Manejo biologico de Compsis spp, atacando Vid en el Valle del Cauca

1. Novedades Técnicas / 24
Investigación
5
Evaluación de la eficacia de
Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana
en el control de picudos asociados
con la vid, utilizando
activadores de patogenicidad
1. 2.
Jefe de laboratorio Sanoplant Calle 47 No. 30B-32 Palmira / www.sanoplant.com.co / Jefe de producción Sanoplant Calle 47 No. 30B-32 Palmira / www.sanoplant.com.co
3.
Gerente General Sanoplant Calle 47 No. 30B-32 Palmira / www.sanoplant.com.co
1 2 3
Eliana Andrea Rincón , Carlos Andrés Montoya , Carlos Aníbal Montoya
Palabras clave: Picudos, Compsus
spp. Vid, Plagas, Entomopatógenos,
Beauveria, Metarhizium, Activadores
de Patogenicidad, Biocontrol.
Resumen
En evaluaciones realizadas en
cultivos de la vid, se ha determinado la
presencia del picudo de los cítricos
C o m p s u s s p p . ( C o l e o p t e r a :
Curculionidae) en poblaciones que
sobrepasan el umbral de daño
económico, causando un marcado
retraso en el crecimiento, la disminu-
ción del tamaño y calidad del fruto, y
como consecuencia una pérdida de
producción de las plantas infestadas.
Con el objetivo de buscar alternativas
biológicas eficientes para el control de
Compsus spp. en cultivos de la vid,
con alternativas de aumento de la
patogenicidad y virulencia de hongos
entomopatógenos, se evaluó la
eficacia de una cepa de Metarhizium
anisopliae y de Beauveria bassiana
nes de este estudio se demuestra la
eficacia de las cepas de M. anisopliae
y B. bassiana en el control de picudos
de la vid y el aumento de la virulencia
al suplementar el medio de cultivo con
activadores de patogenicidad, siendo
una alternativa biológica eficaz,
económica y sin impactos
Abstract
Phytosanitary evaluations per-
formed in vine crops of Top Fruit Co. in
Yumbo Valle, determined the
presence of Compsus sp. (Coleoptera:
Curculionidae) in populations exceed
the economic threshold, causing a
marked growth retardation, decreased
fruit size and quality, and therefore a
loss of efficiency of of infested plants.
With the goal of finding effective
biological control against Compsus
spp. In vine crops, so as alternatives
that increase the pathogenicity and
virulence of entomopathogenic fungi,
the efficacy of Metarhizium anisopliae
sobre picudos capturados en la
empresa Top Fruit de la vereda San
Marcos en el municipio de Yumbo
Valle. Se inocularon cepas de los
hongos cultivados en PDA, PDA
enriquecido con bioproteina (BP) y
PDAenriquecido con sustrato proteico
(SP). Se encontraron diferencias
estadísticas significativas en el
porcentaje de mortalidad de adultos
de Compsus spp., de acuerdo con la
prueba de Tukey al nivel del 5%, entre
el tratamiento control y los demás
tratamientos. Las diferencias en
cuanto al porcentaje de parasitismo o
porcentaje de insectos con el hongo
esporulado estuvieron a favor de los
tratamientos M. anisopliae + PDA+ BP
y M. anisopliae + PDA con porcentajes
por encima del 70%, seguido de los
tratamientos B. bassiana + PDA + BP,
M. anisopliae + PDA + SP y B. bassia-
na + PDA con porcentajes entre 58,4 y
64,0%. En el tratamiento control, el
porcentaje de insectos parasitados
por hongos fue cero. Bajo las condicio-

2. was evaluated and Beauveria
bassiana on Compsus spp. Adult
insects were inoculated with fungi
grow in culture medium PDA, PDA
enriched bioprotein (BP) and PDA
enriched with protein substrate (SP).
Results were, satistically different in
mortality rate, according to the Tukey
test at the level of 5%, between check
treatment and treatments per se. The
differences in the percentage of
parasitism of insects by fungus
sporulated favored treatment M.
anisopliae + PDA + BP and M.
anisopliae + PDA with percentages
above 70%, followed by B. bassiana
treatments + PDA + BP, PDA + M.
anisopliae and B. bassiana SP + PDA
with percentages between 58,0 and
64,0%. In the control treatment, the
percentage of insects parasitized by
fungi was zero. Under the conditions of
this study the efficacy of the fungus M.
anisopliae and B. bassiana in
controlling vine weevil and the
increased virulence by supplementing
the culture medium with pathogenicity
activators was demonstrated to be an
effective biological alternative,
economical and low environmental
impacts.
