1. Novedades Técnicas / 24
Investigación
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Evaluación de la eficacia de
Metarhizium Anisopliae y de Beauveria Bassiana
sobre el control de picudos asociados
al cultivo de vid, utilizando
activadores de patogenicidad
1. 2.
Jefe de laboratorio Sanoplant Calle 47 No. 30B-32 Palmira / www.sanoplant.com.co / Jefe de producción Sanoplant Calle 47 No. 30B-32 Palmira / www.sanoplant.com.co
3.
Gerente General Sanoplant Calle 47 No. 30B-32 Palmira / www.sanoplant.com.co
1 2 3
Eliana Andrea Rincón , Carlos Andrés Montoya , Carlos Aníbal Montoya
Palabras clave: Picudos, Compsus
spp, Vid, Plagas, Entomopatógenos,
Beauveria, Metarhizium, Activadores
de Patogenicidad, Biocontrol.
Resumen
Evaluaciones realizadas en cultivos
de Vid han permitido determinar la
presencia del Picudo de los Cítricos
Compus sp. (Coleoptera: Curculioni-
dae) en poblaciones que sobrepasan
el Umbral de Daño Económico,
causando un marcado retraso en el
crecimiento, la disminución del
tamaño y calidad del fruto, y por ende
una pérdida del rendimiento. Con el
objetivo de buscar alternativas
biológicas eficientes para el control de
Compsus sp. en cultivos de vid, y de
alternativas que incrementen la
patogenicidad y la virulencia de
hongos entomopatógenos, se evaluó
la eficacia de Metarhizium anisopliae y
de Beauveria bassiana sobre picudos
capturados en la Empresa Top Fruit de
B. bassiana en el control de picudos de
Vid y el incremento de la virulencia al
suplementar el medio de cultivo con
activadores de patogenicidad, siendo
una alternativa biológica eficaz,
económica y sin impactos ambienta-
les.
Abstract
Evaluations conducted in vid crops
have identified the presence of
Compus sp. (Coleoptera: Curculioni-
dae) in populations exceed the
economic threshold, causing a marked
growth retardation, decreased fruit
size and quality, and therefore a loss of
efficiency of infected individuals. With
the goal of finding effective biological
control alternatives Compsus sp. vid
crops, and alternatives that increase
the pathogenicity and virulence of
entomopathogenic fungi, the efficacy
of Metarhizium anisopliae was
evaluated and Beauveria bassiana on
Compsus sp. captured in Top Fruit in
la vereda San Marcos en el municipio
de Yumbo Valle, inoculándolos con
cepas de los hongos crecidas en los
medios de cultivo PDA, PDA enrique-
cido con bioproteina (BP) y PDA
enriquecido con sustrato proteico
(SP), encontrándose diferencias
estadísticas significativas en el
porcentaje mortalidad, de acuerdo a la
Prueba de Tukey al nivel del 5%, entre
el tratamiento control y los demás
tratamientos. Las diferencias en
cuanto al porcentaje de parasitismo o
porcentaje de insectos con el hongo
esporulado estuvieron a favor de los
tratamientos M. anisopliae + PDA+ BP
y M. anisopliae + PDAcon porcentajes
por encima del 70%, seguido de los
tratamientos B. bassiana + PDA + BP,
M. anisopliae + PDA + SP y B. bassia-
na + PDA con porcentajes entre 58,40
y 64%. En el tratamiento control el
porcentaje de insectos parasitados
por hongos fue cero. Bajo las condicio-
nes de este estudio se demuestra la
eficacia de los hongos M. anisopliae y
2. Yumbo Valle, inoculáted with fungi
grown in culture media PDA, PDA
enriched bioprotein (BP) and PDA
enriched with protein substrate (SP),
being statistically significant differ-
ences in the mortality rate, according
to the Tukey test at the le vel of 5%,
between control treatment and other
treatments. The differences in the
percentage of parasitism percentage
of insects or fungus sporulated favored
treatment M. anisopliae + PDA + BP
and M. anisopliae + PDA with percent-
ages above 70%, followed by B.
bassiana treatments + PDA + BP +
PDA + M. anisopliae and B. bassiana
SP + PDA with percentages between
58.40 and 64%. In the control treat-
ment, the percentage of insects
parasitized by fungi was zero. Under
the conditions of this study the efficacy
of the fungus M. anisopliae and B.
bassiana in controlling vine weevil and
the increased virulence by supple-
menting the culture medium with
pathogenicity activators is demon-
strated to be an effective biological
alternative, economical and environ-
mental impacts.
