Método de valoración culombimétrica de Karl Fischer

1. ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña
de Azúcar
ISSN: 0138-6204
revista@icidca.edu.cu
Instituto Cubano de Investigaciones de
los Derivados de la Caña de Azúcar
Cuba
Ochoa-Viñals, Nayra; Faife-Perez, Evelyn; Wei, Du; Xuebing, Zhao; Dehua, Liu
Evaluación del crecimiento de la levadura oleaginosa R. toruloides en presencia de
inhibidores del hidrolizado de bagazo de caña de azúcar
ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de Azúcar, vol. 50, núm. 3, septiembre-
diciembre, 2016, pp. 50-53
Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar
Ciudad de La Habana, Cuba
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=223152661008
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2. Nayra Ochoa-Viñals1*, Evelyn Faife-Perez1, Du Wei2, Zhao Xuebing2, Liu Dehua2
1. Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar. (Icidca). Vía Blanca 804 y Carretera
Central, San Miguel del Padrón, La Habana, Cuba
*nayra.ochoa@icidca.azcuba.cu
2. Institute of Applied Chemistry, Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084,
China
RESUMEN
La producción de lípidos a partir de la fermentación de
levaduras, con fuentes baratas de carbono como son los
hidrolizados lignocelulósicos, puede ser una alternativa
para la producción de biodiesel o alimento animal.
Varios inhibidores se pueden generar a partir de la
hidrólisis ácida, entre ellos se destacan por su toxicidad
el ácido acético, el furfural y la vainillina. La levadura
oleaginosa Rhodosporidium toruloides puede fermentar
un amplio rango de azúcares. Se añadieron inhibidores
en el medio de cultivo y se evaluó su acción sobre el cre-
cimiento y la producción de lípidos. Las concentraciones
de ácido fórmico, ácido acético, furfural y vainillina
deben ser inferiores a 2, 5, 0,5 y 1,5 g/L, respectiva-
mente. El lignosulfonato de sodio y el ácido levulínico
no tuvieron influencia sobre el crecimiento. La compo-
sición de ácidos grasos producidos por la
Rhodosporidium toruloides fue similar a los aceites
vegetales y a la grasa animal.
PALABRAS CLAVE: lípidos de levadura, hidrolizados ligno-
celulósicos, inhibidor.
ABSTRACT
Microbial lipid produced using yeast fermentation,
with cheap carbon sources such as lignocellulosic
hydrolysates, can be an alternative for the production
of biodiesel or animal feed. Several inhibitors can be
generated from acid hydrolysis, among them are noted
for their toxicity acetic acid, furfural and vanillin. An
oleaginous yeast that was identified as
Rhodosporidium toruloides, can ferment a wide range
of sugars. Inhibitors were added in the culture medium
and their action on growth and lipid production was
evaluated. The concentrations of formic acid, acetic
acid, furfural and vanillin should be less than 2, 5, 0.5
and 1.5 g/L, respectively. In contrast, sodium lignosul-
fonate and levulinic acid had no influence on growth.
The composition of fatty acids produced by
Rhodosporidium toruloides was similar to vegetable
oils and animal tallow.
KEYWORDS: yeast lipid, lignocellulosse hydrolysate,
inhibitor.
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En la actualidad, existe gran interés por el uso
de la biomasa lignocelulósica para la obtención de
lípidos a partir de microorganismos. Los lípidos
microbianos se consideran una fuente de alto
valor equivalente a la manteca de cacao y ácidos
grasos polinsaturados por lo que se consideran
como una materia prima prometedora para la pro-
ducción de biodiesel y el alimento animal (1).
Dentro de los microorganismos productores de
lípidos se pueden mencionar algunas levaduras
oleaginosas, ya que se ha observado que dichos
organismos tienen una tasa de crecimiento muy
rápida en comparación a las algas y mucho mayor
en comparación a las plantas y pueden producir
lípidos a partir de distintas fuentes de carbono
tales como xilosa, arabinosa, glicerol y distintos

3. desechos agroindustriales (2). Una de las princi-
pales fuentes de biomasa lignocelulósica en Cuba
es sin duda la industria azucarera ya que genera
2,2 t de bagazo por 1 t de azúcar producida. El
bagazo de caña de azúcar está compuesto princi-
palmente por celulosa, hemicelulosa y lignina. Los
dos primeros polímeros son hidratos de carbono
que pueden hidrolizarse en monosacáridos y se
pueden utilizar como fuente para la producción de
lípidos de levadura. Se ha demostrado que la
hidrólisis ácida diluida es un método rápido y
barato para producir azúcares de la biomasa lig-
nocelulósica (3). Sin embargo, un problema aso-
ciado con la hidrólisis ácida es la formación de
compuestos tóxicos tales como furfural, ácidos ali-
fáticos (ácido acético, fórmico y levulínico) y com-
puestos fenólicos que provocan una fuerte inhibi-
ción sobre el crecimiento de los microorganismos
(4). La cantidad de estos compuestos tóxicos varía
con el tipo de materia prima y las condiciones del
pretratamiento. El objetivo principal de este tra-
bajo es analizar la influencia de los inhibidores
formados durante la hidrólisis ácida del bagazo de
caña de azúcar sobre el crecimiento y el perfil de
ácidos grasos producidos por R. toruloides.
