Memoria de practicas

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MEMORIA DE LAS PRÁCTICAS EXTERNAS CURRICULARES
Juan Carlos Garrigues Mafé
Licenciatura de Ciencias Biológicas

ÍNDICE:
1.INTRODUCCIÓN:………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..1
2-Recepción de muestras biológicas: .............................................................................................................................................................................3
2.1-Registro de muestras. ...........................................................................................................................................................................................3
2.2- Extracciones ..........................................................................................................................................................................................................4
2.3-Extracción de una muestra de sangre para obtener el DNA: .................................................................................................................................4
2.4-Medida de la concentración. ...................................................................................................................................................................................5
2.5- Registro de extracciones. .......................................................................................................................................................................................5
3-PCR..............................................................................................................................................................................................................................6
4-PCR Nested (Anidada). ...............................................................................................................................................................................................8
5-Electroforesis. ..............................................................................................................................................................................................................8
5.1 Electroforesis en gel de agarosa………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..9
5.2 Electroforesis por el Qia Excel………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….10
6. Aplicaciones. .............................................................................................................................................................................................................11
6.1 Antígeno HLA.B-27……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………12
6.2 B-talasemia…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..………….12
7. PCR a tiempo real.....................................................................................................................................................................................................12
7.1 Trombofilias……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..13
7.2 Gen Interleucina 28………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….14
7.3 Utilización de la Sonda Silver Green para la detección de especies microbianas……………………………………………………………………………………………..15
7.4 Kras………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….16
8.PCR de secuenciación................................................................................................................................................................................................17
9-Purificación................................................................................................................................................................................................................18
10-Secuenciación...........................................................................................................................................................................................................20
11-Análisis de los resultados.........................................................................................................................................................................................20
12.Apliacciones.............................................................................................................................................................................................................21
12.1 Síndrome X frágil…………………………………………………………………………………………………………………………………….……………………………………………..……..24
12.2 Catalogación de especies microbianas………………………………………………………………………………………………………………………………………….………………25
13.Técnica Lipa: ...........................................................................................................................................................................................................24
13.1 Genotipo susceptible de manifestar cierta enfermedad genética…………………………………………………………………………………………………………..……27
13.2 Identificación de microorganismos…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………28
14. Tipaje de genotipo sensible a Warfarina………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….…29
14.1 Introducción…………………………………………………………………………………………………………………………….……………………………………………..…………………..…29
14.2 Aplicaciones Biomédicas…………………………………………………………………………………….………………………………………………………………………………..……....30
14.3 Mecanismo fisiológico……………………………………………………………………………………………….…………………………………………………..………………………….…31
14.4 Sensibilidad a Warfarina………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..….…31
14.5 Materiales y métodos………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..………………….…….32
14.6Resultados……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..………………………………………32
14.7 Conclusión…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………...32
15- Conclusión...............................................................................................................................................................................................................31
16-Bibliografía…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..…34

1.INTRODUCCIÓN:
La Biología Molecular nace a mitades del siglo XX como una aglutinación de varias disciplinas
científicas: Física, Química,Biología . Toda la praxis que se lleva a cabo en el laboratorio de Biología
molecular gira en torno al “Dogma Central de la Biología molecular”, en resumen, es que a partir de los
descubrimientos de la estructura de la doble hélice de DNA (Watson y Crick) se desencadena una serie de
investigaciones y hallazgos que finaliza con este concepto que ilustra los mecanismos de transmisión y
expresión de la herencia genética.. La existencia de una unidireccionalidad en la expresión de la
información contenida en los genes de una célula, es decir, que el DNA es transcrito a RNA mensajero y
que éste, posteriormente, pasará a ser traducido a proteína, que desencadenará una acción celular.
Las aplicaciones de esta rama como veremos más adelante es muy amplia y diversa y su uso en
diferentes ámbitos es cada vez más relevante.
La mayoría de las técnicas empleadas en el laboratorio de Biología Molecular son aquellas que usan
métodos y técnicas con ácidos nucleicos recombinantes, para un determinado propósito con fines
diagnósticos, tanto en patologías genéticas y no genéticas, dónde se incluyen enfermedades infecciosas.
No solo presenta enormes ventajas en cuanto a la sensibilidad y especificidad de las técnicas usadas en el
diagnóstico directo de defectos genéticos o agentes que causan patologías asociados a los procesos
patológicos como una herramienta valiosa en medicina, sino que además también lo és la velocidad con la
que se obtienen resultados.
Presenta su rol principal no sólo en la detección de una enfermedad a tiempo si no que permite intervenir
desde un punto de vista terapéutico y cambiar un mismo tratamiento en función de la sensibilidad
genética que presente el paciente a un tratamiento.
El laboratorio de Biología molecular está dentro del área de diagnóstico de las diversas enfermedades de
causa genética y también está muy ligada al área de anatomía patológica en la certificación de un
determinado agente patógeno (bacteria, hongo o virus).
2-Recepción de muestras biológicas:
Las muestras biológicas que llegan al laboratorio son de origen muy diverso aunque
principalmente son provenientes de extracciones sanguíneas periféricas. También se trabaja mucho con
otras muestras del tipo aspirado naso-faríngeo, biopsias, inclusiones de tejido en parafina, líquido
cefalorraquídeo y citologías.
Por otro lado también llegan muestras de cultivo proveniente del laboratorio de microbiología donde se
lleva a cabo el crecimiento selectivo de microorganismos para poder catalogar el género e incluso la
especie de dicho microorganismo. Cada una de ellas se deberá tratar de la forma oportuna para poder
realizar correctamente la extracción de los ácidos nucleicos deseados, la herramienta más importante en el
laboratorio de biología molecular.
Las sangres llegan al laboratorio y se guardan en la nevera. Su extracción se realizará al día siguiente.
Pero algunas de las peticiones que se reciben son de carácter urgente y se deberán procesar en el
momento de recibirlas.
2.1-Registro de muestras.
Es muy importante este punto para el buen funcionamiento del laboratorio de Biología molecular
ya que un mal registro conllevaría un mal diagnóstico para el paciente que se solicita un determinado
procedimiento en estas instalaciones, que conllevaría a una pérdida económica. Las muestras llegan al
laboratorio, y son correctamente registradas con un número de petición que corresponde a un paciente y a
una prueba a realizar pedida por el facultativo-médico. Debe de existir una perfecta comunicación entre el
personal facultativo que solicitan los procedimientos a realizar del paciente en el laboratorio y el personal
técnico y facultativo del laboratorio de biología molecular, esto se consigue con un programa informático
del hospital, el Omega 3000. En dicho programa se puede consultar toda la historia clínica del paciente y

toda la información que sea de importancia para emitir un diagnóstico, así como un listado con las
pruebas que se le deben realizar y también de las posibles incidencias que se puedan ocasionar.
2.2- Extracciones
Para trabajar en el laboratorio de biología molecular, se debe obtener el ácido nucleico de las
muestras, sea cuál sea la procedencia de la misma, de sangre periférica, biopsia…
Existen dos formas de extraer de las muestras biológicas el material genético que se precise: algunas se
realizarán de forma automática y otras solamente podrán hacerse de forma manual.
La extracción del material genético se basa en una serie de reacciones químicas y físicas en las que se
consigue la degradación de las membranas lipídicas y del precipitado del resto de material celular con el
fin de conseguir obtener solamente el material genético.
2.3-Extracción de una muestra de sangre para obtener el DNA:
Existen dos maquinas que permiten la extracción del material genético de las muestras de sangre
de forma automática . Ambas presentan un protocolo muy sencillo, se preparan 12 muestras. En cada una
de las muestras se pipetean 200µl en un tubo de rosca y en otro tubo de rosca igual otros 200µl para
guardar sangre de reserva por si hiciese falta hacer otra extracción. Los tubos de rosca que van a
guardarse deben ir rotulados con el nº de petición, la fecha de registro y la técnica que se la va a realizar.
En el tubo de rosca de donde vamos a extraer el DNA, simplemente le escribiremos el nº de posición.
2.3.1.El QIAcube cuenta con los protocolos (Protocol sheet) de todas las extracciones que puede
realizar. Es un protocolo muy sencillo, se preparan 12 muestras. Este eppendorf debe ir correctamente
rotulado porque será con el que se trabaje continuamente y en todo momento debemos conocer de qué
paciente se trata, así como la prueba que se le va a realizar. Esta maquinaria presenta un menú digital y
táctil en el que podremos indicar el tipo de material genético que queremos de tales muestras, DNA o
RNA.
Tiene su principal función en la extracción del material genético de muestras de sangre.
2.3.2El Maxwell: La diferencia principal con el Qiacube es que en este podremos extraer el
material genético hasta un máximo de 16 muestras. Tiene un mayor uso para la extracción del material
genético de muestras en parafina, sangre y citología. La elección del distinto programa que se va a
realizar se efectúa mediante un menú digital.
Izquierda: Maxwell Derecha: QiaCube

