Este estudio investigó los cambios en la mielinización y la inflamación durante la degeneración secundaria después de una lesión parcial del nervio óptico en ratas. Los resultados mostraron un aumento de la inflamación y las anomalías en la mielina, como capas finas o gruesas de mielina, en los axones vulnerables a medida que progresaba la degeneración. Los investigadores concluyeron que la inflamación axonal y las mayores anomalías en la mielina contribuyen a la disfunción crónica del nervio óptico
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Anomalías mielínicas crónicas y degeneración secundaria tras lesión parcial del SNC
1. Chronic Swelling and Abnormal
Myelination
during Secondary Degeneration
after Partial Injury
to a Central Nervous System Tract
Sophie C. Payne,1,2 Carole A. Bartlett,1,2 Alan R.
Harvey,1,3 Sarah A. Dunlop,1,2 and Melinda Fitzgerald1,2
JOURNAL OF NEUROTRAUMA 28:1077–1088 (June 2011)
Factor de impacto de la revista en su área: 1,6
4. Lesión parcial del
SNC
Transepción parcial del nervio
óptico
Lesión primaria
Degeneración
secundaria
Seccionar la cara dorsal
del nervio óptico (lesión
primaria), y estudiar los
axones separados de la
lesión primaria.
5. Pérdida de la homeostasis iónica
Flujo tóxico de calcio intracelular
Degeneración
secundaria
Neurotoxicidad
del glutamato
Disfunción mitocondrial
Agotamiento de la energía
Estrés oxidativo de la energía
Formación de radicales
9. 3) Metodología
Procedimientos animales y quirúrgicos:
Transección parcial del nervio óptico:
•Se tomaron ratas de 150-200 g.
•Se anestesian con 50 mg/kg de clorhidrato de ketamina y 10
mg/kg de clorhidrato de xilazina.
•Exposición del nervio óptico derecho para hacer una incisión
dorsal reproducible, a 200 micras de profundidad, y a 1 mm por
detrás del ojo.
Perfusión
Control
A 1 mes
A 3 meses
Microscopia
electroonica
Inmunohistoquimica
3
3
3
3
3
3
5-6
5-6
5-6
10. 3) Metodología
Microscopía electronica de transmisión
Preparación del tejido
1)Perfusión del tejido.
2)Fijación con 1% de osmio durante 90 minutos en agitación.
3)Deshidratada con series de etanol y óxido de propileno.
4)Curación con resina epoxi 24 h.
5)Secciones transversales de 1 µ m a intervalos de 50 µ m.
6)Desplastificación con solución saturada de NaOH en etanol.
7)Tinción durante 15-30 seg a 95 ° C en solución acuosa al 1%
de azul de toluidina en un 1% de bórax .
8)Identificación y evaluación de la sección con amplificación
de 20 x.
9)Cuantificación con Image J.
10)Análisis de varianza (ANOVA) y test de Bonferroni-Dunn
con un nivel de significación de p ± 0,05.
11)Los cortes ultrafinos (100 nm) fueron teñidas con acetato
de uranilo y citrato de plomo y montado en redes de cobre.
Análisis de axones y mielina
1)Se analizaron axones dentro de 5 campos de visión en el
N.O. central y 5 campos de visión en el N.O. ventral.
2)Toma de imágenes con una magnificación de 5800x.
3)Calculo de los espesores de la vaina de mielina, mediante
la relación g con la ayuda Image J.
4)Calcula del cociente g.
5)Los datos se expresaron como el error estándar de la
media. Las diferencias entre el grupos se determinó
mediante un ANOVA y con test de Bonferroni-Dunn con un
nivel de significación de p ± 0,05.
6)Los ANOVAS se constrastaron con la prueba F, usando
Statview.
11. 3) Metodología
La inmunohistoquímica y la tinción con Fluoromyelin
1) Fijación en paraformaldehído al 4% durante la noche. Crioprotección por
inmersión en sacarosa al 15% en PBS.