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Se empleó la levadura oleaginosa
Rhodosporidium toruloides (L/24-26-1). Los inócu-
los fueron preparados en el medio YPG durante 24
horas a 150 rpm. Los ensayos fueron realizados en
medio limitado de nitrógeno (C/N = 450), con los
inhibidores se utilizó el medio de cultivo control,
compuesto por 70 g/L de azucares totales (en una
relación 1:10:1 de glucosa: xilosa: arabinosa, basa-
do en la composición del hidrolizado de bagazo de
caña), 0,1 g/L (NH4)2SO4, 0,75 g/L de extracto de
levadura, 0,4 g/L KH2PO4, 1,5 g/L MgSO4*7H2O.
Los inhibidores empleados fueron ácido fórmico
(2-6 g/L), ácido acético (5-15 g/L), furfural (0,5-2,5
g/L), lignosulfonato de sodio (0,5-2g/L), vainillina
(0,5-2 g/L) y ácido levulínico (1-5 g/L), El pH del
medio fue ajustado a 5,5. La esterilización se rea-
lizó a 121 °C durante 20 min. Se utilizó como
inóculo un 10 % del pre-cultivo (v/v). Los cultivos
se mantuvieron en agitación a 30 °C y 150 rpm
durante 8 días. Los ensayos fueron realizados por
triplicado.
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Determinación de biomasa por DO y materia seca
gravimétrica
Para determinar la concentración celular se
tomaron muestras de la suspensión celular de los
erlenmeyer. Se empleó el método turbidimétrico
usando un espectrofotómetro de luz ultravioleta
Genesys-6, para realizar las lecturas de densidad
óptica a 600 nm y correlacionar esta con la con-
centración celular.
Además se utilizó el método de materia seca
gravimétrica. Las muestras tomadas fueron cen-
trifugadas (Centrifuge 5804R) durante 10 min a
13000 r.min-1, al sedimento colectado se le reali-
zaron lavados con agua destilada y se secaron en
estufa (Memmert 854 Schwabach) a 60 °C duran-
te 24 horas.
Análisis de azucares e inhibidores por HPLC
Se determinó la concentración de glucosa,
xilosa, arabinosa, ácido acético, ácido fórmico y
furfural en los sobrenadantes de los medios de
cultivos durante la fermentación. Esto se realizó
mediante Cromatografía Líquida de Alta
Resolución (HPLC) (Shimadzu10AVP, Japón),
equipado con un detector de índice de refracción
RID-10A. Se empleó una columna de fase reversa
Aminex HPX-87H (300 X 7,8 mm, Bio-Rad,
EE.UU.) a 65 ºC con 5 mM H2SO4 como fase
móvil a una relación de flujo 0,8 ml/min.
Extracción de lípidos y determinación de la com-
posición de ácidos grasos
La determinación del contenido de lípidos en la
biomasa se realizó por el método de Bligh y Dyer
modificado (5). Los metil ésteres de ácidos grasos
(FAMES) obtenidos se analizaron en un cromató-
grafo de gases GC-14B. Como estándar interno se
empleó el metil éster del ácido heptadecanoico. La
temperatura de la columna se mantuvo a 180 °C
durante 0,5 min. Se calentó hasta 250 °C a una
velocidad de 10 °C/min, y luego se mantuvo cons-
tante durante 6 min. La temperatura en el inyec-
tor y en el detector se fijó a 245 y 260 °C, respec-
tivamente.
