1) El documento trata sobre la eliminación de cúmulos de hidrocarburos y ácidos grasos en el drenaje del área metropolitana de Monterrey mediante la bacteria Rhodococcus erythropolis. 2) Rhodococcus erythropolis es una bacteria que puede degradar hidrocarburos y grasas a través de procesos de biorremediación. 3) Los estudiantes proponen utilizar esta bacteria para eliminar los cúmulos que se forman en las tuberías de drenaje debido a la acumulación de residuos de grasas y aceites

1. UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ELIMINACIÓN DE CÚMULOS DE HIDROCARBUROS Y
ÁCIDOS GRASOS EN DRENAJE DEL ÁREA
METROPOLITANA DE MONTERREY MEDIANTE
BIORREMEDIACIÓN CON RHODOCOCCUS
ERYTROPHOLIS.
Proyecto para acreditar el curso de Metodología Científica
Evidencia 6
Grupo 455, Equipo 1
Balli Morales Nahomy 1803547
Hernández González Angel Daniel 1923675
Vázquez Juárez Juan Maximiliano 1957770
Gómez Patiño José Rodrigo 1962138
De la Cruz Galván Laura Alicia 2075704
Profesor: Dr. Jesús Montemayor Leal
San Nicolás de los Garza, N.L. Noviembre,19, 2022

2. Introducción
Los desbordamientos de aguas residuales en los sistemas de recolección de
alcantarillado suelen ser por la acumulación de grasas y aceites provenientes de los
desagües de hogares, negocios y empresas que no cuentan con un correcto
proceso de desecho de grasas. Estas grasas y aceites al enfriarse se pegan a las
tuberías del alcantarillado restringiendo o bloqueando el flujo haciendo que el agua
salga de las alcantarillas hacia las calles públicas, desagües pluviales y ríos
provocando problemas para la salud pública. (Concord general services,2020)
La biorremediación es un proceso que se basa en el uso de agentes biológicos,
como los microorganismos, en la descontaminación del medio ambiente. Debido a
su gran diversidad metabólica, las bacterias del género Rhodococus son candidatas
para ser utilizadas en bioprocesos. (Sánchez, N, Sandoval, AH, Díaz-Corrales, F, &
Serrano, JA. ,2004). Rhodococcus erytropholis es una bacteria perteneciente a la
clase de Actinobacteria y a su vez, forma parte del orden de Actinomicetales. Los
actinomicetos son bacterias filamentosas ampliamente distribuidas en el medio
ambiente, son microorganismos heterótrofos, aerobios y crecen de forma óptima en
un rango de PH de 5.0 a 9.0, crecen en un rango de temperatura de 25 a 30°C.
Estas bacterias han sido estudiadas debido a su participación en procesos de
fitorremediación Son relacionadas con una gran variedad de procesos de
biodegradación de suelos contaminados con hidrocarburos. (González
Jimenez,2010)
Definición del problema
El mal manejo de los residuos de grasas y aceites provenientes de hogares,
restaurantes e industrias como causantes de cúmulos de ácidos grasos en las
tuberías del drenaje pluvial provocando el desbordamiento de estos.
Justificación
Los cúmulos de grasas que se forman al desechar los residuos de grasas y aceites
de manera no adecuada por los desagües afectan en la actividad óptima del sistema
de alcantarillado provocando desbordamientos de aguas negras hacia las calles
públicas y/o almacenamientos de agua potable y ríos provocando serios problemas
de salud pública así como problemas económicos al tener que utilizar recursos
económicos para la reversión de estos problemas de salud y de mal funcionamiento
del drenaje pluvial.
Los beneficios de la resolución de este problema traería consigo la disminución de
personas infectadas por la ingestión de agua contaminada, así como la solución al
problema de desbordamientos en lugares públicos por aguas negras, además de