2) Inmunohistoquímica: Se secaron al aire las secciones, se rehidrataron en
PBS durante 5 min y con PBS con 0,2% de Triton-X100 durante 10 min.
Incubar durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario. Visualizó con un
anticuerpo secundario de anti-conejo Alexa Fluor 488.
3) Tinción con verde de Fluoromyelin de las muestras: rehidratandolas con
PBS, e incubandose en PBS + 0,2% de Triton-X100 durante 20 minutos. A
continuación, en fluoromyelin (1:300 en PBS + 0,2% de Triton-X100) durante
20 minutos y se enjuagó 3 veces, durante 10 min cada vez, en PBS.
•Las muestras se vieron usando microscopía de fluorescencia.
•Se hicieron controles, sólo con el anticuerpo secundario. Se obtubo una
fluorescencia mínima.
•Cuantificación con ImageJ. Datos se expresaron mediante medias, ANOVA y
test Bonferroni-Dunn, con un nivel de significación del p ± 0,005
12. 3) Metodología
La cuantificación de los axones mielinizados, amielínicas, y
anormalmente mielinizadasLas imágenes TEM se utilizaron para cuantificar y clasificar los
axones y los grados de mielinización anormal.
Tipo de
axones
Grados de mielinización anormal
Compactación
Imagen
Clase 1
Ligeramente mielinizados
Compacto
Baja electrodensidad
(apariencia gris)
Clase 2
Mielinizados: vaina formada por
multipes capas finas de mielina
Descompactados
Moderada electrodensidad
Clase 3
Mielinizados: Una proporción del
axón está envuelto en una capa
espesa de mielina.
Parcialmente
descompactados
Alta electrodensidad
Clase 4
Excesivamente-mielinizadas
Capa muy gruesa y
compacta
Alta electrodensidad
(apariencia oscura)
17. 4) Resultados
Densidad de axones normalmente mielinizadas y el aumento de
los axones anormalmente mielinizadas vulnerables a la
degeneración secundaria
Clase 3
Clase 4
Clase 1
Clase 2
18. 4) Resultados
Densidad de axones normalmente mielinizadas y el aumento de
los axones anormalmente mielinizadas vulnerables a la
degeneración secundaria
Población Densidad de Axones
Axones mielinizados anormalmente
población
total
mielinizados
normalmente
Clase 1
Clase 2
Clase 3
Clase 4
Axones
desmilinizados
Total
Control
673.612 ±
49.618
96,7%
1,6%
0,2%
0,5%
0,1%
0,9%
3,3%
1 mes
447.912 ±
64.192
90%
3,9%
0,4%
0,7%
1,0%
3,6%
10%
3 meses
423.112 ±
45.234
85%
1,9%
1,9%
8,5%
0,3%
2,3%
15%
axons/mm2 (p
± 0,05)
20. 5) Conclusiones
• La transección parcial del nervio óptico da lugar a la
inflamación de la lesión primaria dorsal.
• En la zona vulnerable a la degeneración secundaria se reduce la
mielina debido a la pérdida de axones, y aumentan las
anomalías en la vaina y su compactación. Esto contribulle a la
perdida crónica de función.
• El aumento del diámetro de axón obserbado a los 3 meses
indica inflamación.
• De todos los axones sobreviven mejor los que tienen calibres
grandes.
21. 5) Conclusiones
• La falta de una disminución significativa de la MBP a los 3 meses (en
contraste con la tinción Fluoromyelin), puede ser debido a alteraciones en
la inmunorreactividad con la descompactación.
• Un hallazgo importante es la demostración del aumento de anomalías en la
mielina a medida que progresa la degeneración secundaria, con un
aumento crónico en la mielina parcialmente descompactada.
22. 5) Conclusiones
•Se ha demostrado que la
inflamación del axón, junto
con mayores anomalías en
la mielina contribuyen a la
disfunción crónica del
nervio óptico dañado.