INTRODUCCIÓN
Evaluaciones realizadas en cultivos
de Vid, han permitido determinar la
presencia del Picudo de los Cítricos
C o m p u s s p p . ( C o l e o p t e r a :
Curculionidae) en poblaciones que
sobrepasan el Umbral de Daño
Económico, causando un marcado
retraso en el crecimiento, la disminu-
ción del tamaño y calidad del fruto, y
por ende una pérdida del rendimiento
y en el peor de los casos muerte de las
plantas ya que al atacar el sistema de
raíces, las barrenan siendo la puerta
de entrada de hongos patógenos, los
cuales son habitantes naturales del
suelo.
Las larvas eclosionadas de los más
de 3500 huevos ovipositados por una
hembra durante su ciclo, caen al suelo
en donde se alimentan afectando todo
el sistema radical, siendo el estado
más dañino del ciclo biológico de la
plaga (Montoya, 2001; Roa et al,
2005). Adicional al daño directo, las
lesiones en la raíz favorecen la
que la producción de enzimas que
degradan la cutícula de insectos plaga
al momento de la inoculación, es
estimulada al adicionar al medio de
cultivo activadores de patogenicidad.
Raymomd et al (2004), al estudiar la
actividad biocontroladora de dos
aislamientos de Metarhizium aniso-
pliae sobre la garrapata Boophilus
microplus, concluye que el uso de
activadores de patogenicidad durante
la fase de cultivo es un proceso que
asegura un mejor efecto biocontrola-
dor de los hongos sobre la garrapata.
Teniendo en cuenta lo anterior y con
el fin de buscar alternativas biológicas
eficientes para el control de Compsus
sp. en cultivos de Vid, y de alternativas
que incrementen la patogenicidad y la
virulencia de las cepas de Sanoplant,
se evaluó la eficacia de Metarhizium
anisopliae y de Beauveria bassiana
sobre el control de picudos (Compsus
spp), utilizando activadores de
patogenicidad; para lo cual, fueron
inoculados adultos de Compsus sp.
colectados en plantas de Vid, con
cepas de los hongos entomopatóge-
nos crecidos en los medios de cultivo
PDA, PDA enriquecido con bioprotei-
na (BP) y PDA enriquecido con
sustrato proteico (SP).
OBJETIVO
Evaluar la eficacia de Cepas
Metarhizium anisopliae y de
Beauveria bassiana sobre el control
de picudos de la Vid Compsus spp,
utilizando activadores de patogenici-
dad.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Evaluar la patogenicidad y virulencia
de cepas de Metarhizium anisopliae y
de Beauveria bassiana de Sanoplant,
sobre picudos asociados a cultivos de
Vid.
Determinar la eficacia de activado-
res de patogenicidad sobre cepas de
Metarhizium anisopliae y de
Beauveria bassiana de Sanoplant.
Seleccionar el tratamiento que
entrada de microorganismos patóge-
nos como son Ceratocystis spp.,
Rosellinia spp., Phytophthora spp. y
Pythium spp. ( Montoya, 2000, Perez,
2000; Peñaloza y Díaz, 2004; Roa et
al., 2005). Los adultos emergen a la
superficie en donde se alimentan de
brotes y frutos tiernos, reduciendo la
capacidad fotosintéticamente activa
de la planta y depreciando la calidad
del fruto (Cano et al., 2002; Roa et al.,
2005). El mayor daño causado por los
adultos de Compsus sp. es aquel que
como producto de su alimentación
foliar, se favorece la entrada de
microorganismos patógenos, siendo
Colletotrichum spp. uno de los de
mayor importancia económica, debido
a que causa grandes defoliaciones,
caída de flores y daños en frutos
(Montoya, 2000-2001).
Reportes de literatura registran la
eficiencia de los hongos entomopató-
genos Beauveria bassiana y
Metarhizium anisopliae en el control
de adultos e inmaduros de Compsus
spp. (Peñaloza y Díaz, 2004; Bustillo,
2008, Montoya, 2001 y Orozco, 2011).
De igual manera se reporta que la
virulencia de hongos entomopatóge-
nos se incrementa con el enriqueci-
miento del medio de cultivo, debido a
los nutrientes ofertados y a la induc-
ción de enzimas requeridas para la
patogenicidad.
Smith y Grula (1981) han evaluado el
integumento de insectos como fuente
de nutrición de hongos.
