lactobadllus sp. r Crecimiento a las 24-48 horas Absorbancia (D.O.) 78 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Cuadro 10 Efecto del pH de cultivo en el crecimiento microbiano PAPA DEXTROSA AGAR lili ¡1 11 Aspergí/fus n/ger Morfología de la colonia a las 72 horas I Morfología microscópica a la semana Iff Penidlllum roquefortl Morfología de la colonia a las 72 horas Morfología microscópica a la semana Con amortiguador Sin amortiguador CAtDO . PH5.0 PH7.0 PH9.0 PH5.0 PH7.0 PH9.0 MICROINOCULACIÓN Escherichia col! Crecimiento a las 24-48 horas Absorbanda(D.O.; Pseudomonas r r fíuorescens Crecimiento a las 24-48 horas Absorbancia(D.O.) Lactobadllus sp. i Crecimiento a las 24-48 horas Absorbanda(D.O.) 79 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Cuestionario 1. ¿Cuáles son las temperaturas cardinales y como se clasifican los microorganismos de acuerdo a su tempera- tura óptima de crecimiento? (0 ffl 2. ¿Como influyó el pH en el crecimiento de hongos y baaerias? ¿Que diferencias se observaron en los medios de cultivo amortiguados y sin amortiguar? 3. Explique brevemente cuáles son los mecanismos celulares que los microorganismos termófilos extremos y psicrófilos han desarrollado para adaptarse a condiciones extremas de temperatura y pH. 4. Explique cuál es la relación que existe entre condiciones óptimas de crecimiento en el laboratorio y las condiciones del habitat de origen de las poblaciones microbianas. 5. Bibliografía consultada Referencias bibliográficas •Harrigan, W.F. Laboratory Methods in Food Microbiology. 1998. Academic Press. 3a. Edition. • Jay, J.M.1994. Microbiología Moderna de los Alimentos. Tercera Edición. Editorial Acribia, Zaragoza, España. • Holt, J. C , N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative Bacteriólogo 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA. 80 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Efecto de laactividad de agua en el crecimiento microbiano DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    DERECHOS RESERVADOS ©2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Objetivos introducción Que el estudiante conozca las res- El agua líquida es esencial para todos los procesos bioquímicos. Para los puestas de crecimiento de diferen- microorganismos, un factor crítico es la disponibilidad de agua líquida tes cultivos microbianos, frente al más que la cantidad total de agua presente en el ambiente. El total de estrés osmótico causado por la adi- agua realmente disponible para uso microbiano se expresa como la acti- ción de azúcares, la adición de NaCI vidad de agua (aw). y la desecación. Que el alumno com- prenda el efecto de estos factores Los efectos de las altas concentraciones de solutos sobre los microorga- sobre la actividad de agua y los me- nismos pueden deberse a los solutos mismos o a los efectos del canismos de adaptación que han de- soluto sobre la aw. Cada vez que se disuelven sustancias en el agua sarrollado los microorganismos. pura se disminuye la cantidad de agua disponible o agua libre. La actividad de agua en términos termodinámicos proporciona una medida de agua libre y es definida por la ecuación a- Po nt +n2 Donde P- la presión de vapor de la solución y Po es la presión de vapor del agua pura, n1 y n2 son el número de moles de soluto y solvente respectivamente. Así, si la concentración de soluto aumenta la aw disminuye, para agua pura la aw es igual a 1.0. La mayoría de microorganismos solo toleran pequeños disminuciones en la aw y al igual que con otros factores ambientales, hay notables excepciones de microorganismos que toleran o incluso requieren actividades de agua reducidas como: las bacterias halofílicas, hon- gos xerofíticos y las levaduras osmófilas. Las bacterias halófilas que viven en ambientes salinos son las que mejor toleran la disminu- ción de la aw independientemente del soluto utilizado para reducir- la, mientras que en las otras la tolerancia varía en función del soluto que se utiliza para disminuirla. Estas propiedades de disminución de la aw en soluciones es la base de algunos sistemas de conservación de alimentos, por ejemplo: el salado del pescado o en la adición de elevadas concentraciones de azúcares en mermeladas. manual de prácticas del tjmcmKtomo PE f¥t¡Clt€IB¡0L€lGÍA SEüEff AL . DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Materiales 1 asa de inoculación 1 Espectrofotómetro 3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 10% de sacarosa (p/v) 