La saliva es una muestra confiable y no invasiva para la detección del SARS-CoV-2 - MEDICINA HUMANA - UANCV - 2020

1. La saliva es una muestra
confiable y no invasiva para
la detección del SARS-CoV-2
PRESENTADO POR : Quispe Terán, Abby Cezi
Sara Nunes Vaz(a) Daniele Souza de Santana(a)
Eduardo Martins Netto(a) Celia Pedroso(a) Wei-
Kung Wang(b) Felice Deminco Alves Santos(a)
Carlos Brites(a)
a. Universidade Federal da Bahia (UFBA), Hospital Universitário
Professor Edgard Santos (HUPES), Laboratório de Pesquisa em
Infectologia (LAPI), Salvador, BA, Brazil
b. University of Hawaii at Mānoa (UH Manoa), Department of
Tropical Medicine, Medical Microbiology and Pharmacology,
Hawaii, USA

2. INTRODUCCIÓN
En diciembre de 2019,
China informó sobre el
síndrome respiratorio
agudo severo
Coronavirus 2 (SARS-
CoV-2)
La transmisión
directa de persona
a persona del
SARS-CoV-2 se
produce a través de
la inhalación de
gotitas al toser,
estornudar o incluso
hablar, y también es
posible la
transmisión
causada por el
contacto con las
membranas
mucosas nasales,
oculares y orales.
Síntomas clínicos asociados
al COVID-19 son fiebre, tos,
dificultad para respirar, dolor
de garganta, dolor de pecho,
dolor de cabeza, anosmia y
ageusia. El 80% de los casos
presenta síntomas leves o
leves, el 20% restante puede
presentar una enfermedad
grave y alrededor del 5%
requerirá tratamiento en
cuidados intensivos,
especialmente aquellos con
enfermedades crónicas como
cardiopatía, hipertensión
arterial, diabetes y obesidad.
La reacción en cadena
de la polimerasa con
transcripción inversa en
tiempo real (qRT-PCR)
de muestras
respiratorias (hisopos
orofaríngeos y
nasofaríngeos, lavado
broncoalveolar, aspirado
traqueal) es la prueba
estándar de oro para la
detección de la infección
por SARS-CoV-2.

3. INTRODUCCIÓN
Sin embargo, estos
procedimientos causan
molestias debido a la
invasividad del
procedimiento, lo que
puede reducir la
posibilidad de que el
paciente dé su
consentimiento para
repetir la prueba y puede
representar un riesgo
considerable para los
trabajadores de la salud,
debido a su potencial
para inducir a los
pacientes a estornudar. o
tos, expulsando
partículas de virus.
El uso de saliva como
muestra diagnóstica tiene
varias ventajas, como la fácil
autocolección, es mucho más
cómoda, también ahorra
tiempo y es menos costoso,
ya que no requiere el uso de
equipo de protección
personal ni solución de
transporte viral.
Las muestras
oportunas, precisas
y no invasivas para
la detección del
SARS-CoV-2
facilitarán medidas
eficaces de control
de pandemias a
gran escala para
prevenir la
propagación de
COVID-19.
El objetivo de este
estudio fue validar el
uso de saliva como
muestra biológica
para el diagnóstico
de COVID-19.