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La cepa de R. toruloides fue cultivada en un
medio suplementado con diferentes concentracio-
nes de varios inhibidores como se muestra en la
figura 1. Los resultados experimentales demues-
tran que la toxicidad de los inhibidores sobre el
crecimiento de R. toruloides está en dependencia
de la concentración de los mismos. Cuando la con-
centración de los inhibidores fue de 2 g/L, el creci-
miento de R. toruloides se inhibió completamente
en presencia de vainillina y hasta un 70 % con el
furfural. Sin embargo, en presencia de ácido fór-
51
ICIDCA sobre los derivados de la caña de azúcar 50 (3) sept. - dic., 2016

4. mico se observó una ligera inhibición de un 20 % y
con el ácido acético no se observó ningún efecto
inhibitorio a esta concentración. De forma general
se obtuvo un 50 % de inhibición del crecimiento
celular cuando las concentraciones de los inhibi-
dores fueron de: 4 g/L de ácido fórmico, 10 g/L de
ácido acético, 1 g/L de furfural y 1 g/L de vainilli-
na. El furfural y la vainillina son altamente tóxi-
cos para R. toruloides, mientras que el ácido fór-
mico y el ácido acético fueron menos tóxicos; aun-
que con el ácido fórmico se obtuvo una inhibición
más fuerte que con el ácido acético. A pesar de que
no se han descrito en la literatura los mecanismos
exactos de estos compuestos para inhibir el creci-
miento de R. toruloides, se ha informado sobre los
mecanismos de inhibición de las levaduras pro-
ductoras de etanol. Se han propuesto dos meca-
nismos de inhibición en los ácidos débiles (ácido
fórmico y acético), la hipótesis de desacoplamiento
y la hipótesis de acumulación de aniones intrace-
lulares. Ambos principios indican que los ácidos
débiles disminuyen el pH intracelular, dando
lugar a una disminución de los niveles de ATP
intracelular (teoría de desacoplamiento) o a la
inhibición de las actividades de algunas enzimas
celulares (teoría de la acumulación de aniones
intracelular). El ácido fórmico mostró mayor inhi-
bición que el ácido acético debido a una mayor aci-
dez. Además el tamaño molecular más pequeño de
ácido fórmico hace más fácil la difusión a través de
la membrana plasmática provocando una mayor
acción inhibitoria.
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En la figura 2 se muestra
el perfil de ácidos grasos
producidos por R. toruloides
en presencia de concentra-
ciones no inhibitorias de fur-
fural, ácido acético, ácido
fórmico y vainillina.
Las principales composi-
ciones de ácidos grasos de
los lípidos fueron, C16:0,
C18:0, C18: 1 y C18: 2, que
representaron el 26, 10, 50 y
10 % del total de ácidos res-
pectivamente El ácido oleico
fue el ácido graso más abun-
dante, iguales resultados
han sido informados por Hu
et al. (3). Sin embargo el
contenido de C18: 2 fue
mayor que el encontrado por
estos autores. Este ácido
graso proporciona una cali-
dad superior de incendio,
punto de fusión ideal, visco-
sidad cinemática, así como
la mejora de la estabilidad
oxidativa.
Según los resultados
experimentales, la adición
de ácido fórmico, ácido acéti-
co, vainillina y SLS no pro-
dujo diferencia significativa
en la composición de ácidos
grasos. Esto demuestra que
estos compuestos no afectan
significativamente la ruta
biosintética de los ácidos
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1. Efecto del ácido acético, furfural, ácido fórmico, vaini-
llina, ácido levulínico y lignosulfonato de sodio (SLS) sobre el cre-
cimiento celular en R. toruloides.
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2. Contenido relativo de ácidos grasos en R. toruloides cul-
tivada con inhibidores. La fermentación se realizó en cultivo dis-
continuo a 30 °C ,150 r.min-1 durante 168 h.

5. grasos. Sin embargo, en presencia de furfural los
ácidos grasos C16:0 y C18:0 disminuyeron pero el
C18: 1 se incrementó en un 10 % respecto al con-
trol, este comportamiento también se informó por
otros autores (6). Parece que el furfural podría
incidir más en las rutas de biosíntesis de ácidos
grasos insaturados. El perfil de ácidos grasos de
esta levadura está en el intervalo de diversos acei-
tes vegetales y grasa animal, lo que indica que
podría ser utilizado como materia prima de bio-
diesel y/o uso en la alimentación animal (7).
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• El estudio de la acción de algunos inhibidores
demostró que para obtener niveles de produc-
ción de biomasa para una inhibición de un 50 %,
las concentraciones del ácido fórmico, ácido acé-
tico, furfural y de vainillina deben ser menores
de 4, 15, 1 g/L y 2 g/L, respectivamente.
• La adición de ácido fórmico, ácido acético, vaini-
llina y lignosulfonato de sodio no causó diferen-
cias significativas en la composición de ácidos
grasos de los lípidos producidos por R. toruloides.
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