3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 30% sacarosa 3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 60% de sacarosa 3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 1 % NaCI (p/v) 3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 5 % NaCI 3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 10 % de NaCI 6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 10% sacarosa 6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 30% sacarosa S 6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 60% de sacarosa 6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 1 % NaCI 6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 5 % NaCI 6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 10 % NaCI 36 tubos de ensayo vacíos y estériles 5 pipetas de 1mL estériles Procedimiento El profesor proporcionará cultivos líquidos de bacterias: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseuc/omonas sp. y hongos: Saccharomyces rouxii, Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum. En series de tres cajas de Petri y 6 tubos de cada medio se inocularán por equipo tres de los microorganismos. Efecto de la presión osmótica y actividad de agua (aw) en hongos y bacterias 1. Inocular en el centro de las cajas de Petri, con una gota de cada una de las cepas de hongos. 2. Inocular con 0.1 mL de cultivo de dos de las cepas de bacterias en dos tubos de ensaye con 7mL de cada uno de los medios. 3. Incubar las cajas en forma invertida a 30°C y los tubos de caldo a 35°C durante 48 horas y hacer las observa- ciones. Incubar nuevamente y a la semana realizar observaciones de la morfología de los cultivos en cajas y en tubos medir la turbidez de los cultivos en caldo nutritivo a las 24-48 horas. Efecto de la desecación 1. En series de seis tubos de ensayo vacíos y estériles, con una pipeta estéril, colocar una gota de una suspen- sión de cada uno de los siguientes cultivos bacterianos: Bacillus subtilis, Escherichia co/iy en un tercer tubo una gota de una suspensión de esporas de Aspergillus niger 2. Cerrar los tubos y dejarlos a la temperatura ambiente durante una semana 3. En dos tubos de cada cultivo agregar 3 mL de caldo nutritivo estéril. 84 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    4. Incubar los tubos a 35 °C durante 24-48 horas. 5. Observar si hay crecimiento o no. 6. Repetir la instrucciones de los puntos 3-5, después de dos y tres semanas en los tubos restantes. Resultados A. Reportar los resultados en los Cuadros 11-13. de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento (-), crece un poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++). B. Medir la absorbancia de los tubos de cultivo en un espectrofotómetro. a o C. Investigar los resultados bibliográficos de cada una de las cepas y compararlos con los obtenidos en la •o práctica Cuadro 11 Efecto de la presión osmótica y aaividad de agua en el crecimiento de baaerias 0.990) = 0.970) 0.940) Sacarosa NaC11% Sacarosa Nací 5% Sacarosa NaCI 10% CEPA 10% 30% 60% Staphylococcus sp. A A r A Crecimiento a las 24 horas Densidad óptica: Escherichia coli r A Crecimiento a las 24 horas Densidad óptica: Baclllus subtílis A r Crecimiento a las 24 horas Densidad óptica: 85 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Cuadro 12 Efecto de la presión osmótica y actividad de agua en el crecimientos de hongos (aw = 0.990) ( ^ = 0.970) ( ^ = 0.940) Sacarosa Nací 1 % Sacarosa Nací 5% Sacarosa CEPA NaC110% 10% 30% 60% Sacharomyces rouxll Morfología de la colonia m o a las 72 horas: Morfología de la colonia después de una semana: AspergíIIus nlger Morfología de la colonia a las 72 horas: Morfología de la colonia después de una semana: Penlcllllum chrysogenum Morfología de la colonia a las 72 horas: Morfología de la colonia después de una semana: 86 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Cuadro 13 Efeao de la desecación en la recuperación de cepas microbianas de bacterias y hongos SEMANA 1 .1 > * * ! / • • • : i.;. 1 Escheríchla col! r /-> <J KJ 0) I Crecimiento: superficial, I depósito: Absorbanda (D.O.): Badilus subtilis r r r /^ <J J Crecimiento: superficial, depósito: Absorbanda (D.O.): AspergíIIus nlger r r r r r <J U Crecimiento: superficial depósito: Absorbanda (D.O.): Cuestionarlo 1. Definir brevemente los términos: osmófilo, halófilo, xerófito. manual de prácticas del LABOItJITOlIlCI OE ¡VfiCHOBiOLd&iA DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    2. ¿Cuáles son las hipótesis que tratan de explicar la osmofilia y la halofilia de poblaciones microbianas? 