Este documento describe el desarrollo de nanopartículas de Au-Fe2O3 funcionalizadas con péptidos para inducir y monitorear la apoptosis en células cancerosas. Las nanopartículas generan especies reactivas de oxígeno que dañan el ADN y activan la apoptosis. Al conjugarse con los péptidos RGD y FITC-DEVD, las nanopartículas pueden dirigirse a células cancerosas y permitir la visualización en tiempo real del proceso de apoptosis mediante la detección de caspasa-

1. Wen Gao, Lifei Ji, Lu Li, Guanwei Cui,
Kehua Xu, Ping Li, Bo Tang
Biomaterials 33 (2012)
Máster de Biomedicina

2. 1)
2)
3)
4)
Introducción
Materiales y métodos
Resultados y discusión
Conclusiones

3. 1)
2)
3)
4)
Introducción
Materiales y métodos
Resultados y discusión
Conclusiones

4. •
•
•
•
•
•
•
•
Apoptosis: mecanismo fisiológico que mantiene la homeostasis de los organismos
multicelulares.
Su desregulación conduce a varias patologías humanas, entre ellas el cáncer.
La inducción de la apoptosis en células cancerígenas es la estrategia más eficaz contra
el cáncer.
Se ha demostrado que ciertas nanoparticulas dañan al DNA y a proteínas, lo que
conduce a la activación de apoptosis.
Una nanoparticula de Fe2O3 de entre 20-40 nm produce radicales hidroxilo altamente
reactivos (*OH).
El *OH puede conducir a daño celular oxidativo y la apoptosis.
Combinando nanoparticulas de Fe3O4 con Au, potenciamos su efecto, debido a:
-Mejora la fluorescencia.
-Interacciona facilmente con los grupos tiol de cisteinas, lo que permite
funcionalizar el Au con diversos peptidos específicos.
En el presente trabajo se van a usar los siguientes peptidos:
• RGD se dirige a las integrinas α v β 3 ,altamente expresados en células
​
tumorales.
• DEVD es el sustrato escindible caspasa-3.
• FITC isotiocianato de fluoresceína.

5. •
•
•
•
•
RGD/FITC-DEVD-Au-Fe2O3, en condiciones fisiológicas, no es fluorescente.
RDG localiza a la celula cancerígena, mediante la integrina α v β 3, de cáncer de hígado.
Una vez dentro provoca la reacción de liberación de los radicales *OH.
Esto activa la apoptosis por estrés oxidativo, y la cascada de caspasas.
La caspasa 3 rompe el enlace del DEVD con el FIT durante la apoptosis, apareciendo la
fluorescencia. Esto permite monitorizar el proceso de apoptosis en tiempo real.

6. 1)
Introducción
2)
Materiales y métodos
3)
4)
Resultados y discusión
Conclusiones

7. Preparación de Au-Fe2O3 soluble en agua
•Las
nanoparticulas de Au se preparan a partir de HAuCl4, calentándolo en 1octadeceno.
•Se añade a las nanoparticulas de Au el Fe (OL)3 formando las nanoparticulas
de Au-Fe3O4.
•Se lava con hexano y etanol (1:2).
•Se repite el lavado con citrato sódico 50 mM.
•Se secan, se centrifugan y se lavan 3 veces con agua desionizada.

8. Preparación de RGD / FITC-DEVD Au-Fe2O3
•Se
inmovilizan los peptidos sobre la superficie del Au, añadiendolos sobre la
disolución de Au-Fe3O4.
•Se deja reaccionar durante 48 h.
•El exceso de RGD y FITC-DEVD se eliminaron por centrifugación a 12000
rpm durante 15 min.
•Las partículas se lavan con agua desionizada 3 veces.
•Se redispersan en PBS (50 mM, pH 7,4).
Caracterización
•Microscopía
electrónica de transmisión (TEM).
•Difracción de rayos X (DRX).
•Espectroscopía IR por TF con Reflectancia Total Atenuada (ATR-FTIR).

9. 2)
Introducción
Materiales y métodos
3)
Resultados y discusión
4)
Conclusiones
1)

10. Caracterización de RGD / FITC-DEVD Au-Fe2O3
•La
imagen TEM mostró particulas monodispersas de
AuFe2O3 de 8 nm y 20 nm.
•La
composición se confirma por DRX.
•La
conjugación con los péptidos se confirma por IR.
IR
Se estudió la estabilidad de RGD/FITC-DEVD-Au-Fe2O3 bajo diversas condiciones
fisiológicas a 37º C:
•En PBS (azul)
•En un buffer con las mismas condiciones que la reacción de la caspasa (rojo)
•En un medio de cultivo (verde)

11. Viabilidad de la RGD/FITC-DEVD-Au-Fe2O3 para catalizar la
formación de *OH y la obtención de las imágenes de la apoptosis
•Mediante
una sonda fluorescente se determina la formación de *OH.
•RGD/FITC-DEVD-Au-Fe2O3 muestra aproximadamente un 9% más de intensidad de
fluorescencia que Fe2O3.
•RGD/FITC-DEVD-Au-Fe2O3 exhiben actividad catalítica mucho más alto que las
nanoparticulas de Fe2O3.
Esta mejora es posible que se deba al efecto
de polarización y a la transferencia de
electrones entre el Au y el Fe.

12. Viabilidad de la RGD/FITC-DEVD-Au-Fe2O3 para catalizar la
formación de *OH y la obtención de imágenes de la apoptosis
Se prueba la capacidad de RGD/FITC-DEVD-Au-Fe2O3 para la detección de caspasa-3.
•Sin caspasa-3, el complejo es muy estables
(negro).
•Al añadir la caspasa-3, aumenta aprox. 5,6
veces en la intensidad de la fluorescencia
(rojo).
•Al añadir al control (azul) el inhibidor de caspasa,
se bloquea el aumento de la fluorescencia.
Existe una relación proporcional entre las señales de fluorescencia y las concentraciones
de la caspasa-3.

13. Seguimiento de la apoptosis en tiempo real
•Se
estudia la citotoxicidad en la linea celular HepG2 (rojo) y
en HL7702 (negro).
Para probar que la generación de OH es el desencadenante de la apoptosis, se utilizó
TEMPO-BDP para caracterizar la nueva generación de *OH inducida por las
nanoparticulas en:
-HepG2 (rojo)
-HL7702 (negro)
La intensidad es un 70% mayor en las células HepG2 debido a que poseen la integrina
α v β 3.

14. Seguimiento de la apoptosis en tiempo real
Las células HepG2 fueron incubadas con TEMPO-DPB para visualizar el *OH generado.

15. 3)
Introducción
Materiales y métodos
Resultados y discusión
4)
Conclusiones
1)
2)

16. •
•
•
•
Se ha informado sobre el uso de nanoparticulas de Au-Fe2O3 en la
inducción de la apoptosis a células específicas cancerígenas, y la
imagen en tiempo real del proceso de apoptosis.
El Au potencia las propiedades ópticas y catalíticas de las
nanoparticulas de Fe3O4 (Debido a un efecto de polarización).
Conjugado con los péptidos RGD y FITC-DEVD, se puede visualizar
el proceso de la apoptosis inducida por *OH in vitro.
La funcionalización superficial las nanoparticuas de Au-Fe2O3
puede servir como una plataforma multifuncional para el
tratamiento y diagnóstico del cáncer.