2.4-Medida de la concentración.
Una vez extraído el DNA, se debe medir la concentración siempre. Esto se hace para saber si en
pasos posteriores debemos añadir más o menos muestra según protocolo. Porque hay veces que se
produce una mala extracción del materia genético y todo el procedimiento posterior no serviría para nada,
por lo tanto, es una medida que nos indicará si podemos seguir los pasos siguientes, con una absorción de
longitud de onda entre 260-280 nm.
Para la medida de concentraciones, se cuenta con un espectrofotómetro, que necesita muy poca cantidad
de muestra para conocer la concentración de la misma. Éste trabaja con un software específico,
Nanodrop. Este espectrofotómetro es un utensilio muy práctico ya que es un ahorro de tiempo muy
grande en comparación con los espectrofotómetros utilizados en las prácticas de la carrera.
2.5- Registro de extracciones.
Las muestras biológicas que se recogen tras la extracción del material genético serán guardas a -
20ºC durante unos meses hasta que se informe de que no se precisa una nueva extracción de material
genético.
El método de preservar las muestras genéticas en el laboratorio de biología molecular se realiza en base a
la reiteración de las pruebas que se le hará a esta muestra biológica. Si la muestra tiene que utilizarse
durante el día, se dejará en la nevera (10ºC). Pero si este periodo de tiempo se amplia, se deberán guardar
las muestras en el congelador, hasta que se necesiten para realizarle la técnica que ha sido pedida, de esto
depende de la urgencia que suponen tener los resultados.
Para guardar la muestra se disponen de unas cajas en el congelador. En estas cajas que contienen pocillos,
se buscan dos huecos, para guardar el tubo con la extracción y el tubo con la sangre por si se realizarán
nuevas extracciones del mismo paciente.
Tras esto se anota en las hojas de registro de sangre, la fecha de entrada, el nº de petición, la técnica a
realizar y la posición en la caja.
Con este registro es muy fácil encontrar las muestras cuando se debe continuar con el proceso.
Para ello, se saca una hoja de pendientes (muestras que no han sido procesadas), procedente del
Omega3000 donde viene la muestra perfectamente identificada. Con esta hoja, vamos al registro de
sangre y se busca según fecha y petición, en que caja y en qué posición se encuentra la muestra deseada.
Encontrada la muestra se sigue con el proceso.
Cuando una muestra de material genético se ha realizado la técnica que se requería y ha sido informado al
debido facultativo pasará a una habitación que presentan unos congeladores a -80ºC y ayí pasaran un
tiempo indefinido por si en un tiempo a largo plazo se precisará revisar o hacer otro tipo de análisis
genético.
Utilización del Nanodrop, se introduce un volumen muy pequeño de material genético en el lector de longitud de onda, y
nos permite mediante un software adherido al instrumento, detectar en un ordenador la concentración de tal muestra
genética

3-PCR
La PCR es una técnica de biología molecular, desarrollada por Kary Mullis en 1987 y el objetivo de esta
técnica es conseguir muchas copias de un fragmento de DNA aunque haya muy poca cantidad de muestra.
EL fundamento de esta técnica es la propiedad que presentan ciertos microorganismos como Thermus
aquaticus de poder vivir a temperaturas muy elevadas y en la que se conseguía elevar la temperatura del
material genético por tal de separar las hebras y poder así actuar la enzima polimerasa de estos
microorganismos para poder incorporar la cadena complementaria. Actualmente todo este procesos se
simplifica mucho con la ayuda de los termocicladores que permiten enfriar y calentar los tubos de
reacción durante cortos periodos de tiempo. La PCR tiene una gran sensibilidad y una enorme capacidad
de amplificación.
Para que se lleve a cabo el resultado esperado de amplificación de una determinada región del DNA, se
precisan de una serie de reacctivos:
 Los 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP), que es el sustrato para que polimerize el nuevo
DNA.
 Los cebadores de inicio, que son oligonucleótidos, complementario cada uno a una de las hebras
del DNA. Se trata de secuencias cortas que permiten que se inicie la reacción.
 DNA polimerasa, que recibe el nombre de Eurotaq. Con una temperatura óptima de
polimerización, en torno a 70ºC.
 Iones divalentes: Magnesio principalmente o el Manganeso y monovalentes como el potasio que
actúan cofactores esenciales en el proceso de polimerización y por ello incrementan la tasa de
error durante la polimerización.
 Solución tampón, que mantiene el pH adecuado para el buen funcionamiento de la polimerasa.
 Un cebador (primer), que es un pequeño fragmento de DNA monocatenario, cuya secuencia de
bases es complementaria de uno de los extremos de la cadena molde. Es necesario que al
adicionar el primer de la región a amplificar, se dipositen la región Forward (dirección de la
hebra 5’-3’) y el Reverse (3’-5’)
 El DNA molde, que es el DNA obtenido de la muestra biológica, y es aquella región de DNA
que se quiere amplificar.
La reacción en cadena polimerasa se lleva a cabo de la siguiente forma. La molécula o fragmento de DNA
que se desea replicar se desnaturaliza para separar las dos hebras de la doble hélice. Para ello el DNA se
somete a elevadas temperaturas. Cada una de las hembras sirve de molde para sintetizar otra cadena
complementaria. Para que la DNA polimerasa, pueda actuar son necesarios unos oligonucleótidos
cebadores adecuados. En la mezcla de la reacción debe existir, una concentración suficiente de
nucleótidos trifosfato, que serán las piezas de construcción de las cadenas que se van a sintetizar.
El proceso descrito, es un ciclo de síntesis. Si se repite el proceso íntegramente, se partiría de 4 hebras
molde, después se parte de 8 hebras molde y así sucesivamente. Se trata por tanto de un proceso
exponencial, en el que se llevan a cabo tantos ciclos como sea necesario para obtener el número de copias
deseado. Para hacernos una idea, tras 20 ciclos se puede obtener el orden de un millón de copias de una
molécula de DNA.
Son muy importantes los 2 últimos reactivos de la PCR, tanto los primers como el DNA molde, porque
dependiendo del estudio que queramos hacer a la muestra de DNA obtenida, los primers utilizados
variaran, ya que según los primers que adicionemos a la reacción amplificara una u otra región
determinada del DNA molde.
.
El resultado que se quiere obtener de
esta técnica se ilustra en la imagen
izquierda. A partir de los reactivos
anteriormente descritos y unos
determinados primers, conseguir
amplificar (n veces) la región que nos
interesa para nuestro estudio.

1.Inicio: Se lleva la reacción a una temperatura de 94-96ºC que se mantiene durante
unos 9-10min. Esto es necesario para DNA polimerasas que requieren activación por
calor.
2.Desnaturalización: Primero se desnaturaliza el DNA (separación de las dos hebras).
Para ello se realiza un calentamiento de 94-95ºC de la muestra. Esta temperatura
depende de la proporción de G+C que tenga la hebra, así como también de su longitud.
3.Alineamiento, unión del primer (Anneling): Ocurre la hibridación del primer, éste se
une a su secuencia complementaria en el DNA molde. Este paso varía mucho de la
temperatura que se aplique a la técnica, ya que dependerá de tamaño (pb) de la región
del molde de DNA y de la localización, se precisará una mayor o menor temperatura de
annealing.
4.Extensión o elongación de la cadena:Actúa la Eurotaq, usando como el DNA molde
para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del primer como soporte inicial
necesario para la síntesis de nuevo DNA. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de
DNA complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP’s complementarios en
sentido 5’3’, uniendo el grupo 5’-fosfato de los dNTP’s con el grupo 3’-hidroxilo del
final de la hebra del DNA creciente, que es la que se está extendiendo. La temperatura
de este paso depende de la DNApolimerasa usada.
5.Elongación final: Es una única etapa realizada a una temperatura de 70-74ºC durante
5-15min tras el último ciclo de PCR. Con este paso se asegura que cualquier DNA de
cadena simple restante sea totalmente ampliado.

6.Conservación:Último paso. Se realiza a 4-15ºC (4ºC) durante un tiempo indefinido
para conservar la reacción a corto plazo.
4-PCR Nested (Anidada).
En realidad la técnica es igual que la PCR, la diferencia entre esta y la anterior descrita es que
utiliza en vez de molde de DNA un amplificado previo realizada por una PCR normal. Es usada muy
poco, en algunas pruebas del laboratorio, para la mayoría de ellas es suficiente con una PCR normal.
Con esta técnica lo que se busca es evitar hibridaciones inespecíficas de los primers. La alta especificidad
es debida a que como es la amplificación de un amplificado, como se muestra en la imagen inferior, los
primers solo hibridan un sitio dentro de la molécula y el resultado es una mayor sensibilidad.
5. Electroforesis.
La electroforesis es el proceso por el cual se consigue separar las moléculas según la movilidad de estas
en un campo eléctrico. La técnica de la electroforesis tiene su aplicación en el laboratorio de biología
molecular seguidamente después de haber finalizado la PCR, ya que nos permitirá conocer el peso
molecular de la región amplificada y así corroborar que esta región ha sido amplificada o no.
En el laboratorio de biología molecular existen dos formas de realizar la electroforesis:
5.1. Electroforesis en gel de agarosa:
La electroforesis en gel de agarosa es una técnica de laboratorio en la que se utiliza una corriente eléctrica
controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una
matriz gelatinosa.
Izquierda: Imagen de uno de los termocicladores usados en el laboratorio de Biología molecular del Hospital de la
Ribera.
Derecha: Termociclador que permite efectuar PCR con gradientes de temperatura. “BioRad”.