Introducción
Evaluaciones realizadas en cultivos
de Vid, han permitido determinar la
presencia del Picudo de los Cítricos
C o m p u s s p p . ( C o l e o p t e r a :
Curculionidae) en poblaciones que
sobrepasan el Umbral de Daño
Económico, causando un marcado
retraso en el crecimiento, la disminu-
ción del tamaño y calidad del fruto, y
en el peor de los casos muerte de las
plantas, ya que al atacar el sistema de
raíces, las barrenan siendo la puerta
de entrada de hongos patógenos, los
cuales son habitantes naturales del
suelo.
Las larvas eclosionadas de los más
de 3500 huevos ovipositados por una
hembra durante su ciclo, caen al suelo
en donde se alimentan afectando todo
el sistema radical, siendo el estado
más dañino del ciclo biológico de la
plaga (Montoya, 2001; Roa et al,
2005). Adicional al daño directo, las
Clarkson y Charnley (1996), afirman
que la producción de enzimas que
degradan la cutícula de insectos plaga
al momento de la inoculación, es
estimulada al adicionar al medio de
cultivo activadores de patogenicidad.
Raymomd et al (2004), al estudiar la
actividad biocontroladora de dos
aislamientos de Metarhizium anisoliae
sobre la garrapata Boophilus microlus,
concluye que el uso de activadores de
patogenicidad durante la fase de
cultivo es un proceso que asegura un
mejor efecto biocontrolador de los
hongos sobre la garrapata.
Teniendo en cuenta lo anterior y con
el fin de buscar alternativas biológicas
eficientes para el control de Compsus
spp. en cultivos de Vid, y de alternati-
vas que incrementen la patogenicidad
y la virulencia de las cepas de
Sanoplant, se evaluó la eficacia de
Metarhizium anisopliae y de
Beauveria bassiana sobre el control
de picudos (Compsus spp), utilizando
activadores de patogenicidad; para lo
cual, fueron inoculados adultos de
Compsus spp. colectados en plantas
de Vid, con cepas de los hongos
entomopatógenos crecidos en los
medios de cultivo PDA, PDA enrique-
cido con bioproteina (BP) y PDA
enriquecido con sustrato proteico
(SP).
Objetivo
Evaluar la eficacia de cepas
Metarhizium anisopliae y de
Beauveria bassiana sobre el control
de picudos de la Vid Compsus spp,
utilizando activadores de patogenici-
dad.
Objetivos Específicos
Evaluar la patogenicidad y virulencia
de cepas de Metarhizium anisopliae y
de Beauveria bassiana de Sanoplant,
sobre picudos asociados a cultivos de
Vid.
Determinar la eficacia de activado-
res de patogenicidad sobre cepas de
Metarhizium anisopliae y de
lesiones en la raíz favorecen la
entrada de microorganismos patóge-
nos como son Ceratocystis spp.,
Rosellinia spp., Phytophthora spp. y
Pythium spp. ( Montoya, 2000, Perez,
2000; Peñaloza y Díaz, 2004; Roa et
al., 2005). Los adultos emergen a la
superficie en donde se alimentan de
brotes y frutos tiernos, reduciendo la
capacidad fotosintéticamente activa
de la planta y depreciando la calidad
del fruto (Cano et al., 2002; Roa et al.,
2005). El mayor daño causado por los
adultos de Compsus spp. es que al
alimentarse de las hojas, se favorece
la entrada favorece la entrada de
microorganismos patógenos, siendo
Colletotrichum spp. uno de los de
mayor importancia económica, debido
a que causa grandes defoliaciones,
caída de flores y daños en frutos
(Montoya, 2000- Montoya 2001).
Reportes de literatura registran la
eficiencia de los hongos entomo-
patógenos Beauveria bassiana y
Metarhizium anisopliae en el control
de adultos e inmaduros de Compsus
spp. (Peñaloza y Díaz, 2004; Bustillo,
2008, Montoya, 2001 y Orozco, 2011).
De igual manera se reporta que la
virulencia de hongos entomopatóge-
nos se incrementa con el enriqueci-
miento del medio de cultivo, debido a
los nutrientes ofertados y a la induc-
ción de enzimas requeridas para la
patogenicidad.
Smith y Grula (1981) han evaluado el
integumento de insectos como fuente
de nutrición de hongos.
Gonzales et al (2001) y Elsufty
(1983), encontraron que aislamientos
de Beauveria bassiana incrementaron
su patogenicidad significativamente
cuando se subcultivaron en medio
suplementado con integumento,
manteniendo estas características
después de varias transferencias en
medios de cultivo sin los insectos.