24. 6) Crítica
• Le confiere demasiada importancia en la pérdida de
función, en la degeneración secundaria, a las
anomalias de la mielina y muy poco a la muerte de las
neuronas.
la pérdida de tejido neuronal dañado directamente por la lesión (lesión primaria), y la pérdida generalizada y progresiva de las neuronas no dañadas que residen fuera de la lesión primaria (degeneración secundaria), lo que supone una mayor pérdida de la función.
4) El daño axonal y la degeneración secundaria son también características importantes del glaucoma, y la sección parcial del nervio óptico es un modelo útil para estudiar los cambios en el nervio óptico que se producen en esta enfermedad.
8) Comprender el alcance y la naturaleza de la desmielinización en la degeneración secundaria se requiere para el diseño racional de estrategias terapéuticas.
7) La lomericina, un antagonista específico del canal de calcio del CNS, impide la muerte secundaria de las células ganglionares de la retina tras la transepción parcial del nervio óptico. Aunque no evitó la perdida de la vaina de mielina de los axones vulnerables a sufrir la degeneracíón secundaria, ni tampoco evito la pérdida parcial de la función visual.
11) Los oligodendrocitos tienen una alta tasa metabólica, requerimiento de energía, y el contenido de hierro, lo que hace que las vainas de mielina sean particularmente susceptibles a la degeneración secundaria. De hecho después de una lesión medular, se obserba la desmielización de los axones suceptibles a degeneración secundaria. (eventos secundarios)
1) Los procedimientos deacuerdo al Cuidado de Animales de Laboratorio, y fueron aprobados y monitoreados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Australia Occidental.2) Las ratas se obtuvieron a partir del Centro de Recursos Animales, y se alojaron bajo condiciones de temperatura controlada en ciclos de 12 horas de luz / oscuridad, con acceso a la comida de ratas y agua ad libitum.
13) Se utilizó microscopía electrónica de transmisión (TEM) para examinar el nervio óptico vulnerable a la degeneración secundaria, a 1 y 3 meses después de la transecciónparcial de éste. Examinamos los cambios en el diámetro del axón, el diámetro de la fibra (axón y mielina), y el grosor de la vaina de mielina.
Se usa una rejilla de cobre para definir las regiones constantes de análisis en todos los sectores evaluados.
Se analizaron axones dentro de 5 campos de visión en el N.O. central y 5 campos de visión en el N.O. ventral (las áreas de nervio óptico vulnerables a la degeneración secundaria).
Toma de dos imágenes por cada campo de vista original, con una magnificación de 5800x.
Calculo de los espesores de la vaina de mielina, mediante la relación g (La relación g es una relación de la medida del axón con y sin su vaina de mielina dividido entre 2), con la ayuda del programa Image J.
Calcula del cociente g, como la relación entre el diámetro del axón mínimo dividido popr el diámetro mínimo de la fibra.
Con este cálculo se evita cualquier sesgo artificial de datos debido a la proyección de los axones en un ángulo oblicuo a través de la sección del nervio óptico., ya que los diámetros de los axones se cuantificaron tanto en los los axones normales, como en los anormalmente mielinizados.
Los datos se expresaron como el error estándar de la media (SEM). Las diferencias entre el grupo normal, y los grupos de 1 mes y 3 meses después de la transección parcial se determinaron mediante un ANOVA y con test de Bonferroni-Dunn con un nivel de significación de p ± 0,05.
Los ANOVAS se constrastaron con la prueba F, usando el programa estadístico Statview).
1Fijación en paraformaldehído al 4% durante la noche, crioprotegidos por inmersión en sacarosa al 15% en PBS. Se recogen en portaobjetos Superfrost Plus.
2) Para el análisis inmunohistoquímico de MBP, se secaron al aire las secciones, se rehidrataron en PBS durante 5 minutos y con PBS con 0,2% de Triton-X100 durante 10 minutos antes de incubar durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario. (diluido en PBS + 0,2% de Triton-X100 + 5% de suero normal de cabra). Unión de los anticuerpos se visualizó con un anticuerpo secundario de anti-conejo Alexa Fluor 488.