4. Población de estudio
• Realizado en el Laboratorio de
Investigación de Enfermedades
Infecciosas (LAPI), del Profesor
Edgard Santos (C-HUPES) del
Complexo Hospitalar, Universidad
Federal de Bahía, en Salvador,
Brasil.
• Los trabajadores de la salud de C-
HUPES que presentaban signos /
síntomas que sugerían infección
por SARS-CoV-2, así como los
pacientes de la sala COVID-19 de
C-HUPES, se sometieron a (NPS) y
/ o (OPS).
• Todos los participantes reclutados,
después de firmar el consentimiento
informado, se les pidió que
proporcionaran una muestra de
saliva recolectada por ellos mismos.
Colección de muestra
• Las muestras de saliva se
recogieron en vasos de orina
estériles de 30 ml. A los
participantes se les indicó que
escupieran repetidamente hasta
obtener aproximadamente 2 ml de
muestra.
• Las muestras se transportaron a
LAPI en una caja térmica a 2-8 ° C
y se almacenaron a -80 ° C hasta la
extracción del ácido
nucleico. Siempre que fue posible,
el ARN se aisló de la saliva fresca
dentro de las seis horas posteriores
a la recolección.
Procesamiento de muestras y
aislamiento de ácidos nucleicos
virales
• Las muestras se homogeneizaron
pipeteando repetidamente y se
diluyeron 1: 1 con PBS 1x (solución
salina tamponada con fosfato)
antes del aislamiento del ARN.
• El aislamiento de ARN se realizó
utilizando QIAGEN QIAamp® RNA
Mini Kit. Se extrajo ácido nucleico
viral de 140 µl de saliva diluida y se
eluyó hasta 60 µl de tampón de
elución.
• Se realizaron pruebas de grupos de
muestras con una muestra positiva
y cuatro muestras negativas y una
muestra positiva y nueve
negativas. Se incluyeron muestras
positivas (RT-Real Time PCR) con
baja carga viral y alta carga viral.
MATERIALYMÉTODOS

5. MATERIALYMÉTODOS
RT-PCR en tiempo real
• Las muestras nasofaríngeas y
orofaríngeas se enviaron al
Laboratorio Central de Bahía
(LACEN)
• Para las muestras de saliva, la
plantilla de ARN se sometió a
amplificación de acuerdo con el
protocolo Charité-Berlin.
• Las reacciones de amplificación se
llevaron a cabo en el detector
Applied Biosystems 7500 Real Time
PCR, y los resultados se
clasificaron como positivos para el
SARS-CoV-2 cuando se detectaron
los genes E y RdRp y el umbral de
ciclo los valores eran menores o
iguales a 40.
Ensayo inmunológico
• Para confirmar la ausencia de
infección por SARS-CoV-2 en
algunos resultados discordantes, se
realizó un ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas
(Euroimmun, Lüebeck, Alemania).
• Se intentó la detección de
anticuerpos IgG en muestras de
plasma recolectadas después de
tres semanas de la aparición de los
síntomas
Análisis estadístico
• La estadística descriptiva se
presentó como porcentaje (%) para
las variables categóricas y mediana
para las variables continuas.
• Se utilizaron las pruebas de Fisher
y Mann-Whitney para variables
categóricas y continuas,
respectivamente.
• Se calcularon la sensibilidad, la
especificidad, el valor predictivo
positivo, el valor predictivo negativo
y un intervalo de confianza (IC) del
95% para acceder al rendimiento
diagnóstico.
• El coeficiente kappa se utilizó para
estimar la concordancia más allá
del azar entre la saliva y los
resultados de RT-PCR de NPS /
OPS. Todos los análisis estadísticos
se realizaron con SPSS versión
18.0.

6. RESULTADOS
Entre el 5 de
mayo y el 5 de
junio de 2020,
se reclutaron
155
participantes y
se recolectaron
muestras de
pares de NPS /
OPS y saliva.
En general (n = 149) COVID-19 (n = 67) No COVID 19 (n = 82) valor p
Edad (años), mediana (IQR) 40 (33-48,5) 40 (35−50) 39,5 (33-48,3) 0.588
Hombre, n. (%) 46 (30,9) 23 (34,32) 23 (28,04) 0.470
Inicio de los síntomas antes de la
prueba (días), mediana (IQR)
4 (3−6) 4 (3−6) 4,5 (3−6) 0.548
Síntomas en la recolección de muestras
Cefalea, n (%) 82 (61,2) 33 (53,2) 49 (68,1) 0.109
Tos, n (%) 60 (45,1) 30 (49,2) 30 (41,7) 0.484
Mialgia, n (%) 54 (40,3) 25 (40,3) 29 (40,3) 1
Dolor de garganta, n (%) 50 (37,3) 14 (22,6) 36 (50) 0,001
Fiebre, n (%) 37 (27,6) 25 (40,3) 12 (16,7) 0,003
Anosmia, n (%) 29 (21,6) 20 (32,3) 9 (12,5) 0,007
Ageusia, n (%) 28 (20,9) 18 (29,0) 10 (13,9) 0,035
Escalofríos, n (%) 27 (17,9) 10 (16,1) 14 (19,4) 0,658
Dolor de pecho, n (%) 18 (13,4) 9 (14,5) 9 (12,5) 0,802
Disnea, n (%) 16 (11,9) 9 (14,5) 7 (9,7) 0.433