La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composición
homogénea), cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 3 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas
por encima de 50ºC y formar un gel, semisólido al enfriarse. Al gelificar la agarosa forma un entramado
de redes dejando poros uniformes y variables, según concentración, por donde pasarán las moléculas de
DNA durante la electroforesis.
Preparación de un gel de agarosa:
1. Conocer la concentración a la que deseamos hacer el gel. Dependiendo de la concentración de
agarosa que presenta el gel, conseguiremos un tamaño de poro mayor con forme más diluido
estéel gel de agarosa. El tamaño de poro permite una mayor movilidad electroforética y tendrá su
uso para amplificados con pesos moleculares grandes (1% de agarosa). En cambio, las regiones
amplificadas más usadas presentan un peso molecular para el cual se usará una concentración de
agarosa del 3%.
2. Con el uso del microondas, iremos calentando la dilución de agarosa para obtener por fin un
homogeneizado , con una textura de gel.
3. A continuación se añade bromuro de etidio, que nos permitirá efectuar el revelado en la cámara
con detección de rayos UVA.
4. Se deposita en el soporte de la electroforesis junto al peine, y se deja enfriar unos minutos.
Una vez transcurridos unos minutos, se observa que el gel tiene una coloración más blanquecina, esto nos
indicará que el gel está en óptimas condiciones para poder aplicar las muestras para que se de la
movilidad electroforética.
A continuación se realizarán los siguientes pasos:
1. Depositar el soporte con el gel de agarosa dentro de la cubeta electroforética.
2. Adición de tampón TAE10X.
3. Se procederá a la aplicación en cada pocillo de la muestra con el material genético amplificado
junto con una cantidad estándar de tampón de carga. . Este da un color azul y una alta densidad a
la muestra, permitiendo que esta vaya al fondo y se pueda ver
4. En uno de los pocillos, se recomienda el último, se aplicará el tampón de carga. Es una muestra
con 5µl de un marcador de pesos moleculares conocidos, para poder orientarnos sobre el tamaño
de las bandas que aparecerán en nuestras muestras.
5. Por último se añaden 200µl de bromuro de etidio.
Se conectará la cubeta de electroforesis a un campo elétrico de unos 120 V con el que se conseguirá el
esperado movimiento electroforético. Al aplicar una corriente eléctrica hay que tener la máxima
precaución para evitar los riesgos que supone poner en contacto con la corriente alterna, para ello
debemos cerciorarnos de no pulsar el botón de activación hasta que no tengamos colocados bien los
cables, uno a cada polo. Los cables deben ser conectados a los polos, cátodo (-) y ánodo (+), a una fuente
de generación de campos eléctricos. Se fija el voltaje a 120V, durante unos 40 min y se inicia la
electroforesis. Debe ser parada cuando el frente ha superado el ecuador del gel. Hacer una foto (revelado)
y si no está bien dejar correr unos minutos más, evitando que el frente se caiga del gel.
La foto se realiza en una cámara de luz ultravioleta, conectada a una cámara de fotos digital. Se enciende
la luz UV y se hace la foto del gel. Tras esto, y con un software de fotografía se puede observar el
revelado del gel y será analizado.
Sabremos que se ha realizado una correcta amplificación al aparecer una banda del tamaño deseado.(Se
conoce cuántos pares de bases van a amplificar los primers). En esta banda se encontrarán múltiples
copias del segmento amplificado.
Ilustración que explica el proceso de obtención del gel de agarosa para la realización de
la técnica electroforética

5.2. Electroforesis por el Qia Excel:
Actualmente en el laboratorio se realizan muy pocas electroforesis en gel de agarosa, sólo son necesarias
en alguna prueba específica, donde el tamaño de la banda es más grande.
A modo general se usa la electroforesis capilar, totalmente automatizada. La función de esta técnica es la
misma, separar moléculas en una disolución según la relación masa/carga. En este caso sólo se debe
poner los tubos donde se realizó el amplificado en el QIAexcel. Este ya posee el tampón encargado de
conducir la corriente eléctrica, el capilar con diferencia de potencial que hará moverse a las moléculas y
el software asociado que permite el análisis de la carrera electroforética. Sólo debemos conectar la
máquina con los tubos de PCR y a los pocos minutos obtendremos el resultado.
Mediante esta técnica se avanza muchísimo en tiempo, ya que no tendremos que hacer cada vez el gel de
agarosa ni esperar unos 40 minutos para que se lleve a cabo la electroforesis.
Aunque es una forma mucho más sencilla y rápida de obtener los resultados, su coste es mayor que en la
técnica manual electroforética por gel de agarosa y además, se tiene el riesgo de que el software o la
maquinaria fallen y se tendría que hacer de manera manual.
Se observa 2 cubetas de electroforesis,
junto a un transformador de corriente
alterna.
Cámara de revelado. Se introduce la muestra y se
efectúa la fotografía que pasa la imagen a un
ordenador contiguo.
Ilustración de la maquinaria para
electroforesis automática: Qia
Excel

6 APLICACIONES:
6.1Antígeno HLA-B27.
El antígeno leucocitario humano B-27 (HLAB-27) es un antígeno de superficie de calse I que se codifica
en el complejo mayor de histocompatibilidad humana (MHC) en el cromosoma 6 y presenta antígenos
microbianos a las células T. Los antígenos leucocitarios humanos son proteínas que ayudan al
sistema inmunitario del cuerpo a diferenciar entre sus propias células y sustancias extrañas y
dañinas.
Se relaciona la presencia de este antígeno con algunas enfermedades y patologías con una prevalencia
bastante grande. Alrededor del 90% de la población con algunas de las enfermedades que ahora
detallaremos presenta este antígeno. En cambio, algunos estudios hablan de que existen otras personas
que no padecen estas patologías y presenta de igual manera este antígeno. Por tanto, este estudio, lo que
hace es certificar a aquellas personas que padecen estas sintomatologías y dan positivo a esta prueba, el
origen de su patología.
Cuando cierto paciente acude al médico con alguno de los siguientes síntomas: dolor, rigidez o hinchazón
articular. El personal facultativo se cerciora de la posibilidad de que la causa de estos síntomas sea alguna
de las enfermedades autoinmunitarias, tales como la espondilitis anquilosante y el síndrome de Reiter.
El examen de antígenos HLA también se utiliza para buscar la compatibilidad de tejido donado para
receptores de órganos. Por ejemplo, se puede hacer cuando una persona necesita un trasplante de riñón o
un trasplante de médula ósea.
Un resultado normal (negativo) significa que el HLA-B27 está ausente.
Un examen positivo significa que el HLA-B27 está presente y sugiere un riesgo mayor al promedio para
desarrollar o tener ciertos trastornos autoinmunitarios. Un trastorno autoinmunitario es una afección que
ocurre cuando el sistema inmunitario ataca por error y destruye el tejido sano del cuerpo.
Podemos observar que en el canal 5 se encuentra el control positivo y a partir de este compararemos con el resto
de los canales, que serán los pacientes. De tal forma, podemos deducir que el paciente 1 y 2 son positivos a esta
prueba y de lo contrario el 5,6,7 y 8 son negativos. El canal 3 se corresponde con el control negativo.

6.2 β-Talasemia.
Las talasemias, por orden general, son un tipo de anemias hereditarias que son causadas por la
disminución de la síntesis de una o más de las cadenas polipeptídicas de la hemoglobina. Según de
importante sean la disminución sintética de dichas cadenas polipeptídicas darán una mayor o menor
severirdad de la enfermedad, llegando incluso a ser de carácter terminal para el individuo.
Hasta el momento se han diferenciado un total de 6 tipos de talasemias:
- Alfa-talasemia portador
- Alfa talasemia grave
- Alfa talasemia Mayor
- Beta talasemia menor
- Enfermedad de la hemoglobina H
- Anemia de Cooley
Principalmente, en el laboratorio de Biología molecular de la Ribera, se detectan talasemia de tipo beta.
Se trata de una enfermedad que presenta una prevalencia bastante elevada en la población del territorio
valenciano y es por ello , por lo que la mayoría de las técnicas de detección para talasemia, está enfocada
al tipo beta.
La tan alta prevaencia de esta enfermedad podría ser causante por la selección positiva producida por la
malária en dichas zonas (zona de la Albufera de Valencia). La beta-talasemia es una forma de talasemia
(Anemia hemolítica hereditaria) caracterizada por un déficit en la síntesis de cadenas beta de la
hemoglobina. Está ocasionada principalmente por mutaciones de tipo puntuales de las que se han descrito
más de 170 diferentes. La mayoría de los casos tiene su origen en una mutación del genHBB en el
cromosoma 11. También existen casos de delecciones de diversos tamaños que pueden afectar al gen de
la beta globina o a la región de control del locus. La detección, en este laboratorio, de la presencia de
beta-talasemia se efectúa con el amplificado para esta región y posterior detección mediante
electroforesis del amplificado de bandas.
Mayoritariamente es una enfermedad hereditaria con un patrón autosómico recesivo, pero también
existen algunos casos donde la herencia es autosómica dominante.
El resultado es que aumentan otros tipos de hemoglobina que no liberan el oxígeno con tanta facilidad, y
los tejidos reciben menos oxigenación. Existen dos variedades de beta-talasemia (mayor o menor) según
sea un déficit total o parcial de la síntesis. Aumenta la posibilidad de que se rompan los hematíes
(hemólisis). Es una anemia que no se trata con hierro.