3) Se realizó una tinción con verde de Fluoromyelin de las muestras, rehidratandolas con PBS, e incubandose en PBS + 0,2% de Triton-X100 durante 20 minutos. A continuación, en fluoromyelin (1:300 en PBS + 0,2% de Triton-X100) durante 20 minutos y se enjuagó 3 veces, durante 10 min cada vez, en PBS.
Las muestras se vieron usando microscopía de fluorescencia. Todas las secciones se tiñeron con fluoromyelin al mismo tiempo, para asegurar la uniformidad de los procedimientos y las imágenes fueron capturadas en los tiempos de exposición constantes sin necesidad de ajustes de software automáticos de ordenador.
5) Se hicieron para todos los experimentos de inmunohistoquímica controles, en los que sólo se tiñeron con el anticuerpo secundario. Se obtubo una fluorescencia mínima.
6) La intensidad de la tinción con fluoromyelin se analizó usando el programa ImageJ. Para evitar el sesgo, todos los análisis los realizó el mismo investigador. De nuevo los datos se expresaron mediante medias SEM, ANOVA y test Bonferroni-Dunn, con un nivel de significación del p ± 0,005
La cuantificación de los axones mielinizados, amielínicas, y anormalmente mielinizadas-
3) La densidad de los axones mielinizados y anormalmente mielinizados se expresa de nuevo como la media SEM en unidades de axons/mm2. Los valores a 1 mes y 3 meses después de la transección parcial se compararon con los valoeres normales por medio de un ANOVA y un test de Bonferroni-Dunn con un nivel de significación de p ± 0,05
El aspecto seccionado dorsal del nervio optico (es decir, la lesión primaria) se formó una protuberancia que consistía predominantemente de células de las meninges y gliales, que se identifican por la morfología y la proteína ácida glial fibrilar (GFAP) inmunohistoquímica.
En el sitio de corte transversal, el área en sección transversal del nervio optico fué determinada (Fig. 2B y C), con las áreas externas que carecen de perfiles axonal (indicado por las líneas punteadas) excluidos del análisis (Fig. 2B-D). En un mes, las áreas transversales fueron similares a la normalidad (p> 0,05), pero aumentó en un 30% a los 3 meses después de la transección parcial (p ± 0,05; Fig. 2A-E).
Las imágenesTEM se generaron a partir de las regiones central y ventral del nervio óptico de los animales normales y los de 1 y 3 meses después de la transección parcial (Fig. 3A-C). Se ha evitado la zona afectada por la lesión primaria. Para esta primera serie de análisis de espesor de mielina, sólo fueron examinados los axones con mielina compacta normal (ejemplos indicados por <en la fig. 3A-C).
No hubo diferencias significativas entre el centro del nervio óptico y la zona ventral en el grosor de la vaina de mielina, el diámetro del axón, el diámetro de la fibra, y la razón g (p> 0,05) tanto en animales normales y aquellos con transección parcial del nervio óptico. Por lo tanto los datos del nervio óptico central y ventral, se combinaron, y se considera que del nervio óptico es vulnerable a la degeneración secundaria.
hinchazón del nervio óptico (2E figuras y 5). Las evaluaciones de la intensidad de fluorescencia por unidad de superficie han ocultado los cambios en la mielina, debido a la hipertrofia considerable de los astrocitos y la infiltración inmune a la lesión dorsal de primaria.
La disminución de la densidad total del axón menos 1 mes se produjo en la cara de ningún cambio en el área general del nervio óptico (Fig. 2E) (derecha).
Con la excepción de los axones ligeramente mielinizadas, cuya densidad no fue significativamente diferente de lo normal, se observaron cambios en las subpoblaciones restantes de los axones abnormallymyelinated.
La disminución de la densidad total del axón menos 1 mes se produjo en la cara de ningún cambio en el área general del nervio óptico (Fig. 2E) (derecha).
Con la excepción de los axones ligeramente mielinizadas, cuya densidad no fue significativamente diferente de lo normal, se observaron cambios en las subpoblaciones restantes de los axones abnormallymyelinated.