3. que habría una reducción de costos en el tratamiento de este problema y en la
reparación de daños.
Las personas de la comunidad serían los más beneficiados al reducir el riesgo de
infecciones y encharcamientos en lugares públicos, permitiendo así una mejor
circulación de peatones y vehículos.
Antecedentes
Fat, oil and grease (FOG)
1. Cúmulos de hidrocarburos y ácidos grasos en el drenaje
1.1 Formación de FOG en sistemas de alcantarillado
En el primer estudio para caracterizar su composición física y química
(Keener et al., 2008), se encontró que los depósitos de FOG en el sistema
de recolección de alcantarillado tenían una textura granulosa y similar a la
arenisca. El color general de los depósitos de FOG varió de marrón claro a
blanco.
Keener et al. (2008) observaron un alto contenido de lípidos, siendo el ácido
graso primario el palmítico. Otros ácidos grasos como el oleico y el linoleico
se encontraron en cantidades significativas en estos depósitos de FOG.
Fuera de los ácidos grasos, el calcio fue el metal más abundante encontrado
en los depósitos de FOG.
Un estudio de laboratorio ha demostrado que la mayoría de los ácidos grasos
de cadena larga producidos en los interceptores de grasa se deben a
actividades microbianas, que contribuyen potencialmente a la formación de
depósitos de FOG en las líneas de alcantarillado (He y Yan, 2016).
1.2 Fuentes de componentes involucrados en la formación de depósitos
de FOG
Los ácidos grasos libres se generan principalmente a partir de la hidrólisis de
FOG. Durante el proceso de cocción (p. ej., freír, hornear y asar a la parrilla),
se ha descubierto que la hidrólisis rápida genera ácidos grasos libres tan
pronto como la grasa entra en contacto con la humedad (Canakci, 2007).
En su trabajo, Ducoste et al., (2008) identificaron a los restaurantes asiáticos
como uno de los principales contribuyentes de FOG en los Estados Unidos,
seguidos por los restaurantes de mariscos y los establecimientos de comida
rápida.
Además de las fuentes basadas en alimentos, los productos de jabón pueden
ser el principal contribuyente a la presencia de ácidos grasos libres en los

4. sistemas de alcantarillado, que incluyen jabones duros, así como jabones y
geles para afeitar para hombres. Sin embargo, no se han encontrado ácidos
grasos libres en detergentes para ropa o productos de limpieza de cocinas
(Szostak, 2013).
Una encuesta exhaustiva de municipios en Noruega y Suecia mostró que las
áreas residenciales tenían el segundo mayor número de problemas
relacionados con FOG después de los centros urbanos, especialmente en
las áreas de edificios de gran altura (Mattsson et al., 2014).
Se sugirió que la generación preferencial de ácidos grasos saturados durante
la cocción y la descomposición preferencial de los ácidos grasos insaturados
por parte de las lipasas podría conducir a la generación de ácido palmítico
en las aguas residuales (Iasmin et al. 2014).
En 2014, Mahbuba L.; O. Dean S; . Lappi J;& J. Ducoste trabajaron para
cuantificar los factores que pueden afectar la formación de depósitos de FOG
y sus propiedades químicas y reológicas. Estos factores incluyen los tipos de
grasas utilizadas en los FSE, las condiciones ambientales (es decir, pH y
temperatura) y la fuente de calcio en los sistemas de alcantarillado. Los
resultados de este estudio mostraron que el contenido de calcio en las sales
a base de calcio parecía depender del límite de solubilidad de la fuente de
calcio e influenciado por las condiciones de pH y temperatura
2. Rhodococcus erythropolis y la biorremediación
2.1 Procesos biológicos para la eliminación de FOG
Brooksbank et al. (2007) demostraron que un suplemento de varias especies
era capaz de mejorar significativamente la degradación de varias grasas y
aceites en un 37-62 % después de incubarse durante 28 días.
Nisol et al. (2009) observaron que la bioaumentación resultó en una
diferencia significativa en la eficiencia de eliminación de FOG cuando la
concentración de FOG afluente fue superior a 5000 mg/L durante un
experimento a escala de laboratorio de 16 días.
He et al. (2012) realizaron una evaluación de dos interceptores de grasa a
gran escala, con y sin bioaumentación, durante un período de un año y
demostraron que las concentraciones generales de FOG en el efluente del
interceptor de grasa en ciclos bioaumentados no eran inferiores a las de los
ciclos de control.