7.PCR a tiempo real: Sonda taqman
El fundamento de esta técnica se basa en la realización de una PCR a tiempo real en la que gracias a esta
sonda nos permitirá identificar si el paciente presenta dicho alelo mutado y si lo presenta en
heterozigosis o en homozigosis.
Ct: Es un valor matemático que permite obtener resultados fiables a fin de conocer la cantidad de DNA
inicial. Este valor se determina gracias a una recta de calibrado.
Estas son las enfermedades que hemos visto aplicación para este proceso de detección:
7.1Trombofilias:
Propensión a desarrollar trombosis (coágulos sanguíneos) debido a anormalidades en el sistema de
coagulación. Los defectos hereditarios es uno o más factores de coagulación pueden provocar la
formación de coágulos que pueden llegar a ser potencialmente peligrosos (trombosis). A continuación se
detallan los genes más comunes que causan trombofilia:
El Factor V Leiden “Trombofilia” es un transtorno hereditario de la coagulación de la sangre. Es
una variante del factor V de coagulación humana que a menudo causa un trastorno de
hipercoagulabilidad. En este trastorno la variante del factor V de Leiden no puede ser inactivada
por la proteína C activada. El facto V de Leiden es el trastorno de hipercoagulabilidad
hereditario más común entre euroasiáticos.. En una persona sana, el factor V funciona como
cofactor para permitir que el factor X active una enzima llamada trombina. La trombina, a su vez
se une al fibrinógeno para convertirla en fibrina, la cual polimeriza para formar la malla densa
FAM
VIC
HOMOZIGOTO MUTADO
HOMOZIGOTO NORMAL
HETEROZIGOSIS
Podemos ver en el gráfico adjunto que el resultado de esta PCR a tiempo real, dependiendo de si más
del 50% presenta la sonda FAM pertenece a una homozigosis del alelo normal para esta prueba, menos
del 50% presentaría una mayor presencia del alelo mutado en homozigosis.
Si presenta un 50% para cada una de las sondas, este paciente presentará el alelo mutado en
heterozigosis. Este resultado lo obtenemos a partir del termociclador ABI 7000.
1.Factor V tipo Leyden:

que constituye la mayor parte de un coagulo sanguíneo. La proteína C activada (APC) es un
anticoagulante natural que actúa para limitar el alcance de la coagulación separando degradantes
y al mismo factor V.
El factor V de Leiden y la mutación del gen de la protrombina son los polimorfismos más
frecuentes implicados en la trombosis.
El factor V de Leiden es un trastorno con herencia autosómica y de forma dominante que
presenta dominancia incompleta y resulta en una variante del factor V que no puede ser tan
fácilmente degradada por la proteína C activada.
La mutación de este gen consiste en un polimorfismo de nucleótido simple (SNP) situado en el
exón 10 del brazo corto del cromosoma 1 humano Las personas con factor V Leiden tiene un
riesgo mayor que e promedio de desarrollar un tipo de coágulo de sangre llamado trombosis
venosa profunda (TVP). TVP se presenta con mayor frecuencia en las piernas, también en otras
partes del cuerpo como en cerebro, los ojos, el hígado y los riñones, por tanto muchas de ellas
pueden tener como consecuencia la muerta o un fallo multiorgánico. Además de esto, también
aumenta e riesgo de que los coágulos se rompen lejos del lugar de origen pero viajen por el
torrente sanguíneo y lleguen a algún órgano importante. La prevalencia en la población que
presenta la mutación del Factor V Leiden , en torno al 10% ,nunca desarrollará coágulos
anormales. Además de esto, las mujeres con la mutación del factor V Leiden se asocia a un
ligero aumento de riesgo de aborto espontáneo. Otros factores de riesgo son los anticonceptivos
orales donde por si solos suponen un aumento de 4 veces el riesgo de padecer trombosis venosa,
este riesgo aumenta a 50 veces en el caso de mujeres con heterocigocis para el factor V Leiden y
a 100 veces en las homocigotas. También la terapia de reemplazamiento hormonal en el caso de
mujeres con un alelo mutado pasa de 2-4 veces a 15 veces el riesgo de trombosis. Es por todo
esto, que la detección precoz de esta enfermedad gracias a las técnicas de DNA recombinante
pueden evitar a tiempo un accidente cardiovascular y un aborto espontáneo.
.
La protrombina tiene su función en la elaboración de fibrina para cubrir el lugar donde se ha
producido una hemorragia por causa de un trauma. Se trata de una proteína del plasma sanguíneo
que forma parte del proceso de coagulación, tiene su origen en el hígado, al igual que la
mayoría de las factores coagulantes, es el denominado factor II de coagulación. La
formación de los trombos es el resultado de una reacción de la protrombina con la
enzima "tromboplastina", una enzima ubicada en el interior de los trombocitos. Mediante la
unión del catión Ca++
(calcio), actuando como factor coenzimático , hace posible la liberación
de protombina, al romperse la frágil membrana celular de los trombocitos.
Cuando la protrombina entra en contacto con la tromboplastina, reaccionan y producen un
compuesto proteico llamado trombina, a su vez ésta reacciona con el fibrinógeno, una proteína
del plasma sanguíneo, dando como resultados enormes tiras de fibrina que van a cubrir el lugar
de la hemorragia, y acto seguido van a crear una base sólida.
2. Mutación de la Protrombina:
Esquema ilustrativo del
funcionamiento fisiológico de una
coagulación normal y de una
coagulación anormal debido a
mutación en Factor V

Una mutación en el gen (20210 G>A) que sintetiza para la proteína Protrombina, tiene como
resultado una mayor probabilidad de sufrir una trombosis que la población normal. Las mujeres
jóvenes portadoras de la mutación tienen un riesgo 4 veces mayor de sufrir un infarto de
miocardio, mientras que en los hombres el riesgo se incrementa en 1,5 veces. Este riesgo se
incrementa aún más si se da el uso de anticonceptivos, la terapia de estrógenos, el tabaquismo, la
diabetes o la hipertensión arterial.
Al igual que la técnica de detección para la mutación de Factor V, se procede a una PCR a
tiempo real, con la que conseguiremos ver si existe tal mutación mutación 20210G-A en el gen
de la Protrombina (Factor de Coagulación II) y además de ver si está presente en heterozigosis o
no.
La mutación 20210G-A en el gen de la Protrombina (Factor de Coagulación II) aparece en el 3%
de la población del sur de Europa. Esta mutación está asociada a la trombosis cerebral (arterial o
venosa) y embolia pulmonar.
-7.2 Gen de la Interleucina 28:
Se trata de una citoquina que viene en dos isoformas, la IL-28A y la IL-28B y presenta un papel muy
importante en la defensa inmune frente a los virus. Destaca la inducción hacia un “estado antiviral”
mediante la activación del interferón.
Presenta ventajas muy grandes en la aplicación de IL-28 a la vacuna contra la gripe H1N1, con una
protección del 100%, en cambio, sin la adición de la IL-28 a dicha vacuna, solo protegerá en torno a un
50%.
Permite catalogar, genéticamente, la susceptibilidad y capacidad del organismo para defenderse del virus
de la hepatitis C. La hepatitis C es una enfermedad muy prevalente que afecta a millones de personas en
el mundo. Además, es una infección que se cronifica con mucha frecuencia provocando, en pacientes
crónicos, cirrosis o cáncer en un 5-25% de los casos. La aparición de una única alteración genética en el
cromosoma 19, en el gen de la interleucina 28B, permite clasificar las posibilidades de curación de una
persona. Cada persona nace con un genotipo en la interleucina 28B que permite catalogar, genéticamente,
la susceptibilidad y capacidad del organismo para defenderse del virus C de la hepatitis, tanto de forma
espontánea como después de recibir tratamiento antiviral. Por ello, su análisis determina si se tiene
predisposición o no para curarse.
-7.3 Utilización de la sonda Silver Green para detección de especies microbianas:
En este caso particular de PCR a tiempo real, se utiliza un reactivo denominado Silver Green y de la
misma forma que los otros ejemplos de la PCR a tiempo real, al introducir unos determinados primers, si
el DNA molde consigue amplificar para estos primers, se unirán a los amplificados unas sondas que darán
cierta fluorescencia y será detectable por el fluorómetro que lleva incorporado el termociclador. La
diferencia que existe entre esta PCR a tiempo real y las anteriores descritas, es debido a la sonda reactiva
utilizada. Además en estos estos estudios se suele datar también la “carga microbiana” o “viral” en el caso
de que el uso fuese para virus.
La carga microbiana se establece de la siguiente manera:
1. Hacemos el preparado con todos los reactivos: dNTPs, primers, sonda Silver Green, iones
divalentes, H20 y Eurotaq. Todo igual a excepción del DNA molde.
Termociclador para PCR a tiempo real: ABI7000. Usado para el desarrollo de esta técnica en la
detección de las descritas enfermedades.