Gonzales et al (2001) y Elsufty
(1983), encontraron que aislamientos
de Beauveria bassiana incrementaron
su patogenicidad significativamente
cuando se subcultivaron en medio
suplementado con integumento,
manteniendo estas características
después de varias transferencias en
medios de cultivo sin los insectos.
Estos resultados fueron similares a los
obtenidos por Villamizar et al (2001), al
suplementar con alas y patas de
Langosta el medio para el crecimiento
de Metarhizium anisopliae.
Clarkson y Charnley (1996), afirman
6 Junio 2015
Investigación
3. favorezca la patogenicidad y/o
virulencia de los hongos entomopató-
genos evaluados.
DISEÑO EXPERIMENTAL
Se evaluaron seis tratamientos que
c o r r e s p o n d e n a d o s h o n g o s
Metarhizium anisopliae cepa SMa27 y
Beauveria bassiana cepa SBb66; y
tres sustratos: PDA, PDA + bioprotei-
na (BP), y PDA + sustrato proteínico
(SP); más un tratamiento control:ADE.
Por cada tratamiento se tuvieron 5
repeticiones, con 5 insectos o unida-
des de observación, bajo un diseño
completamente aleatorio (DCA). Los
tratamientos se enumeraron de la
manera que a continuación se
describe:
Empresa Top Fruit de la vereda
San Marcos en el municipio de
Yumbo, se desinfestaron
mediante la inmersión en
hipoclorito de sodio al 0,1% y doble
inmersión en agua destilada esteriliza-
da (Figura 1).
Los insectos se inocularon mediante
inmersión durante 3 minutos en una
suspensión del hongo a una concen-
tración de 1x107 conidias/ml, y se
ubicaron en cajas de Petri desecha-
bles, con un papel filtro en la base
humedecido con 350 µl de ADE. Las
cajas se sellaron con vinipel y se
llevaron a incubación a ± 24,7ºC y ±
37% de humedad. Cada dos días se
evaluaron el número de insectos
vivos, muertos y con el hongo esporu-
lado, datos que al relacionarse y
multiplicarse por 100 arrojan el valor
del porcentaje de mortalidad y del
porcentaje de esporulación, variables
que demuestran la patogenicidad y la
virulencia del inóculo y la eficiencia de
los activadores de patogenicidad.
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Investigación
7
Tratamiento
1
2
3
4
5
6
7
Descripción
M. anisopliae + PDA + BP
M. anisopliae + PDA
M. anisopliae + PDA + SP
B. bassiana + PDA + BP
B. bassiana + PDA
B. bassiana + PDA + SP
Control
METODOLOGÍA
El PDAse preparó al 3,9%. La concen-
tración de la BP se hizo de acuerdo a lo
reportado por Clarkson et al (1996)
3
3,3x10-3 g/cm ; teniendo en cuenta
que fueron 6 cajas, y que el área de la
2
caja es de 78,54 cm , se adicionaron
1,55 g a los 90 ml de PDA. Del SP se
adicionaron 1 ml a los 90 ml de PDA.
La siembra de los hongos se hizo
mediante el paso de alícuotas con una
aguja microbiológica a partir de las
cepas puras crecidas en medio de
cultivo PDA. Las cepas sembradas
fueron Bb66 de Beauveria bassiana y
Ma27 de Metarhizium anisopliae. Las
cajas fueron selladas con vinipel e
incubadas a ± 24,7ºC y ± 37% de
humedad relativa.
Los insectos colectados en la
Tabla 1. Descripción de los tratamientos
Figura 1. Desinfestación de picudos.
a. inmersión en hipoclorito de sodio al 0,1%;
b. inmersión en agua destilada estéril
a
b
a
b
c
4. RESULTADOS
La mortalidad inició a los 4 días
después de la inoculación (ddi) en
todos los tratamientos. En el trata-
miento 7 (control) se encontró un
insecto muerto a los 3 ddi, pero la muerte al parecer fue causada por otro de los
individuos de la unidad experimental (Figura 3); esto de igual manera se presen-
tó al día 5 en otra caja de Petri.
El tratamiento 7 presentó diferencias estadísticas significativas en el porcenta-
je mortalidad, de acuerdo a la prueba deTukey al nivel del 5% (Tabla 2).