3. Explique ¿cuál es la importancia de controlar la artividad de agua en procesos de conservación de alimen- tos? ¿Que es la plasmoptisis? ¿Que es la plasmólisis? 0) o 4. ¿Que relación hay entre la aw y la humedad relativa ? 5. ¿Como se explica la mayor tolerancia de los hongos a valores de aw reducidos que en bacterias? 6. Bibliografía consultada Referencias bibliográficas • Johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings Publishing Company, Inc. USA. • Wistreich, G.A. and M.D. Lechtman. 1983. Prácticas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México. • Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. 1998. Brock Biología de los Microorganismos. Octava Edición. Prentice Hall. España. • Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana. México. 88 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    1O O O ^ Curva de crecimiento bacteriano DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    DERECHOS RESERVADOS ©2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    ú Objetivos introducción Que el estudiante conozca las fases El crecimiento y la viabilidad de los microorganismos está determinada de una curva de crecimiento en un por factores nutricionales y ambientales, y en condiciones de laboratorio cultivo en lote de Escherichla colL óptimas, es posible predecir una curva de crecimiento característica de Que el alumno aprenda a calcular cada especie microbiana. parámetros cinéticos (/*, td) caracte- •o rísticos de las especies bacterianas. Cuando una bacteria es inoculada a un medio de cultivo líquido fresco, experimentará un periodo de adaptación al medio y condiciones de cultivo y posteriormente se dividirá en forma exponencial, dan- do lugar a una curva de tipo sigmoidal que se acostumbra dividir ti en 4 partes: t es a o •o 3 o u B Oí 3 tiempo A) fase de retardo, de adaptación o fase lag, B) fase de crecimiento exponencial o fase log, C) fase estacionaria y D) fase de declina- ción o muerte. La forma de cada porción de la curva y el tiempo de duración de cada fase dependerá de: la especie de microorganis- mo, la preparación del inoculo, la composición química del medio de cultivo y las condiciones ambientales de incubación. Durante la fase de adaptación no hay división celular, la célula está sinte- tizando nuevos componentes, durante la fase exponencial los microorganismos que se dividen por fisión binaria lo hacen a inter- valos regulares, finalmente el crecimiento de la población dismi- nuye y la curva se vuelve horizontal debido al agotamiento de nutrimentos o la acumulación de productos residuales tóxicos has- ta que la población disminuye. En general las bacterias crecen con mayor rapidez que los microorganismos eucarióticos y los eucarióticos pequeños se desa- rrolla más rápidamente que los grandes. El metabolismo energético también influye sobre la velocidad de creci- miento, debido a la ganancia energética que se obtiene de cada vía 91 manual de prácticas del I O£ DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    catabólica de obtenciónde energía. Así, los microorganismos fermentadores crecerán mas lentamente que los respiradores. Materiales 1 Matraz Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio líquido (Anexo 2.18) 2 Matraces Erlenmeyer de 125 mL con 99 mL de solución salina isotónica estéril 6 Pipetas de 10 mL estériles 16 Pipetas de 1 mL estériles 1 Potenciómetro 1 Mechero Fisher 1 Espectrofotómetro y celdas 1 Gradilla 16 Tubos con 9 mi de solución salina isotónica estéril 1 Varilla doblada en "L" 12 Cajas de Petri con Agar Nutritivo (Anexo 2.2) Procedimiento El profesor inoculará Escherichia co/fen un matraz Erlenmeyer con medio líquido complejo 12 horas antes de iniciar la práctica, que se utilizará como inoculo para los cultivos en matraces Erlenmeyer con diferente concen- tración de glucosa. Los estudiantes cuantificarán el crecimiento periódicamente durante 6 horas de incubación. Se aplicarán los méto- dos turbidimétrico y el de diluciones y siembra en placa (práctica* 7) para cuantificar el crecimiento bacteriano. Inoculación e incubación del cultivo 1. Inocular en condiciones estériles un matraz Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio de cultivo complejo con 10 mL de un cultivo de Escherichia coli 2. Homogeneizar cuidadosamente agitando el matraz e inmediatamente tomar una muestra de 5 mL con una pipeta estéril y vaciarla en una celda del espectrofotómetro. Esta muestra corresponderá al tiempo cero (t=0). De la misma manera se tomarán muestras a las 0.5, 1, 2, 3 y 4 horas. Para el tiempo de 6 horas de incubación se tomarán 6 mL 3. Colocar el cultivo en incubadora con agitación (150 rpm) a 35°C Tratamiento de las muestras 1. Determinar la turbidez de las muestras en un espectrofotómetro a 560 nm. Leer el valor de la densidad óptica (Figura 9). 