2. Introduciremos el preparado (1) en “n” tubos, uno para tantos pacientes a los que se les haga la
prueba y además se hará un control negativo y 2 positivos. Estos 2 controles positivos presentan
concentraciones diferentes de la cepa en cuestión, de tal manera que cuando se mida la
fluorescencia y comprobemos que da positivo, también podremos extrapolar una recta y así
medir la cantidad de microorganismos que presentaba el paciente.
A continuación mostraremos unos ejemplos:
-Bordetella pertusis: Son bacterias gram negativas, aerobias y anaerobias facultativas, no producen
esporas. Fue asilada por primera vez en cultivo puro (1906) por Bordet y Genou.
Son los agentes causantes de la “tos ferina”. En la década de los 70 causó gran mortalidad en algunas
poblaciones de los Estados Unidos, que llevó a diseñar una vacuna eficiente para evitar estas epidemias.
La tos ferina es una infección del sistema respiratorio que se caracteriza por un “silbido” cuando la
persona respira.
Únicamente se conoce al ser humano como único hospedador, alojándose en el sistema respiratorio
humano y fijándose en el epitelio ciliado del tracto respiratorio.
Cuando se pide la determinación para esta especie, la recepción de muestras es en forma de esputo o
extracción mucosa nasofaríngea. De forma manual y por medio de una torunda se recogerá parte del
material biológico y se procederá a efectuar el protocolo de extracción de DNA. Posteriormente, ya que
normalmente este tipo de análisis microbiológicos precisan de urgencia, se efectuará la PCR a tiempo
real, introduciendo en el preparado (1) los primers pertenecientes a una región exclusiva y muy
conservada de la especie Bordetella pertusi, concretamente a los factores de patogenicidad y de
virulencia.
-Mycobacterium sp : Las micobacterias son bacterias aerobias e inmóviles. No producen endosporas ni
cápsulas y se les consideras gram positivas. Normalmente tiene forma bacilar, aunque también pueden
presentar formas filamentosas. Normalmente se hace únicamente la prueba del género y si es preciso
posteriormente se hará la PCR de secuencias para determinar la especie. El género Mycobacterium
engloba un conjutno de especies de gran patogenicidad para el ser humano, destacamos la siguiente:
-Mycobacterium tuberculosis: Se trata de un patógeno estricto, se trata de una de las infecciones
más frecuentes en la literatura clínica a lo largo de los siglos y aún en la actualidad encontramos algunos
casos, sobretodo ligado a pacientes inmunodeprimidos. Los síntomas pueden venir de cualquier órgano
del cuerpo, aunque lo más frecuente es la infección pulmonar y posteriormente puede ser progada por via
sanguínea o linfática al resto de los órganos.
- Pneumocystis sp: En este caso no es una bacteria, pertenece al grupo de los hongos ascomicetos. Estos
organismos son parásitos extracelulares en los pulmones de los humanos. No forman micelios y las
células vegetativas presentan paredes finas y de formas irregulares. Debido a su morfología tan compleja
e irregular, la extracción del DNA se hace muy complicado en ocasiones y la catalogación se hace muy
complicada y se tienen que repetir las extracciones varias veces, por eso es tan importante el paso de
extracción y comprobación del DNA, ya que, si vemos que la concentración de DNA no es la normal, no

seguiremos con el proceso y evitaremos los costes tan altos que supone realizar una PCR a tiempo real y
de también de la perdida de tiempo para el personal facultativo y sobre todo para el paciente.
7.4 KRAS:
Se trata de una reciente técnica que actúa como detector para un biomarcador para un tipo de cáncer
colorectal. Con esta técnica no conseguimos determinar si el paciente presenta cáncer, sino la posibilidad
de administrar a un determinado paciente con cáncer de colon un fármaco biológico para poder paliar su
enfermedad. La proteína GTPasa KRases una proteína que en los seres humanos está codificada por el
gen KRAS.KRAS normalmente está atado a las membranas celulares debido a la presencia de un grupo
isoprenilo en su C-terminal.
A partir de una muestra obtenida a partir de la biopsia tumoral del colon del paciente se extrae el DNA y a
partir de esta muestra se realiza esta técnica. Previamente a este paso que se da en el laboratorio de
biología molecular; el departamento de anatomía patológica habrá determinado que la biopsia recogida
proviene de la extracción de una región del colón con células cancerosas.
Esta técnica es muy sencilla porque existe un kit donde están todos los reactivos que hay aplicar y
además de una forma muy sencilla que con muy poco tiempo tendremos la muestra apunto para realizar
la PCR. Entre todos los reactivos que se añaden al DNA también está presente una sonda que en el caso
de que al realizar la PCR y se tratase del tipo de cáncer de colon que se busca en esta técnica, reaccionar
emitiendo fluorescencia. Se trata pues, de una PCR a tiempo real, ya que sin la necesidad de hacer una
electroforesis, el mismo termociclador nos indicará gracias al fluorómetro que lleva incorporado de si
esta muestra de cáncer de colon es compatible con el tratamiento con el medicamento. KRAS actúa
como una molécula de encendido / apagado. Una vez que se enciende, se recluta y activa las proteínas
necesarias para la propagación del factor de crecimiento y la señal de los receptores de otros, tales como
c-Raf y PI 3-quinasa. KRAS se une a GTP en el estado activo y posee una actividad enzimática
intrínseca que escinde el fosfato terminal del nucleótido convirtiéndolo a PIB. Tras la conversión de
GTP en GDP, KRAS está apagado.
8.PCR de secuenciación.
En muchos casos la resolución de una prueba no finaliza con la PCR (normal o a tiempo real) sino que se
precisa localizar y conocer la secuencia nucleotídica amplificada para localizar y conocer posibles
mutaciones que en determinados casos serán la causa de una enfermedad. Esta técnica, por otro lado,
tiene también su aplicación en la catalogación de cierta especie de microorganismo causante de una
enfermedad.
Para que se lleve a cavo la secuenciación se precisan los siguientes componentes:
1. El amplificad obtenido como resultado de la PCR.
2. Cofactor para la enzima polimerasa: MgCl2
3. Primers de la secuencia amplificada. Pero en este caso el Forward (5’-3’) y el Reverse (3’-5’) se
adicioran por separado. Reaccionaran en tubos separados cada uno de los primers.
4. Se adiciona un kit denominado “Big dye” que dispone de una solución tampón, la polimerasa y,
además de los cuatro didesoxinucleótidos marcados (ddNTP’s).
Termociclador para PCR a tiempo real utilzado para la técnica de KRAS.

La reacción de secuenciación se realiza en un termociclador, a diferencia de la PCR normal donde cada
primer precisa de una temperatura de annealing, en este tipo de PCR se utilizan los mismos parámetros de
tiempo y temperatura para cualquier PCR de secuencias independientemente del tamaño del amplificado.
Existen algunos pasos que se conservan a la PCR normal:
En el primer paso de esta reacción, se calienta el DNA para que se desnaturalice y forme cadenas
sencillas.
A partir del segundo paso, empiezan las diferencias. En la PCR normal, añadíamos primers para que la
polimerasa empezara su actividad en una región determinada del DNA molde, que era de interés para
nuestro estudio. En el caso de la PCR de secuencias, añadiremos en tubos de PCR separados el Forward
(5’-3’) y el Reverse (3’-5’) del mismo primer. Por tanto se procede a la adición de los dNTPs en la
polimerización de la cadena complementaria.
Pero a d’NTPs se les adiciona inserta un dideoxinucleótido en lugar de un desoxinucleótido a la cadena
de DNA en crecimiento. Ya que el dideoxinucleótido no tiene un grupo 3’-OH, no puede formar un
enlace 3’ con ningún nucleótido, y la síntesis de DNA se detiene, lo que causa la terminación de la
elongación de la cadena. Cada una de estas cadenas termina aleatoriamente en un nucleótido específico
diferente. Por tanto cada vez que la polimerasa va polimerizando esta región, tiene que volver a empezar
y seguir desde el lugar donde se insirió el dideoxidonucléotido, por tanto, en realidad no se produce una
amplificación de un gen, si no que se descifra cada uno de los nucleótidos que forman esta región de
DNA. Esto produce una serie de fragmentos de DNA que se separan electroforéticamente, y cuyo análisis
revela la secuencia de DNA.
El análisis electroforético de estas secuencias se realizará en un secuenciador.
9-Purificación
Este paso es fundamental realizarlo una vez terminada la PCR de secuencias, y además hacerla lo mejor
posible. Una vez ha finalizado el termociclador, dentro de los tubos de PCR se encuentra la secuencia de
la región de interés, pero también existen restos de reactivos que no han polimerizado o que interactúan
con las secuencias y impedirían una buena resolución de la lectura del secuenciador.
En los estudios que se usa esta técnica, en ocasiones, sólo hemos de detectar una mutación puntual del
total de la región de DNA, por tanto, cuanto más perfecto y resolutiva salga la secuencia final para
analizar, nuestro diagnóstico será más preciso y no nos llevará a error.
El proceso de purificación es sencillo, dependiendo del volumen de trabajo podremos utilizar columnas
de purificación o placas de purificación si el volumen de trabajo es más grande ( más de 12 tubos de
PCR).
Con la purificación por columna el trabajo es más complejo, porque tendremos que purificar tubo por
tubo en cada una de las columnas; en cambio, con la placa de purificación, el trabajo se minimiza mucho,
porque en la misma placa podemos purificar 80 tubos de PCR.
El proceso se basa en el filtraje de la muestra por un gel, con a ayuda de la centrífuga, para conseguir
separar la secuencia final del resto de reactivos.
Purificación de la PCR de secuencias en
placa de purificación.
Purificación de una PCR de
secuencias en columna.