5. Tang et al. (2012) observaron que los ácidos grasos totales se redujeron en
un 59 % en el efluente del interceptor de grasa y la formación de depósitos
de FOG se redujo en un 40 % en las tuberías de alcantarillado después del
tratamiento de un interceptor de grasa con un bioaditivo durante tres meses.
Klaucans et al. (2018) mencionan que la biodegradación de FOG involucra
múltiples enzimas consistiendo en lipasas, esterasas, proteasas, y amilasas.
También dan como ejemplo la creación de una lipasa recombinante
proveniente de E. coli que es capaz de mantener su actividad en condiciones
adversas.
Poh et al. (2016) describen el proceso de digestión anaeróbica de aguas
residuales como el uso de microorganismos para la degradación de materia
orgánica, como los lípidos, en la ausencia de oxígeno. Este proceso involucra
una secuencia de reacciones, incluyendo hidrólisis, acidogénesis,
acetogénesis y metanogénesis.
2.2 Rhodococcus erythropolis en la biorremediación
Pucci et al. (2013) realizaron una investigación en la que utilizaron R.
erythropolis para limpiar barros contaminados con petróleo provenientes de
estaciones de servicio; concluyeron que R. erythropolis presentó un
excelente potencial de biorremediación de hidrocarburos como lo son los
aceites lubricantes, su posible empleo en la eliminación de barros
provenientes de lavados de motores o de estaciones de servicio sería su
aplicación más importante.
De acuerdo a Peng et al. (2007) se encontró que Rhodococcus erythropolis
produce tensoactivos utilizando hidrocarburos no solubles en agua. Al extraer
Rhodococcus erythropolis y proporcionar n-hexadecano como fuente de
carbono, encontraron que se produce ácidos grasos libres y glicolípidos.
Kis et al (2015) llevaron a cabo un estudio en el que prueban la habilidad de
Rhodococcus erythropolis para degradar grasas animales y aceites
vegetales y se encontró que la bacteria fue capaz de utilizar todos los
substratos dados pero la eficiencia para la degradación de cada uno depende
de las condiciones ambientales, pero con poca variación.
3. Otros métodos capaces de degradar grasas

6. Los investigadores han sugerido que es necesario un tiempo de retención
hidráulica (TRH) de 30 minutos o más para eliminar adecuadamente el FOG
(Metcalf & Eddy, 1991).
Los investigadores han sugerido que los cambios físicos, como la
disminución de la longitud de la tubería de entrada, el uso de expansiones de
tubería de entrada y salida, conexiones en T distributivas y otros accesorios
que se pueden agregar fácilmente a los interceptores de grasa existentes,
pueden conducir a mejoras significativas en la eficiencia de eliminación de
FOG (Aziz et al., 2011).
La actividad microbiana es otro contribuyente a la producción de ácidos
grasos en los sistemas de alcantarillado. Los investigadores han identificado
numerosos microorganismos capaces de degradar FOG utilizando lipasas
extracelulares (Brooksbank et al., 2007; Kis et al., 2015).
GI Boiko et al (2021) desarrolló un método de purificación que incluye la
adición de un coagulante a base de un componente que contiene aluminio,
seguido del espesamiento y filtración del precipitado. Se usó aleación de
aluminio Rau-85 como componente que contiene aluminio. La aleación de
aluminio se utiliza en forma de polvo estable en el aire. Composición de la
aleación (% en peso): 85 aluminio, 5 indio, 5 galio y 5 estaño. El método se
lleva a cabo en una etapa, es amigable con el medio ambiente, ya que no
requiere grandes cantidades de coagulantes (10-50 g/t). Cuando la aleación
se agrega al agua residual aceitosa, interactúa activamente con el agua con
la formación de un precipitado de hidróxidos metálicos que absorben
moléculas de aceite contaminantes.
Este año (2022) Sudipti Arora, Sakshi Saraswat ,A.A. Kazmi desarrollaron
una propuesta para un biofiltro con lombrices y que cuida casi todos los
criterios sostenibles y económicos para su efectiva implantación. Se puede
apreciar por el hecho de que las lombrices digieren todas las partículas en
suspensión tamizadas en el lecho del filtro, y degradan la materia orgánica,
y en el proceso de ingestión; airea pasivamente el sistema mediante la acción
de excavación y elimina los patógenos.
4. Medidas que se han tomado
4.1 En Ecuador

7. Los autores León D., & Salcedo L. En 2006 elaboraron un ensayo en el que
presentaban su propuesta de realizar una contratación de personal por medio
de empresas tercerizadoras para la empresa municipal de agua potable y
alcantarillado de la ciudad de Azogues EMAPAL.
4.2 En México
La JAPAC exhortó a la población de Culiacán en 2017 a tomar medidas en
contra los hundimientos ocurridos en ese año debido a la basura acumulada
en el drenaje, presento estos consejos: “No desechar en el sistema de
desagües, elementos sólidos que perturben el funcionamiento de las
instalaciones, dado que las conexiones están diseñadas y construidas para
permitir solamente el paso de líquidos o disposiciones excretas, etc....”
En el 2021 el centro de investigación y asistencia en tecnología del estado
de jalisco desarrollaron un proyecto para implementar la transparencia en la
toma de decisiones de los recursos; la participación y la responsabilidad en
la elaboración de presupuestos y la planificación a nivel nacional, estatal y
municipal; y la planificación de la reutilización de las aguas residuales
tratadas para reducir las extracciones de aguas subterráneas y reducir los
vertidos a las aguas superficiales
En una situación similar protección civil representado por José Carlos
Espinoza Espinoza en 2022, a consejo a las personas de no tirar basura a
los desahogues porque se avecinaba temporada de lluvias lo que traería
consigo inundaciones y precipitaciones.
4.3 En Colombia
En Arauca, Colombia debido a las malas prácticas de los civiles con su
basura, tienden a sufrir de inundaciones del alcantarillado, por lo cual, el
ingeniero Pascito Ramírez en el presente año, recomienda a los usuarios no
depositar restos de comidas, servilletas, ni tampoco aceites en los lavaplatos;
no arrojar papel higiénico, ni toallas higiénicas, ni algodones, cabellos y
objetos sólidos al sanitario sino a la caneca de la basura; y que
frecuentemente se vierta agua caliente a los desagües y cañerías de las
viviendas
5. Efectos contraproducentes
5.1 Infecciones oportunistas