92 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    2. En la muestra de 6 horas además de evaluar la turbidez, se deberá poner 1 mL del cultivo en un matraz Erlenmeyer con 99 mL de solución salina isotónica (ssi) estéril. Del matraz con la muestra diluida, hacer una serie de diluciones en tubos con 9 mL de ssi estéril, hasta 108. Cuidando de homogeneizar las muestras cada vez que se haga una nueva dilución. 3. Enseguida inocular 0.1 mL de las últimas tres diluciones en dos cajas de Petri con agar nutritivo y distribuir la muestra con una varilla de vidrio doblada en "L". 4. Dejar que se absorba el líquido en las cajas y posteriormente incubarlas en forma invertida durante 24-48 horas. 5. Cuantificar el número de UFC/mL de Escherichia colL t (0 a o •o 10 mL 055 (5) (6) Figura 9. Tratamiento de muestras para medición del crecimiento microbiano y elaboración de una curva de crecimiento. 93 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Resultados A. Se registran los resultados de cuantificación del crecimiento de Escherichla co/ien el Cuadro 14. B. El alumno reportará también en forma gráfica la relación entre dos variables, la variable independiente siempre será el tiempo que se colocará en el eje X, para cada concentración de glucosa a. Una gráfica de D.O. contra el tiempo b. En la gráfica a) identificar las fases de crecimiento y duración c. Determinar la tasa de crecimiento promedio (k) de la fórmula k=( log N- log No)/ log 2 (t), donde No=# de UFC al tiempo "0" y N = # de UFC al final del experimento ü d. Calcular la tasa de crecimiento especifica ( JU ) de la fórmula fi = In2 (k) con este valor determinar el tiempo de generación de Escherichia co/í con la relación td= In2/fi Cuadro 14 Resultados de mediciones del crecimiento de Escherichia coll en un cultivo por lote con diferentes concentraciones de glucosa Tiempo de muestreo (h) Turbidez (D.O.) UFC/mL 0 0.5 1 2 3 4 6 94 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Cuestionario 1. ¿Cómo se define el crecimiento en Microbiología y cuáles son los eventos a nivel celular que ocurren en cada una de las etapas de crecimiento? ! a 2. ¿Qué condiciones ambientales y nutrimentales causarán una disminución o eliminación de la fase lag en la curva de crecimiento. ¿Que condiciones la incrementaría? 3. ¿Cómo se define el tiempo de duplicación? ¿Cómo se relaciona con la tasa de crecimiento específica 4. Bibliografía consultada 95 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Referencias bibliográficas • Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. 1998. Brock Biología de los Microorganismos. Octava Edición. Prentice Hall. España. • Larpent-Gourgaud, M., J.P. Larpent, B. Boissonnet. (1988). Travaux pratiques et diriges de Microbiologie. Société Marocaine des Editeurs Réunis. Rabat, Maroc. • Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana. México. a o 96 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Brooks, G.F., ButelJ.S.,Morse, S.A. 1999. Microbiología médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Editorial el Manual Moderno. 16a. Edición. | Harrigan, W.F. Laboratory Methods in Food Microbiology. 1998. Academic Press. 3a. Edition. £ Jay, J.M.1994. Microbiología Moderna de los Alimentos. Tercera Edición. Editorial Acribia, Zaragoza, ti España. a •o Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. 1998. Brock Biología de los Microorganismos. Octava Edición. Prentice Hall. España. Larpent-Gourgaud, M., J.P. Larpent., B. Boissonnet. (1988). Travaux pratiques et diriges de Microbiologie. Société Marocaine des Editeurs Réunis. Rabat, Maroc. Manual de Medios de Cultivo. Bioxon. Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana. México. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods 2001 (4th Edition) Edited by Francés Pouch Downes and Keith Ito. American Public Health Assosiation. Practical Handbook of Microbiology. 1989 William M O'Leary (Ed), Cornell Medical College, New York, New York, USA. CRC Press. Holt, J. G., N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Associated (APHA), American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. Ed. (1991). 