Esquema general de una PCR de secuencia:___________________________

10-Secuenciación.
Tras la extensión del primer realizada por la DNApolimerasa y su purificación, los productos de
la reacción se cargan en una placa de secuenciación y de ahí pasarán al carril de un gel. El gel es
rastreado por un láser, lo que provoca que cada banda emita fluorescencia de un color diferente. El
secuenciador tiene un detector que lee el color de cada banda, y determina si representa una A, una T, una
C o una G. Estos datos se representan en forma de picos coloreados, correspondiendo cada uno a un
nucleótido en la secuencia.
Por tanto, el secuenciador no es más que una máquina que realiza una electroforesis capilar en función del
tamaño de las moléculas de la muestra, que contiene un detector de fluorescencia asociado.
La fluorescencia proveniente de cada uno de los ddNTP marcados, es detectada y como la muestra pasará
por electroforesis dependiendo del tamaño, la secuencia se detectará de forma ordenada.
Para comenzar a secuenciar deberemos marcar todas las opciones oportunas en el software del
secuenciador, cargar la placa, añadir el buffer y H2O destilada en el correspondiente sitio e iniciar
secuenciación.
11-Análisis de los resultados.
El secuenciador una vez ha finalizado su tarea de detección transformará la información en forma de
cifrado digital, de tal manera que aparecerá un archivo que deberá ser procesado por un determinado
programa por tal de que podamos leer la secuencia.
En el laboratorio de Biología molecular se usa el programa “Chromas”. En este programa, una vez
introducidos los datos obtenidos del secuenciador, nos muestra una pantalla donde aparecen unas curvas
de colores que son indicativo del tipo y de la intensidad de la fluorescencia de cada nucleótido marcado
detectado por el secuenciador. Negro (Timina), azul (Citosina), verde (Adenina) y marron (Guanina).
Si la intensidad es buena, en la cumbre del pico nos pondrá el nucleótido que el secuenciador detecta,
mediante la inicial: A (Adenina), G (Guanina), C (Citosina), T(Timina). En cambio, si la intensidad no es
del todo buena, aparecerá la inicial N.
Aquellas secuencias que el detector no las detectan bien, es tarea del personal de laboratorio determinar
cuál sería, de dos formas:
- Del mismo primer tenemos la cadena en dirección 5’-3’ y también en dirección 3’-5’. Pues,
mediante una herramienta del programa, obtendremos la región complementaria a 3’-5’ o viceversa
y en la posición indicada, veremos cuál es el nucleótido.
- Muchas veces, la intensidad no es suficiente para que el software detecta éste nucleótido, pero se ve
a simple vista, que en realidad si que se ha detectado cierta fluorescencia.
Imagen del Secuenciador del
Laboratorio de Biología molecular
(Hospital de la Ribera)
Ilustración del proceso llevado por el secuenciador en la
detección de las secuencias (ddNTPs) y transmisión de la
información fluoroforética a un formato digital.

Una vez ya tenemos “editado” nuestra secuencia, es decir, aparece toda la secuencia de interés, pasaremos
a realizar la prueba de diagnóstico pertinente.
Existe una herramienta “edit Blast” que nos permite comparar nuestra secuencia con un banco de datos en
una página de internet llamada “Blast”. Esta herramienta tiene múltiples utilidades:
1. Determinar la especie de un microorganismo.
2. Comprobar una mutación en un gen, al compararlo con la secuencia normal de este gen.
3. Determinar, al detectar una mutación en un gen determinado, si ocasiona en la síntesis
proteica, daños muy o poco severos en el paciente.
En ocasiones, debido a una mala praxis en alguno de los procesos de obtención de la secuencia final, se
dan casos en los que no se da una buena calidad.
12.APLICACIONES:
- 12.1Síndrome X-frágil.
El síndrome del X frágil (SXF), también conocido como síndrome de Martin-Bell, es la primera
causa de retraso mental hereditario y la segunda después del síndrome de Down.. Es una enfermedad que
aún en la actualidad sigue siendo un tanto desconocida para el personal facultativo aunque desde hace
pocos años se conoce cuál es la causa genética causante de esta enfermedad.
La prevalencia de personas afectadas es de 1 de cada 1200 varones y de 1 de cada 2000 mujeres, siendo
en este último caso 1 de cada 700 portadores genéticas aunque no manifiesten el síndrome, debido a la
dualidad de cromosomas X por parte de las mujeres. En términos generales supone un 10% de la
población de varones afectados con este síndrome. Aunque el dato más alarmante es que entorno al 85%
aún en la actualidad siguen sin estar correctamente diagnosticadas.
El origen genético del X frágil fue un poco inverosímil hasta hace pocos años. El origen genético se
localiza en el cromosoma X. El diagnóstico no se hace únicamente del paciente al que padece los
síntomas propios del síndrome X frágil, sino que este diagnóstico se amplía a todas las personas
emparentadas con el paciente para poder informar a la familia del foco portador y de las posibles
consecuencias para los descendientes de ese linaje.
-Las características físicas son las siguientes: Macrocefalia, orejas grandes y/o separadas, también
presenta una cara alargada y estrecha, presenta también estrabismo. Es también muy usual que presente
los pies planos y en algunos casos prolapso de la válvula mitral. Presenta macrooquidismo (aumento del
tamaño de los testículos) que se desarrolla en etapas de desarrollo más avanzada (adolescencia) .
En las mujeres los rasgos físicos son menos perceptibles que en los hombres, pero destaca de igual forma
un alargamiento de la cara y un tamaño de orejas más grande de lo habitual, así como el prolapso de la
válvula mitra.
La característica que es común en todos los individuos y es por lo que tiene tanta relevancia en su
diagnóstico, debido al retraso mental ,que puede ser de severa a leve ,que padecen estos pacientes y
Imágenes obtenidas del proyecto para el genotipado sensible a warfarina. Imagen izquierda
presenta una buena resolución y en la imagen derecha vemos una muy mala resolución.

también a la conducta que presentan, como lo es su timidez extrema, hipersensibilidad a los estímulos o
también un lenguaje repetitivo.
La causa genética que ocasiona este síndrome es debido a la expansión de un trinucleótido en el gen
localizado en el extremo del cromosoma X, el cual, presenta cierto número de repeticiones del
trinucleótido CGG, que no es habitual, llegando a ser de hasta 230 repeticiones y como consecuencia se
produce la metilación del gen y en definitiva, la perdida de función del gen, produciendo así estos
síntomas. El producto de este gen, la proteína fmr1, puede encontrarse tanto en el núcleo como en el
citoplasma, y a pesar de que su función es aún poco conocida, se ha visto que presenta la capacidad de
unirse a determinados RNA mensajeros, por lo que dicha proteína podría estar implicada en el transporte
de estos desde el núcleo hasta el citoplasma para su traducción.
El SXF impacta negativamente sobre el desarrollo y deriva en dificultades de aprendizaje, discapacidad,
incluido retraso mental severo, también se manifiestan problemas de atención, hiperactividad y conductas
autistas.
12.2 Catalogación de especie microobiana:
Paenibacillus heidelbergensis
En este caso, la utilización de la técnica PCR de secuencias no es para la determinación de
mutaciones puntuales, sino que tiene su uso también para la determinación de especie gracias
al material genético de un microorganismo proveniente del cultivo proveniente del esputo de
un paciente en el laboratorio de microbiología.
La catalogación de especies microbianas se efectúa mediante la amplificación de una región
del RNA ribosomal de la bacteria. Se trata de una región que está muy conservada dentro de
una misma especie de microorganismos, por tanto, cabe esperar, que aquel resultado que más
probabilidad de semejanza exista con la secuencia nucleotídica de esta bacteria será aceptada
cómo tal especie.
Previamente a la PCR normal efectuaremos una RtPCR , ya que el material genético obtenido
es RNA ribosómico y por tanto necesitamos obtener el DNA complementario al RNA.
Una vez finalizado el proceso de la RtPCR, proseguiremos con la amplifación de esta región
del ribosoma y finalmente haremos la PCR de secuencias.
Mediante la herramienta del programa Chromas de editado de secuencias, entraremos en la
base de datos y comprobaremos de qué bacteria se trata.
El resultado de un caso que vimos en el laboratorio era el de la bacteria “Paenibacillus
Heidelbergensis”, que se trata de una bacteria gram positivo que fue registrada por primera vez
en Korea (2007) . Dicha bacteria habita en el suelo y al parecer se inoculó en el aparato
respiratorio de un individuo y le causo ciertos síntomas de pneumonía.
13.TÉCNICA LIPA:(Line probe assay)
Se trata de una técnica de PCR de hibridación que sirve para detectar la presencia de ciertas
regiones de DNA.
En términos generales el fundamento de esta técnica se basa en la reacción de hibridación en
unas tiras de celulosa que presentan un bandeado de oligonucleótidos y que se unirán al
amplificado de las muestras que analizaremos. El método es el siguiente:
1. Realizaremos la PCR de las regiones que se precisen para la detección tanto de una
determinada enfermedad genética como de las regiones que permitirán identificar el
género y la especie de una determinada bacteria.
2. Desnaturalizaremos el producto de la PCR para sólo aplicar aquellas regiones que hayan
amplificado.