Estos resultados fueron similares a los
obtenidos por Villamizar et al (2001), al
suplementar con alas y patas de
langosta el medio para el crecimiento
de Metarhizium anisopliae.
6
Investigación
Julio 2015

3. Beauveria bassiana de Sanoplant.
Seleccionar el tratamiento que
favorezca la patogenicidad y/o
virulencia de los hongos entomopató-
genos evaluados.
Diseño Experimental
Se evaluaron seis tratamientos que
c o r r e s p o n d e n a d o s h o n g o s
Metarhizium anisopliae cepa SMa27 y
Beauveria bassiana cepa SBb66; y
tres sustratos: PDA, PDA + bioprotei-
na (BP), y PDA + sustrato proteínico
(SP); más un tratamiento control:ADE.
Por cada tratamiento se tuvieron 5
repeticiones, con 5 insectos o unida-
des de observación, bajo un diseño
completamente aleatorio (DCA). Los
tratamientos se enumeraron de la
manera que a continuación se des-
cribe:
Empresa Top Fruit de la vereda
San Marcos en el municipio de
Yumbo, se desinfestaron
mediante la inmersión en
hipoclorito de sodio al 0,1% y
doble inmersión en agua destilada
esterilizada (Figura 1).
Los insectos se inocularon mediante
inmersión durante 3 minutos en una
suspensión del hongo a una concen-
7
tración de 1x10 conidias/ml, y se
ubicaron en cajas de Petri desecha-
bles, con un papel filtro en la base
humedecido con 350 µl de ADE. Las
cajas se sellaron con vinipel y se
llevaron a incubación a ± 24,7ºC y ±
37% de humedad. Cada dos días se
evaluaron el número de insectos
vivos, muertos y con el hongo esporu-
lado, datos que al relacionarse y
multiplicarse por 100 arrojan el valor
del porcentaje de mortalidad y del
porcentaje de esporulación, variables
que demuestran la patogenicidad y la
virulencia del inóculo y la eficiencia de
los activadores de patogenicidad.
Novedades Técnicas / 24
Investigación
7
Tratamiento
1
2
3
4
5
6
7
Descripción
M. anisopliae + PDA + BP
M. anisopliae + PDA
M. anisopliae + PDA + SP
B. bassiana + PDA + BP
B. bassiana + PDA
B. bassiana + PDA + SP
Control
Metodología
El PDAse preparó al 3,9%. La concen-
tración de la BP se hizo de acuerdo a lo
reportado por Clarkson et al (1996)
3
3,3x10-3 g/cm ; teniendo en cuenta
que fueron 6 cajas, y que el área de la
2
caja es de 78,54 cm , se adicionaron
1,55 g a los 90 ml de PDA. Del SP se
adicionaron 1 ml a los 90 ml de PDA.
La siembra de los hongos se hizo
mediante el paso de alícuotas con una
aguja microbiológica a partir de las
cepas puras crecidas en medio de
cultivo PDA. Las cepas sembradas
fueron Bb66 de Beauveria bassiana y
Ma27 de Metarhizium anisopliae. Las
cajas fueron selladas con vinipel e
incubadas a ± 24,7ºC y ± 37% de
humedad relativa.
Los insectos colectados en la
Tabla 1. Descripción de los tratamientos
Figura 1. Desinfestación de picudos.
a. inmersión en hipoclorito de sodio al 0,1%;
b. inmersión en agua destilada estéril
a
b
a
b
c

4. Resultados
La mortalidad inició a los 4 días
después de la inoculación (ddi) en
todos los tratamientos. En el trata-
miento 7 (control) se encontró un
insecto muerto a los 3 ddi, pero la muerte al parecer fue causada por otro de los
individuos de la unidad experimental (Figura 3); esto de igual manera se presen-
tó al día 5 en otra caja de Petri.
El tratamiento 7 presentó diferencias estadísticas significativas en el porcenta-
je mortalidad, de acuerdo a la prueba deTukey al nivel del 5% (Tabla 2).