La esporulación del hongo inoculado inició a los 4 ddi, y se presentó inicial-
mente en boca, ano e integumento, y avanzó de la manera en que se ilustra en la
siguiente Figura (Figura 4).
d
e
f
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Investigación
Figura 2. Protocolo. a. y b. suspensión del
cultivo puro del hongo en ADE; c. dilución en
base 10; d. conteo de conidias en cámara de
Neubauer; e. inoculación f. insectos en la caja
de Petri
Figura 3. Insecto muerto por posible predación
Tratamiento Descripción Media N
7 12,00
4 97,60
3 98,40
6 99,20
1 99,20
5 100,00
2
Control
B. bassiana + PDA + BP
M. anisopliae + PDA + SP
B. bassiana + PDA + SP
M. anisopliae + PDA + BP
B. bassiana + PDA
M. anisopliae + PDA 100,00
25 A
25 B
25 B
25 B
25 B
25 B
25 B
Tabla 2. Porcentaje de mortalidad (Tukey 5%, R2 0,94, DMS: 6,51379, Error: 58,3136, Gl: 164)
Letras distintas indican diferencias significativas (p<=0,05)
Figura 4. Avance del parasitismo del hongo en los insectos inoculados
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Figura 5. Insectos a los 4 días después de la inoculación. Nótese que el insecto del tratamiento 7 está vivo
Tratamiento 1 Tratamiento 2
Tratamiento 3 Tratamiento 4 Tratamiento 5
Tratamiento 6 Tratamiento 7
A los 7 días después de la inoculación los insectos se veían de la manera en que se ilustra en la Figura 6.
Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 Tratamiento 4
6. Tratamiento Descripción Media N
7 Control 00,00 25 A
6 B. bassiana + PDA + SP 48,80 25 B
4 B. bassiana + PDA + BP 58,40 25 B C
3 M. anisopliae + PDA + SP 64,00 25 B C
5 B. bassiana + PDA 67,20 25 B C
1 M. anisopliae + PDA + BP 71,20 25 C
2 M. anisopliae + PDA 72,00 25 C
Investigación
Junio 2015
Tratamiento 5 Tratamiento 6 Tratamiento 7
Figura 6. Insectos a los 7 días después de la inoculación. Nótese que el insecto del tratamiento 7 está vivo
Las diferencias en cuanto al porcentaje de parasitismo o porcentaje de insectos con el hongo esporulado estuvieron a
favor de los tratamientos 1 y 2 con porcentajes por encima del 70%, seguido de los tratamientos 4, 3 y 5 con porcentajes
entre 58,40 y 64%. En el tratamiento 7 el porcentaje de insectos parasitados por hongos fue cero.
Tabla 3. Porcentaje de parasitismo (Tukey 5%, R2 0,75, DMS: 18,95499, Error: 493,7979, Gl: 164)
Letras distintas indican diferencias significativas (p<=0,05)
En la siguiente Figura se ilustra el parasitismo en los insectos inoculados
7. Novedades Técnicas / 23
Investigación
Figura 7. Parasitismo de Beauveriplant y Metarhiplant sobre los picudos inoculados
En la siguiente Figura se ilustran insectos del tratamiento 7 (control).
Figura 8. . Insectos del tratamiento control vivos
8. Investigación
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CONCLUSIONES
Bajo las condiciones de este estudio se concluye que:
El protocolo utilizado permitió determinar diferencias entre
los tratamientos con un Coeficiente de Determinación R2 =
75% , lo que demuestra la concordancia entre los valores
observados y los estimados como parte de los resultados por
parte del modelo.
Los ingredientes activos de Metarhiplant y de Beauveriplant
crecidos en medio de cultivo PDA solo o enriquecido, son
eficientes biocontroladores de los Picudos asociados al cultivo
de Vid.
No se presentaron diferencias en el porcentaje de mortali-
dad, al evaluar el hongo crecido en medio PDAsólo y enriqueci-
do con la BP y el SP, pero en términos del periodo de incuba-
ción y de latencia, si se encontraron efectos positivos ya que
los tiempos de infección y de colonización se inician a los 24
horas y se observa esporulación por las aberturas naturales
como es el caso de la boca y año a los 48 horas, lo cual es
excelente en términos de control.
Los mayores promedios en el porcentaje de insectos
parasitados se presentaron con Metarhizium anisopliae
crecido en PDA y en PDA enriquecido con BP, con un valor de
70%.
Los productos de Sanoplant son una alternativa viable,
eficaz y económica para controlar los picudos asociados a Vid,
sin afectar el medio ambiente, ya que se protegen los recursos
naturales tales como,Agua,Aire y Suelo,
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