3. Mediante un sistema de continuo balanceo leve y un sistema de entrada y salida de un
líquido (buffer + agua destilada) se consigue hacer una serie de lavados.
4. El resultado final se obtiene cuando al finalizar estos baños se consigue que se haya
dado la hibridación del resultado de las regiones amplificadas junto a los
oligonucleótidos de las bandas de las tiras.
El resultado final y después de una serie de baños, se consigue que el agregado que es el
resultado de la unión de los oligonucleótidos con los amplificados presente como reacción una
coloración obscura. Esta coloración obscura nos dará la información de que la muestra que
hemos utilizado presenta estas regiones.
Gracias a la comparación del resultado del LIPA con una plantilla nos permitirá obtener el
resultado final y hacer las conclusiones pertinentes. Presenta muchas aplicaciones, como lo son
la identificación de cepas resistentes a medicamentos. En el laboratorio de biología molecular
las aplicaciones que se da a esta técnica se divide en 2:
1. Genotipo susceptible de manifestar cierta enfermedad genética:
2. Identificación de microorganismos:
Una vez realizada la PCR de las regiones que tengamos que amplificar, en vez de
proseguir con la electroforesis, se proseguirá con esta técnica.
13.1 Genotipo susceptible de manifestar cierta enfermedad genética:
-CELIAQUIAS: La celiaquía es una enfermedad autoinmune que se caracteriza por una
inflamación crónica de la parte próxima del intestino delgado o yeyuno, causada por la
exposición a la gliadina, que es un componente del gluten, una proteína vegetal presente en
algunos cereales en la dieta.
Imagen izquierda: Maquinaria en la que se realiza el proceso LIPA. En la parte de arriba (flecha
negra) existe un soporte donde se depositan las tiras del LIPA, desde donde obtendremos el
resultado de bandas. En la parte inferior (flecha marrón) se encuentran los diferentes buffers que
harán el lavado del soporte de la parte superior.
Imagen derecha: Ejemplo de una serie de tiras pertenecientes a la detección de virus de la hepatitis
B, donde se ven diferentes marcaciones de bandas.

Existen una serie de exones que son susceptibles de manifestar esta enfermedad, y por tanto, es
la manera con la que podremos determinar si los pacientes que se les ha pedido hacer la prueba,
finalmente presentan el genotipo susceptible de padecer celiaquía. En estos casos, si sale
positiva la prueba, se le remitirá al personal facultativo para que informen a los pacientes de
una determinada dieta; en cambio, si la prueba sale negativo no quiere decir, que los pacientes
no presenten celiaquía, ya que dichos síntomas puede manifestarse por otras causas, como lo
son otras enfermedades autoinmunes o por la influencia de determinados agentes ambientales.
-NARCOLEPSIA: También conocido como síndrome de Gelineau, es un trastorno neurológico,
presenta una prevalencia muy baja en la población. La característica principal es la presencia de
periodos frecuentes de somnolencia repentina e irresistible durante el día. Puede causar
alucinaciones, debilidad extrema del conjunto muscular y trastornos del sueño. Al igual que las
celiaquías, presentan ciertos exones que son susceptibles de manifestar la enfermedad, en la
narcolepsia pasa lo mismo, y por tanto, se informará de que el paciente padece narcolepsia o no
en relación con la presencia de estos exones.
13.2 Identificación de microorganismos:
HPV.El virus del papiloma humano es un grupo diverso de virus DNA perteneciente a la
familia de los Papillomaviridae. Es un virus que se transmite a través del contacto genital. El
VPH afecta a los genitales tanto de hombres (pene y ano) como de las mujeres (cuello de útero,
vagina y ano) en las mujeres con especial prevalencia. La mayor parte de la gente infectada por
HPV desconoce que lo está .En Estados Unidos, es el virus más común transmitido
sexualmente Las muestras biológicas desde las que se extrae el material genético es a partir de
biopsias procedente de verrugas en la zona genital, citologías del cuello del útero…
En términos generales, las verrugas genitales o los cambios celulares leves del cuello de útero
de la mujer no supone un riesgo grave para la salud, sin embargo, existe un tipo de cáncer
asociado a este tipo de virus que conviene seguir su desarrollo y es por ello, que cada vez se
realizan más pruebas en el laboratorio para la detección del virus.Con esta técnica nos permitirá
también identificar el genotipo de riesgo que presenta el virus del papiloma humano que
presenta el paciente.
De alto riesgo: 16,18,31,33,35,39
De bajo riesgo: exón 6,11,40,43,44,54,70
La razón por la que en determinados estudios se realice LIPA es por el ahorro de trabajo que
produce, ya que en el mismo proceso podemos detectar la presencia de hasta 35 exones
diferentes para unas 20 muestras, esto evita el secuenciar para todos estos exones y todas las
diferentes muestras. Por otro lado, con esta técnica no nos permite determinar una mutación
puntual, ya que, sólo indica la presencia o ausencia de este exón, esto si que lo conseguimos al
hacer la secuenciación, donde podemos ver incluso el cambio de nucleótido.

14.TIPAJE DEL GENOTIPO SENSIBLE PARA WARFARINA:
14.1INTRODUCCIÓN (WARFARINA) :
4-hidroxi-3-(1-fenil-3-oxo-butil)-cumarina. Es el nombre que recibe este medicamente perteneciente a la
familia de los compuestos químicos orgánicos denominados benzoprinas. Se trata de un grupo de
compuestos químicos que se obtiene a partir del metabolismo secundario de algunas plantas.
14.2 Aplicaciones biomédicas: __________________
Esta sustancia fue la responsable de la enfermedad hemorrágica conocida históricamente como
“enfermedad del trébol dulce” del ganado que se alimenta del trébol, como forraje. A principios de los
años 20 se produjo un brote de esta enfermedad que diezmó en gran medida las reses utilizadas para fines
ganaderos en países como Estados Unidos y Canadá. En 1929, Roderick LM descubrió la causa de esta
enfermedad y demostró que era debido al mal funcionamiento
de la protombina. Posteriormente, el químico Karl Paul Link
(1940) pudo aislar este compuesto químico causante de la anti
coagulación de la sangre en mamíferos. A partir de este año,
empezó a comercializarse este compuesto químico y en 1948 se
patentó el derivado de esta misma familia de las cumarinas,
“warfarina”, nombre que deriva del acrónimo WARF
(Wisconsin Alumini Research Foundation) que era el nombre
que recibía la fundación que supo aislar este compuesto
químico, más la terminación –arina (indicador de la relación
con la familia de las cumarinas).
La warfarina se usó desde mediados del siglo XX como única aplicación en el control de plagas,
principalmente de ratones y ratas ya que presentaba mejores resultados que otros componentes utilizados
como el dicoumarol. A partir del 1954 fue aprobado su uso médico en humanos, siendo el mismo
presidente de los Estados Unidos uno de los primeros usuarios de este medicamento (1955).
14.3MECANISMOS FISIOLÓGICO:
Se sabe que el mecanismo de acción de a warfarina es la inhibición del enzima epóxido reductasa, que
interfiere en el metabolismo de la vitamina K. La vitamina K o fitomenadiona, es un compuesto químico
lipofílico requeridos en los procesos de coagulación de la sangre.

Participan en la carboxilación de ciertos residuos glutámicos de proteínas que forman residuos
gamma-carboxiglutamatos. Estos residuos modificados se sitúan dentro de los dominios específicos de la
proteína, llamados dominios Gla. Estos residuos Gla están implicados en la unión de Calcio, entre las que
están: Protombina (factor III), factores VII,IX,X, proteína C, proteína S y proteína Z.
Sin los residuos Gla sobre el amino terminal de estos factores, no logran mantener estable el endotelio de
los vasos sanguíneos y no pueden activar la coagulación que permite la formación del coágulo durante la
lesión o daño al tejido. Por este motivo a estos medicamentos también se les denomina “antagonistas de la
vitamina K”.
14.4 SENSIBILIDAD A LA WARFARINA:
El tratamiento con warfarina es un buen tratamiento para la prevención de ataques fulminantes al corazón,
trombosis venosa o embolismo pulmonar y personas que hayan presentado algún episodio de infarto de
miocardio.
Los beneficios del uso de la warfarina muchas veces se contrarresta debido al incremento de accidentes
cerebro vasculares por causa de hemorragias internas. En esta investigación realizada por el laboratorio de
biología molecular, se hará un estudio en el que relacione la sensibilidad de la warfarina en diferentes
pacientes que estén bajo el tratamiento del sintron, en relación a una serie de parámetro genéticos.
Este tipo de estudios los iniciaron en los laboratorios de biología molecular de la prestigiosa clínica
Mayo en el 2007.
-El gen CYP2C9 que se relaciona con la expresión del citocromo 450 que es una enorme y diversa
superfamilia de hemoproteínas muy conservadas evolutivamente. La principal función de este complejo
es la reacción monoxigenasa, es decir, la inserción de un átomo de oxígeno molecular en un sustrato
orgánico a la vez que el otro átomo de oxígeno es reducida a agua. Existen numerosos genes que
codifican a este tipo de enzimas. Concretamente este tipo de citocromos tienen una función concreta en
relación al metabolismo de ciertas drogas y esteroides, por lo que su interacción con el suministro del
fármaco con warfarina se verá más o menos sensible dependiendo de la expresión de este gen.
CYP2C91*2(sensibilidad normal a la warfarina) y CYP2C92*2 (sensibilidad mayor a la warfarina).
Estos alelos que presentan una mayor sensibilidad al tratamiento por warfarina estaban asociados en su
mayoría a poblaciones de descendientes asiáticos (alelo VKORC1AA) y una mayor sensibilidad para los
alelos que presenta una mayor sensibilidad a warfarina del gen CYP2C9 en poblaciones de descendencia
de “raza blanca”.
-El gen VKORC1 que se relaciona con la expresión del complejo epóxido reducatasa de la subunidad 1
de la vitamina K). Alelos VKORC1AA (sensibilidad normal a la warfarina) y VKORC1BB (menor
sensibilidad a la warfarina).
Se pudo constatar, en un estudio para 637 pacientes, que existía cierta correlación con la sensibilidad a la
administración de warfarina en pacientes que poseían alelos en estos 2 genes con una mayor sensibilidad
a la warfarina, y en consecuencia, una mayor prevalencia para ocasionarles un daño colateral ligado a este
tratamiento.
Estos alelos que presentan una mayor sensibilidad al tratamiento por warfarina estaban asociados en su
mayoría a poblaciones de descendientes asiáticos (alelo VKORC1AA) y una mayor sensibilidad para el
alelos que presenta una mayor sensibilidad a warfarina del gen CYP2C9 en poblaciones de descendencia
de “raza blanca”.