99 manual de prácticas del / ^ K / f - u v ^ Y ;-: i-;-;:". ' " ;",:' '* DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    'J$fF*F 0 0 Preparación de soluciones y colorantes DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    1. Azul de lactofenol 4. Verde de malaquita Disolver 5.0 g del colorante verde de malaquita Disolver cuidadosamente 10 g de fenol (cristales) en 100 mL de agua destilada. en 20 ml_ de agua destilada, agregar 20 g de áci- do láctico y 40 g de glicerol. Posteriormente di- 5. Solución de lugol solver 0.05 g de azul de metilo. En un matraz aforado de 50 mL, disolver 0.333 de yoduro de potasio en 20 mL de agua destilada y 2. Azul de metileno alcalino enseguida agregar lentamente 0.166 g de yodo, mezclar completamente y aforar con agua desti- Disolver 0.3 g de azul de metileno en 30 mL de lada. alcohol etílico al 95% y mezclarlo con 100 mL de solución de hidróxido de potasio al 0.01% 6. Solución decolorante alcohol-acetona Colocar en una probeta de 50 mL, 30 mL de alco- 3. Cristal violeta hol etílico y 20 mL de acetona, mezclar perfecta- Este colorante se prepara en dos partes, mente. a. Solución a: en un vaso de precipitados de 50 7. Alcohol al 70% mL colocar 10 mL de alcohol etílico y disolver 1 g de cristal violeta. Solución b: en otro vaso 8. Safranina se disuelven 0.4 g de oxalato de amonio en En un matraz aforado de 50 mL colocar 5 mL de 40 mL de agua destilada. alcohol etilico y disolver 0.125 g de safranina. Afo- rar con agua destilada b. Mezclar cuidadosamente las soluciones a) y b) 9. Solución de Fenol al 2% En un matraz aforado de 100 mL colocar 2.0 g de c. Guardar la mezcla en un frasco ámbar en fenol cristales y disolver con un poco de agua poco obscuridad durante 24 hrs. Filtrar en papel a poco, después aforar con agua destilada. Whatman No. 1 antes de utilizarlo. 10. Soluciones amortiguadoras para controlar el pH de medios de cultivo PH K2HPO4 Ácido Cítrico Ácido Bórico NaOH Caldo Nutritivo 0.2 M (mL) 0.1 M (mL) 0.2 M (mL) 0.2 M (mL) (mL) 2.8 0.3 1.7 - 8.0 3.6 0.6 1.4 - - 8.0 4.4 0.9 1.1 - - 8.0 5.2 1.1 0.9 - - 8.0 6.0 1.3 0.7 - - 8.0 6.8 1.5 0.5 - - 8.0 7.6 1.9 0.1 - - 8.0 8.4 - - 1.7 0.3 8.0 9.2 - - 1.3 0.7 8.0 10 - - 1.0 1.0 8.0 103 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    o o * **0 Preparación de medios de cultivo DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    1. Caldo nutritivo (CN). Es un medio líquido complejo de uso general para el cultivo de bacterias ingredientes <g/L) Peptona de caseína 5.0 NaCI 8.0 Extracto de carne 3.0 PH 6.5-7.0 a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado b. Ajustar el pH c. Distribuir en tubos de ensaye con tapón de rosca d. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos 2. Agar nutritivo (AN). Es un medio sólido complejo de uso general para el cultivo de bacterias exigentes ingredientes (g/t) Peptona de caseína 5.0 NaCI 8.0 Extracto de carne 3.0 Agar 15.0 PH 6.5-7.0 a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado, menos el agar. b. Ajustar el pH c. Agregar el agar y calentar a ebullición durante 1 minuto d. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos e. Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones asépticas. 3.Medio Mínimo de Sales (MM). Es un medio químicamente definido de uso general para el cultivo de bacterias poco exigentes. ingredientes (g/L) Medio 1. Glucosa" 10.0 (NH4)2SO4 5.0 MgSO4«7H2O 2.0 K2HPO4 2.0 FeSO4-7H2O 0.1 DH 6.5-7.0 a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado, excepto la glucosa. b. La glucosa debeiá disolverse en recipiente separado de las sales. c. Ajustar el pH en el medio de sales. d. Agregar el agar (15 g/L) y calentar a ebullición durante 1 minuto. e. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos las dos soluciones. f. Dejar enfriar a 40°C y cerca del mechero mezclar las soluciones. g. Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones asépticas. 107 manual de prácticas del - ".": ¿ ¿ ?í VaO :*T: DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    4. Agar de Eosina azul de metileno (EMB-agar). Es un medio de cultivo comercial utilizado para identifica- ción y diferenciación de enterobacterias. Ingredientes <g/L) Peptona de gelatina 10.0 Lactosa 5.0 Sacarosa 5.0 K2HPO4 2.0 Eosina 0.4 Azul de metileno 0.065 Agar 13.5 (0 ca a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco. b. Calentar a ebullición durante 1 minuto c. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos d. Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones asépticas. 5. Agar para Estafilococos No. 110. Es un medio selectivo comercial para el aislamiento e identificación de estafilococos. ingredientes (g/L) Extracto de levadura 2.5 Peptona de caseína 10.0 Gelatina 30.0 Lactosa 2.0 D-Manitol 10.0 NaCI 75.0 K2HPO4 5.0 Agar 15.0 pH final 7.0 a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco. b. Calentar a ebullición durante 1 minuto c. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos d. Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones asépticas. 6. Papa-Dextrosa Agar (PDA). Es un medio sólido complejo comercial de uso general para el cultivo de hongos. Ingredientes (g/L) Glucosa 20.0 Extracto de papa 4.0 Agar 15.0 PH 5.6 a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco. b. Ajustar el pH c. Calentar a ebullición durante 1 minuto d. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos e. Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones asépticas. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    7. Papa Dextrosa Agar rosa de bengala Es un medio sólido complejo de uso general para el aislamiento de hongos Ingredientes (g/L) Glucosa 20.0 Extracto de papa 4.0 Rosa de bengala 0.03 Agar 15.0 pH 5.6 a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado, menos el agar b. Ajustar el pH (0 c. Agregar el agar y calentar a ebullición durante 1 minuto a d. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos •o e. Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones asépticas. 8. Czapek-Dox Agar (CDA) Es un medio de sales, de uso general para el cultivo de hongos poco exigentes. Ingredientes <g/u Sacarosa 30.0 NaNO3 2.0 KH2PO4 1.0 MaSO4-7H2O 0.5 KCI 0.5 FeSO4-7H2O 0.01 Agar 15.0 PH 5.6 a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado. Ajustar el pH b. Agregar el agar y calentar a ebullición durante 1 minuto c. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos d. Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones asépticas. 9. Caldo rojo de fenol Es un medio con diferentes azucares (glucosa, sacarosa, manitol) para pruebas de fermentación Ingredientes (g/L) Azúcar 20.0 KH 2 PO 4 9.1 K 2 HPO 4 9.5 Extracto de levadura 0.1 Rojo de fenol 0.01 pH final 6.8-7 a. Disolver cuidadosamente las sustancias b. Ajustar el pH c. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca d. Colocar un tubo de Durham invertido e. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos 109 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    10. Medio citrato de Simmons Agar. Medio complejo de prueba de utilización de citrato en enterobacterias Ingredientes (g/U Citrato de Sodio 2.0 K2HPO4 1.0 NH4H2PO4 1.0 MgSCy7H 2 O 0.2 NaCI 5.0 FeSCy 7H2O 0.01 Agar 15.0 Azul de bromotimol 0.08 (0 PH 7.0 CQ 0 a. Disolver cuidadosamente las sustancias b. Ajustar el pH c. Calentar a ebullición durante 1 minuto. d. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca. e. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos f. Dejar solidificar el medio en forma inclinada. 11. Caldo urea. Se emplea para la identificación de bacterias, particularmente para diferenciar los miembros del género Proteus de Salmonella yShlgella Ingredientes <g/U Urea 20.0 KH2PO4 9.1 K2HPO4 9.5 Extracto de levadura 0.1 Rojo de fenol 0.01 pH final 6.8 a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco. b. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca. c. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. 12. Medio SIM. Medio semisóiido usado rutinariamente en la diferenciación e identificación de cultivos de Enterobacterias y que detecta la producción de sulfuras, indol y movilidad de las mismas. Ingredientes (g/L) Peptona de caseína 20.0 Peptona de carne 6.1 Sulfato de hierro y amonio 0.2 Tiosulfato de sodio 0.2 Agar 3.5 pH final 7.3 a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco. b. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca. c. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. 110 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    13. Agar almidón.Para determinar actividad amilolítica ingredientes (g/U Almidón 10.0 Peptona de caseína 5.0 NaCI 8.0 Extracto de carne 3.0 Agar 15.0 pH 6.5-7.0 ti a. Disolver cuidadosamente las sustancias t b. Ajustar el pH (8 a c. Calentar a ebullición durante 1 minuto. o d. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos T3 14. Medio de leche con tornasol. Medio comercial para diferenciar microorganismos sobre la base de sus múltiples reacciones metabólicas en un medio lácteo ingredientes (g/L) Leche descremada deshidratada 100 Polvo de tornasol 0.75 a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco. b. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca. c. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. 15. Agar de hierro y triple azúcar TSI. Medio comercial para identificar y diferenciar enterobacterias. Se basa en la formación de sulfuros y fermentación de glucosa, sacarosa y lactosa. ingredientes (g/L) Mezcla de peptonas 20.0 NaCI 5.0 Lactosa 10.0 Sacarosa 10.0 Dextrosa 1.0 Sulfato de amonio férrico 0.2 Tiosulfato de sodio 0.2 Rojo fenol 0.025 Agar 13.0 pH final 7.3 a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco. b. Calentar a ebullición durante 1 minuto. c. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca. d. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos e. Dejar solidificar el medio en forma inclinada. 111 manual de prácticas del DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    16. Medio degelatina. Medio comercial para determinar actividad de proteasas Ingredientes (g/U Peptona de gelatina 5.0 Extracto de carne de res 3.0 Gelatina 120.0 pH final 6.8 a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco. b. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca. c. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos QQ 17. Medio de agar nutritivo blando.- Es un medio semisóiido complejo de uso general para determinar movi- lidad de bacterias Ingredientes (0/L) Peptona de caseína 5.0 NaCI 8.0 Extracto de carne 3.0 Agar 3.5 PH 6.5-7.0 a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado b. Ajustar el pH c. Calentar a ebullición durante 1 minuto d. Distribuir en tubos de ensaye con tapón de rosca e. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos 18. Medio de cultivo complejo. Para la curva de crecimiento microbiano probando diferentes concentraciones de sustrato carbonado. (1-20 g/L) Ingredientes (g/L) Glucosa 10.0 Peptona de caseína 2.0 Extracto de levadura 0.5 K2HPO4 0.5 PH 6.5 a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado. b. Agregar la cantidad de glucosa correspondiente c. Ajustar el pH d. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. 112 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    19. Caldo microinoculación. Medio comercial para cultivar y preparar inóculos de Lactobacilos y otros microorganismos utilizados en ensayos microbiológicos. ingredientes <g/U Extracto de levadura 20.0 Mezcla de peptonas 5.0 Dextrosa 10.0 •o KH2PO4 2.0 o Polisorbato 80 0.1 PH 6.5 a. Disolver cuidadosamente los ingredientes en el orden indicado. w { b. Ajustar el pH o c. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. 113 manual de prácticas del *> > , DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    • ;; • - Atlas de pruebas bioquímicas DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    CITRATO DE SIMMONS USINA DESCARBOXILASA TRIPLE A Z Ú C A R H I E R R O a: negativo, b: y c: positiva a: negativo, b:, c: y d: positiva a: negativo, b: ácido/ácido c: ácido/alcalino con gas PRODUCCIÓN DE GAS EN CAMPANA DE DURHAM SULFURO INDOL MOHLIDAD a: negativo, b: positivo con gas, c: positivo sin gas a: sin inocular, b: microorganismo no móvil, c: microorganismo móvil LECHE TORNASOLADA AISLAMIENTO DE Rhodotorula a: negativo, b:, c: y d: positiva sp. DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    DERECHOS RESERVADOS ©2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    Manual de prácticasdel Laboratorio de Microbiología General, se terminó de imprimir en el mes de junio de 2004 en la Sección de Talleres Gráficos del Departamento de Publica- }** -> ¿0 ciones de Rectoría General de la Universidad Autónoma Metropolitana. Se tiraron 1000 ejem- *> #^ #n piares sobre papel gráfico bond de 60 kgs., en tipos Castle de 11 y 13 pts., en interiores y de »O * * 32 y 17 pts., para portada. Diagramación, formación y portada, diseñados por D.G. Liliana Hidalgo Sánchez de Tagle, de la Sección de Textos y Formación del mismo Departamento. kfQ ** 0 DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    DERECHOS RESERVADOS ©2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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    N.E. 0534 $17.00 9 789703 101412 Manual de prac. lab de microbiología general, publicaciones CBS UAM-Iztapalapa Librería DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com