8. Fue identificado por Sánchez N., Sandoval A., Díaz F. Serrano J. en 2004,
los procesos infecciosos causados por diferentes especies del género
Rhodococcus. El principal patógeno reconocido dentro de este género es
Rhodococcus equi, aunque otras especies como Rhodococcus luteus,
Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous y Rhodococcus
globerulus también han sido descritas como agentes causantes de
infecciones, sobre todo a nivel cutáneo y de la córnea.
Recientemente, se ha observado como agente patógeno en los estudios de
Ito C. en 2017 donde en circunstancias específicas es posible que cause
septicemia en personas inmunodeprimidas.
5.2 Lipasas y sus efectos a la salud
Aunque se considera que no existen muchos estudios que señalan su
seguridad, el artículo de LaVozdeEcuadorⓇdeterminó en 2022 que puede
causar reacciones alérgicas, problemas gastrointestinales e incluso efectos
neurológicos.
Objetivo general.
Dar solución a la problemática causada por los cúmulos de ácidos grasos de las
alcantarillas del sistema de drenaje público del área metropolitana de Monterrey
mediante biorremediación con los procesos bioquímicos que presentan las
bacterias del género Rhodococcus erythropolis.
Objetivos específicos:
● Desarrollar un método de degradación de cúmulos de ácidos grasos e
hidrocarburos mediante enzimas extraídas de Rhodococcus erythropolis
● Comprobar que este método sea reproducible y utilizable a escala masiva
para la degradación de cúmulos de ácidos grasos en sistemas de drenaje
● Identificar los riesgos que conlleva el utilizar este método y presentar
soluciones en caso de que estos riesgos estén presentes.
Hipótesis
Hipótesis Nula

9. Las enzimas extraídas de Rhodococcus erythropolis no son capaces de degradar
eficientemente los cúmulos de hidrocarburos y ácidos grasos en el sistema de
drenaje público de Monterrey.
Hipótesis Alterna
Las enzimas extraídas de Rhodococcus erythropolis son capaces de degradar
eficientemente los cúmulos de hidrocarburos y ácidos grasos en el sistema de
drenaje público de Monterrey. Liberando una descarga significativa de
acumulaciones de material contaminante en el sistema de drenaje.
Materiales
● Sonicador Branson Sonifier (VWR Company), con las siguientes
indicaciones: Output control: 7, Duty Cycle: 60, Time: 10 minutos.
● Bacteria Rhodococcus erythropolis, obtenida de la American Type Culture
Collection (ATCC No. 4277).
● Medio de crecimiento: ATCC medium: 1877 ISP Medium 1; Composición:
Triptona (BD 211705) 5,0 g; Extracto de levadura 3,0 g; Agar 15,0 g; Agua
destilada 1,0 L.
● Tritón X-100
● Desecador
● Matraz Erlenmeyer
● Pipetas
● Cajas petri
● Centrifugadora
Metodología
Material biológico

10. Preparación de medio de crecimiento
1. Inocular Rhodococcus erythropolis en los medios de cultivo.
2. Colocar los medios de cultivo en un desecador saturado con monóxido de
carbono, con agitación constante a 30 ºC.
3. Esperar 96 horas, tiempo necesario para que las células alcancen la fase de
crecimiento exponencial.
Material Químico
Extracción enzimática
1. A un cultivo bacteriano crecido de 200 ml, agregar lisozima (2 ml por cada 25 ml
de suspensión bacteriana), preparada en 0.89 g de NaCl y 100 ml de agua destilada.
2. Colocar las bacterias con lisozima en un baño maría durante 12 horas a 40 ºC.
3. Completar el rompimiento celular por sonicación.
4. Someter a sonicación un volumen final de 5 ml de la suspensión celular tratada
con lisozima.
5. Colocar la muestra en hielo mientras se somete a sonicación, con el objetivo de
evitar su calentamiento.
6. Los períodos de sonicación fueron de dos minutos con un período de descanso
de 30 segundos.
Obtención de la muestra
1. Identificar por medio de fuentes oficiales del sistema de agua y drenaje de
Monterrey, las principales ubicaciones que estén relacionadas con problemas de
acumulacion de cumulos de grasa.
2. Una vez identificadas las ubicaciones, se realiza una recolección de muestra
utilizando un Auto-sampler para comprobar que la acumulacion esta hecha por
cumulos de grasa.
3. Cuando las muestras positivas hayan sido seleccionadas, deberá obtenerse una
muestra mensual durante el tratamiento en campo. Esto solamente se llevará a cabo
si la enzima utilizada es útil para el tratamiento de cúmulos de grasa.
Técnicas utilizadas