-El gen GCCX tiene un rol importante en relación al efecto de la coagulación de la sangre en
relación con la dosis de warfarina suministrada ya que está implicado en la generación de proteínas
dependientes de vitamina K. La adición de oxigeno o de CO2 provoca que se oxide la vitamina K
(reducida) o que ese carbono se una para promover la formación de factores de transcripción.
14.5 MATERIALES Y MÉTODOS:
En el hospital de la Ribera van a poner a punto este método de detección de genotipo sensible para la
dosis de warfarina en estos pacientes que están bajo tratamiento. Para ello en un primer momento se
pondrá a punto el protocolo para el tipaje del genotipo sensible para warfarina y se hará con DNA
procedente de pacientes con otras patologías y que iban a ser desechados. Por tal de poner a punto el
protocolo deberemos asegurarnos de que la PCR que amplificará las distintas regiones de estos genes
saldrá perfecto, por eso no utilizamos DNA de los pacientes reales.
El proceso que se lleva a cabo para la determinación del genotipo presente es el siguiente:
-En primer lugar se extrae de la sangre del paciente el DNA y se codifica mediante una numeración en la
que se identificara el paciente y el procedimiento que se va a realizar.
-En segundo lugar, a partir del DNA , se hará una primera PCR de la cual se quiere conseguir que se
amplifique las regiones pertenecientes a los genes: CYP3C9 y CYP2C9 que son dos regiones del mismo
gen que codifica para la proteína citocromo p450. El gen que codifica para VKORC (vitamina K) y el gen
que codifica para el gen GGCX (gama glutamil carboxilasa). Cada una de estas secuencias presenta un
tamaño diferente y precisará de una temperatura de annealing para que cada primer se una al DNA.
GENOTIPO
SENSIBLE A
WARFARINA
2C92*2 2C93*2 VKORC1AA GGCX*
CAMBIO DE
NUCLEÓTIDO
C>T A>T G>A G>A
POSICIÓN 8633 47639 1639 6317

-Una vez ha finalizado la PCR, se hace la electroforesis del resultado de la PCR y se observa que
el tamaño de estas regiones coinciden con las del tamaño de los determinados genes.
-El siguiente paso, una vez obtenido la secuencia amplificada será hacer la PCR de secuencias, con la que
conseguiremos adicionar a los nucleótidos de los genes amplificados, los nucleótidos que emiten
fluorescencia y así poder observarlos mediante el secuenciador.
-Previamente a la secuenciación de los genes amplificados, se procede a la purificación del resultado de la
PCR de secuencias para eliminar los reactivos y dejar sólo el producto de la PCR de secuencias.
-Por último, se procede a la detección mediante el secuenciador de las secuencias amplificadas y
fluorescentes que serán detectadas y podremos observar la estructura nucleotídica que presentan para
comprobar el tipo de polimorfismo que presentan y así comprobar la sensibilidad a la warfarina de cada

paciente.
14.6 RESULTADOS:
Este estudio se realizó para 3 pacientes, de los cuáles sabemos que el paciente 1 presentaba el Factor V de
Leiden en heterozigosis, esto produce una variación en el factor V de coagulación humana que a menudo
causa un trastorno de hipercoagulabilidad. En este trastorno la variante del factor V de Leiden no puede
ser inactivada por la proteína C activada. El facto V de Leiden es el trastorno de hipercoagulabilidad
hereditario más común entre euroasiáticos. Es muy infrecuente que este trastorno cause la formación de
coágulos en las arterias, que conlleve a provocar un accidente cerebrovascular o infarto agudo de
miocardio, aunque lo más frecuente es la aparición de un pequeño derrame, conocido como un ataque
isquémico transitorio. Dado que esta enfermedad presenta dominancia incompleta, al ser heterocigotos
presentan un menor riesgo de padecer eventos tromboembólicos.
Resultados de la secuenciación (ABI3000) donde se muestra indicado el cambio de mutación
en la posición 68 correspondiente a G>A que se equipara con la posición 3588. (VKORC1)

Al observar los resultados en el anexo, podemos observar que:
GENOTIPO 2C9*2 2C9*3 VKORC1 GGCX
Paciente 1 No existe
polimorfismo
No existe
polimorfismo
Polimorfismo:G>A
(3588)
No existe
polimorfismo
No sensible a
warfarina
No sensible a
warfarina
Sensible a warfarina No sensible a
warfarina
polimorfismo
No existe
polimorfismo
No existe
polimorfismo
No existe
polimorfismo
No sensible a
warfarina
No sensible a
warfarina
No sensible a
warfarina
No sensible a
warfarina
polimorfismo
No existe
polimorfismo
No existe
polimorfismo
No existe
polimorfismo
No sensible a
warfarina
No sensible a
warfarina
No sensible a
warfarina
No sensible a
warfarina
14.7 CONCLUSIONES:
En conclusión, el uso de la warfarina ha sido muy usada para diferentes aplicaciones y ha ocasionado
numerosos beneficios para la calidad de vida de millones de personas, aún así, las numerosas
contradicciones que ocasionaba a parte de los pacientes tratados pudo ser contrarrestado gracias a los
avances en el campo de la biología molecular, al poder determinar el genotipo sensible para este
tratamiento y reducir al máximo las repercusiones que ocasionaba esta terapia. Una vez encontrada una
relación con un determinado genotipo para un tratamiento u otro de warfarina para los pacientes con
determinados síntomas, se hizo un estudió para ver el ahorro que aportaría para la sanidad de la población
de los USA y se estimó con unos 17000 $ mediante la evaluación del genotipo sensible para 85000
pacientes que se les suministraba warfarina.

15- Conclusiónes final de las prácticas:
A lo largo de mi paso por el laboratorio de Biología molecular he llegado a la conclusión de la
relevancia que tiene esta disciplina, biología molecular, debido a las múltiples aplicaciones que presenta
en el mundo de la sanidad y que con certeza, tenderá hacia una mayor importancia en los hospitales a
medida que pasen los años , con la puesta a punto de muchos otros protocolos que permitirán la detección
de otras enfermedades, detectar genotipos sensibles para determinados medicamentos, alimentos…
Todas estas técnicas, lo que permiten en definitiva, es un ahorro económico a la sanidad a largo plazo, ya
que con los resultados obtenidos, el personal facultativo tiene con la máxima certeza la información de la
causa de una determinada enfermedad que padece un paciente. Permite distinguir hasta la especie
bacteriana que podría estar causando unos determinados síntomas, determinar el tipo de virus, determinar
el genotipo sensible para determinados medicamentos u alimentos que llevaría a un ahorro muy grande
económicamente tanto para el paciente como para la sanidad pública, por otra parte también, poder
catalogar una determinada enfermedad de causa genética ya que conseguiríamos precozmente
adelantarnos para poder informar a los futuros padres de estos enfermos y al personal sanitario de cómo
tratarla cuando nazca y por último la determinación precoz de un cáncer para hacer específicamente un
tratamiento u otro. Por tanto, no es sólo un ahorro económico sino que estas técnicas aumentan la calidad
de vida de los enfermos, debido a un diagnóstico precoz y certero.
Estoy muy contento de haber realizado las prácticas en el Hospital de la Ribera y especialmente en el
laboratorio de Biología molecular y además también, es de agradecer la atención recibida por parte del
personal técnico que asiste a este departamento y de la paciencia del personal facultativo que nos han
enseñado todo el proceso y nos han hecho participes en primera persona del trabajo que se realiza en este
departamento.
Personalmente, recomendaría a cualquier estudiante de Biología que realice estas prácticas, ya que se nos
brinda la oportunidad de poder manejar estas instalaciones, con unas maquinas que son la vanguardia en
este sector y además de poder determinar por mí mismo el proceso con pacientes reales, hace que tenga
un significado todos los conceptos teóricos adquiridos a lo largo de la carrera y poder aplicarlos, sin duda,
esto es la mejor recompensa.

16. BIBLIOGRAFÍA:
Artículos científicos:
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influence on warfarin dose” Thromb Haemost. 2010 October 1; 104(4): 750–754. doi:10.1160/TH09-11-
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Food Science, Ithaca, New York, USA)
4. Dana Mierla, MD; Camelia Szmala, MD; Daniela Neacosc, MD; Ruxandra Cretua,c, MD; Veronica
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