7. RESULTADOS
La prevalencia de COVID-19
diagnosticada por NPS / OPS RT-
PCR y por RT-PCR de saliva en
este estudio fue del 45,8% y
43,22%, respectivamente. La
mayoría de los trabajadores
sanitarios evaluados (51,6%) eran
enfermeras / técnicos de
enfermería.
Utilizando RT-PCR de muestras de NPS / OPS
como estándar de oro, la sensibilidad y
especificidad de la RT-PCR con muestras de
saliva fueron 94,4% (IC 95% 86,4-97,8) y 97,62%
(IC 95% 91,7 - 99,3), respectivamente. El valor
predictivo positivo y el valor predictivo negativo
fueron del 97,1% (IC del 95%: 90,0 a 99,2) y del
95,35% (IC del 95%: 88,6 a 98,2),
respectivamente.
La tasa de detección de SARS-CoV-2 en la
saliva fue ligeramente menor que la de NPS /
OPS, pero sin alcanzar significación
estadística. Seis participantes tuvieron
resultados discordantes entre los ensayos de
RT-PCR de saliva y NPS / OPS, incluidos dos
participantes con virus detectado en saliva pero
no en NPS / OPS, y cuatro participantes con
virus detectado en NPS / OPS pero no en saliva
Después de 20 días de la aparición de los
síntomas, se invitó a los participantes con
resultados negativos de saliva (n = 4) a
recolectar nuevas muestras de sangre
para detectar anticuerpos anti-SARS-
CoV-2. La IgG fue reactiva en todos
menos en uno, lo que confirma que al
menos un paciente probablemente no
había sido previamente infectado por el
SARS-CoV-2.

8. DISCUSION
 Los hallazgos demuestran que analizar la saliva como alternativa a los
hisopos de NP es lo suficientemente sensible y específico para usarse en
una práctica de rutina. La concordancia entre los resultados de RT-PCR
para la detección de SARS-CoV-2 en saliva y los hisopos de NP fue del
96,1%.
 El uso de hisopos NP ha sido el estándar de atención para el diagnóstico de
SARS-CoV-2 en Brasil, pero requiere el uso de equipo de protección
personal completo, aumenta el riesgo de infección para el profesional de la
salud que recolecta la muestra, y también, el costo de la prueba.
 En el presente estudio, la saliva fue recolectada por los participantes dentro
del área del hospital. A pesar de la recomendación de algunos autores a
utilizar las muestras recogidas inmediatamente después de despertarse, y
sin el consumo de alimentos anterior o cepillarse los dientes, la saliva se
recogieron en cualquier momento
 El alto nivel de concordancia entre los dos métodos demuestra que el uso
de saliva para detectar el SARS-CoV-2 por RT-PCR es tan confiable como
el uso de hisopos NP / OP, pero con menores costos y riesgos.

9. CONCLUSIÓN
 Se demostró que el uso de muestras de saliva recolectada por uno mismo es
una alternativa fácil, conveniente y de bajo costo
 El uso de muestras de saliva tiene varias ventajas para la detección del
SARS-Cov-2:
1. El paciente puede proporcionar saliva fácilmente sin ningún
procedimiento invasivo. Por tanto, podría reducir el riesgo de
transmisión del virus a los profesionales sanitarios.
2. El uso de saliva permitirá la recolección de muestras fuera de las áreas
de hospitales o centros de salud.
3. Podría combinarse convenientemente para seleccionar poblaciones
más grandes. En estos entornos, donde una gran cantidad de personas
requieren detección, la saliva representa un tipo de muestra práctico y
no invasivo.
 Los resultados pueden permitir un uso más amplio de las pruebas
moleculares para el manejo de la pandemia COVID19, especialmente en
entornos con recursos limitados.