La esporulación del hongo inoculado inició a los dos días en los tratamientos 1,
3, 4 y 6, que corresponde a los medios de cultivo suplementados con los activa-
dores de patogenicidad. En los tratamientos 2 y 5, la esporulación se observó a
los 4 días después de la inoculación. La esporulación se presentó inicialmente
en boca, ano e integumento, y avanzó de la manera en que se ilustra en la
siguiente Figura (Figura 4).
d
e
f
8
Investigación
Figura 2. Protocolo. a. y b. suspensión del
cultivo puro del hongo en ADE; c. dilución en
base 10; d. conteo de conidias en cámara de
Neubauer; e. inoculación f. insectos en la caja
de Petri
Figura 3. Insecto muerto por posible predación Figura 4. Avance del parasitismo del hongo en los insectos inoculados
Tabla 2. Porcentaje de mortalidad (Tukey 5%, R2 0,94, DMS: 6,51379, Error: 58,3136, Gl: 164)
Tratamiento Descripción Media N
7 12,00
4 97,60
3 98,40
6 99,20
1 99,20
5 100,00
2
Control
B. bassiana + PDA + BP
M. anisopliae + PDA + SP
B. bassiana + PDA + SP
M. anisopliae + PDA + BP
B. bassiana + PDA
M. anisopliae + PDA 100,00
25 A
25 B
25 B
25 B
25 B
25 B
25 B
Letras distintas indican diferencias significativas (p<=0,05)
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5. Novedades Técnicas / 24
Investigación
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Figura 5. Insectos a los 4 días después de la inoculación. Nótese que el insecto del tratamiento 7 está vivo
Tratamiento 1 Tratamiento 2
Tratamiento 3 Tratamiento 4 Tratamiento 5
Tratamiento 6 Tratamiento 7
En las siguientes Figuras se ilustra la esporulación en individuos de cada tratamiento a los 4 y 7 días
después de la inoculación (Figura 5 y 6).
Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 Tratamiento 4

6. Tratamiento Descripción Media N
7 Control 00,00 25 A
6 B. bassiana + PDA + SP 48,80 25 B
4 B. bassiana + PDA + BP 58,40 25 B C
3 M. anisopliae + PDA + SP 64,00 25 B C
5 B. bassiana + PDA 67,20 25 B C
1 M. anisopliae + PDA + BP 71,20 25 C
2 M. anisopliae + PDA 72,00 25 C
Investigación
Tratamiento 5 Tratamiento 6 Tratamiento 7
Figura 6. Insectos a los 7 días después de la inoculación. Nótese que el insecto del tratamiento 7 está vivo
Las diferencias en cuanto al porcentaje de parasitismo o porcentaje de insectos con el hongo esporulado estuvieron a
favor de los tratamientos 1 y 2 con porcentajes por encima del 70%, seguido de los tratamientos 4, 3 y 5 con porcentajes
entre 58,40 y 64%. En el tratamiento 7 el porcentaje de insectos parasitados por hongos fue cero.
Tabla 3. Porcentaje de parasitismo (Tukey 5%, R2 0,75, DMS: 18,95499, Error: 493,7979, Gl: 164)
Letras distintas indican diferencias significativas (p<=0,05)
En la siguiente Figura se ilustra el parasitismo en los insectos inoculados
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7. Novedades Técnicas / 24
Investigación
Figura 7. Parasitismo de Beauveriplant y Metarhiplant sobre los picudos inoculados
En la siguiente Figura se ilustran insectos del tratamiento 7 (control).
Figura 8. . Insectos del tratamiento control vivos

8. Investigación
Conclusiones
Bajo las condiciones de este estudio se concluye que:
El protocolo utilizado permitió determinar diferencias entre
2
los tratamientos con un Coeficiente de Determinación R = 75%
, lo que demuestra la concordancia entre los valores observa-
dos y los estimados como parte de los resultados por parte del
modelo.
Los ingredientes activos de Metarhiplant y de Beauveriplant
crecidos en medio de cultivo PDA solo o enriquecido, son
eficientes biocontroladores de los Picudos asociados al cultivo
de Vid.
No se presentaron diferencias en el porcentaje de mortalidad
al evaluar el hongo crecido en medio PDA sólo y enriquecido
con la BP y el SP, pero en términos del periodo de incubación y
de latencia, si se encontraron efectos positivos, ya que los
tiempos de infección y de colonización en los tratamientos con
los activadores de patogenicidad, iniciaron a las 24 horas ddi, y
se observó esporulación del hongo inoculado por las aberturas
naturales como es el caso de boca y ano a las 48 horas ddi, lo
cual es excelente en términos de control.
Los mayores promedios en el porcentaje de insectos
parasitados se presentaron con Metarhizium anisopliae
crecido en PDA y en PDA enriquecido con BP, con un valor de
70%.
Los productos de Sanoplant son una alternativa viable,
eficaz y económica para controlar los picudos asociados a Vid,
sin afectar el medio ambiente, ya que se protegen los recursos
naturales tales como,Agua,Aire y Suelo,
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12 Julio 2015