11. Purificación de los extractos enzimáticos crudos (Solubilización con el
detergente Tritón X-100)
1. Agregar 200 mL de Tritón X-100 al extracto enzimático después de la sonicación.
2. Homogenizar la solución.
3. Centrifugar a 10.000 rpm durante 45 minutos en una centrífuga refrigerada.
4. Tomar el sobrenadante.
5. Retirar el detergente remanente mediante diálisis.
Aislamiento de bacterias
1. Agregar 2gr de la muestra del suelo a un matraz Erlenmeyer de 250 ml que
contenga 50 ml de un medio de sal mineral (MSM, Ph 7,4)
2. Agregar 0.5 g de extracto de levadura y solución de oligoelementos( ZnSO4 ,
0,29 g; CaCl2 , 0,24 g; CuSO4 , 0,25 g; MnSO4 , 0·17 g l -1
)
3. Verter 5.5 ml de agua destilada.
4. Como única fuente de carbono, agregar n-hexadecano al 2% v/v.
5. Esterilizar por filtración.
6. Realizar el enriquecimiento a 28°C a 150 rpm durante 5 días.
7. Aislar un cultivo puro en una placa de agar Luria-Bertani.
8. Confirmar degradación de aceite mediante la degradación del aceite en un
MSM líquido que contenga n-hexadecano.
Prueba de degradación de cúmulos in vitro.
1. Realizar un aislamiento de los cultivos utilizando únicamente los cúmulos
obtenidos de las recolecciones en campo como fuente de energía y carbono.
2. Registrar la degradación en las cepas cada día por un mes.
*Si los resultados son favorables y efectivamente existe una degradación
significativa de este contaminante; el experimento podrá llevarse a cabo
utilizando una mayor cantidad de cúmulos de grasa para simular la
contaminación en los sistemas de drenaje seleccionados.

12. Prueba de resistencia enzimática
Temperatura
1. Someter 3 grupos de 100mL de la solución enzimática a ambientes
con temperatura de 2°C, 15°C y 30°C. (Temperaturas comunes en el
el A.M.M)
2. Esperar 1 día y medir pureza mediante el uso de inhibidores
específicos a la enzima
pH
1. Preparar 3 vasos con 100mL de la solución enzimática y agregar 20g
de una muestra de cúmulo de grasa
2. En el primer vaso agregar gradualmente un ácido fuerte y observar a
qué pH disminuye la actividad enzimática mediante un pH-metro
3. En el segundo vaso agregar gradualmente una base fuerte y observar
a qué pH disminuye la actividad enzimática mediante un pH-metro
4. Mantener el tercer vaso a pH neutro como control
Tiempo
1. Preparar 3 vasos con 100mL de la solución enzimática
2. Guardar los vasos por 1 día, 3 días y 6 días respectivamente
3. Medir la pureza enzimática mediante el uso de inhibidores específicos
a la enzima
Análisis estadístico
Chi-cuadrada para determinar la degradación en las placas
1. Se inocularon 20 platos diferentes con Rhodococcus Erytopholis.

13. 2. Se registraron las placas que se habían degradado a través de un año dividido
en meses.
3. Determinamos las hipótesis, Ho: No hubo degradación; Ha: Si hubo degradación
4. Una vez anotadas las cantidades de placas que presentaron degradación las
agrupamos en 12 grupos (Ene - Dic).
5. Los datos se deben agrupar en una tabla de datos observados y posteriormente
calcularemos los “datos esperados” en otra tabla con esta fórmula Ei = (n1 *n2) / n
6. Calculamos X2 = (Oi - Ei)^2 / Ei, para sacar el dato calculado.
7. Definimos el valor de tablas X2 utilizando el valor crítico.
8. Comparamos el valor calculado con el valor crítico y hacemos la decisión
estadística
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