GGGG

1. Ainoa Sánchez , Raquel Rodríguez , Monika Coton , Emmanuel Coton ,
Mónica Herrero , Luis A. García, Mario Díaz (2010)

2. El Aislamiento de cepas de tipo salvaje de los
productos tradicionales es un método clásico
para obtener cultivos iniciadores para la
fermentación de alimentos (Leroy & De Vuyst,
2004). Mediante el uso de cepas de tipo salvaje
seleccionados, se puede desarrollar la
producción a gran escala de los alimentos
fermentados sin perder su sabor único y
características particulares (y Caplice Fitzgerald,
1999). Un proceso de fermentación maloláctica
adecuada (FML) es fundamental para garantizar
un alto estándar de calidad de sidra.

3. Ahora Todavía no se emplean cultivos
iniciadores de bacterias del ácido láctico (BAL)
para asegurar su correcto desarrollo a la sidra,
como ocurre en la industria del vino.
Debido a este hecho, es importante desarrollar
cultivos malolácticos iniciadores adecuados,
para llevar a cabo el proceso de una manera
controlada. Los cultivos iniciadores deben ser
LAB indígenas bien adaptadas que participan en
el proceso tradicional (Herrero, de la Roza,
García, y Díaz, 1999).

4.  se han considerado para el muestreo las
cuatro áreas principales de elaboración de
sidra tradicional en Asturias (distante
aproximadamente a nivel local 30 km).
 Las bodegas de sidra seleccionadas, nunca
habían usado arrancadores o iniciadores
comerciales (ni para FML, ni para alcohólica
fermentación).
 Se tomaron muestras en condiciones asépticas
e inmediatamente fueron transportadas al
laboratorio.
Muestreo y preparación del inóculo.

5.  Se mezclaron 25 ml por cada muestra y se
centrifugó. El sedimento se re suspendió en 5 ml
de sidra verde estéril (zumo de manzana justo
después de que la fermentación alcohólica se ha
completado).
 Este volumen fue utilizado como inóculo para el
FML, que se llevó a cabo bajo condiciones
controladas, condiciones de laboratorio.
 La enumeración de LAB se realizó por el método
de la placa de recuento estándar en MRS (Biokar
Diagnostics) complementada con 5% (v / v) de
etanol y 100ppm de pimaricina para inhibir el
crecimiento de la levadura.

6.  Las placas se incubaron bajo condiciones
anaeróbicas para inhibir las bacterias del
ácido acético, a 30 ° C durante 15 días.
Además, las levaduras se enumeraron en agar
YPD.
 Al momento de la inoculación, la población
LAB era 3,7 104 CFU / ml, y la población de
levaduras fue de 4,2 105 UFC / ml, en el
cultivo iniciador.

7. Fermentación alcohólica
 El concentrado de manzana (suministrado por una fábrica de sidra
industrial) se reconstituyó con agua destilada (1: 5) y esterilizado en
un dispositivo tangencial de filtración de flujo (Pellicon 2, Millipore)
utilizando membranas polietersulfona (diámetro 0,22 micras de
poro).
 En el jugo de manzana estéril se rehidrata una preparación
comercial seca activa de Saccharomyces cerevisiae var. Bayanus y se
cultiva bajo condiciones aeróbicas (250 rpm, 28 ° C durante 18 h).
 El Zumo de manzana es entonces inoculado con levadura a una
concentración final de 106 CFU / mL.
 La fermentación Alcohólica se llevó a cabo la en condiciones
controladas de laboratorio a 15 ° C en estático y se consideró
terminado cuando la gravedad específica alcanzó 1,006 g / L.
Después de eso, la sidra verde se filtró utilizando una membrana
celulosa de nitrato de (0,45 m de diámetro de poro) para retirar las
levaduras.
 Las características Finales de sidra verdes fueron: pH 3,68, 5,6% v /
v de etanol, reduciendo azúcares 4,3 g / L y 4,8 g / l de ácido
málico.

8. Fermentación maloláctica
 El Filtrado de sidra de verde (200 ml) se
inoculó con el inóculo preparado como se
describe anteriormente. Las fermentaciones
se llevaron a cabo en dos botellas de 100 pre-
esterilizados ml llena a la capacidad, como
experimentos independientes, a 15 ° C, en
estático. La FML se consideró completa
cuando el ácido málico residual era aprox. 0,5
g / L.

9.  Capacidad fermentativa
Los cultivos madre congelados fueron cultivadas por
primera vez en MRS. A continuación, los precultivos
seleccionados de LAB se cultivaron en jugo de
manzana, preparado como se describe anteriormente,
la levadura complementada con extracto de 0,5% (w /
v) y se esterilizó por flujo filtración tangencial (0,22 μm
de diámetro de poro). Los precultivos de LAB se
incubaron en estático por 96 horas a 30 ° C. Para
empezar la MLF, la sidra verde obtenida como se
describe (como en 2.2.1) se inoculó con 106 UFC / ml
de cada precultivo, como los experimentos de
fermentación independientes duplicados.
La bioconversión maloláctica se llevó a cabo como se
describe anteriormente y su evolución fue controlada
por el monitoreo de ácidos de pH y orgánicos (málico
y láctico ácidos)

10.  Para controlar la evolución MLF, se recogieron
muestras alternativamente a partir de los dos
frascos de fermentación, aproximadamente
cada 12 h o 24 h, hasta el final del proceso. Para
cada tiempo de muestreo, fueron colectados
duplicados para análisis químicos,
microbiológicos y moleculares.
 Para llevar a cabo los análisis químicos, las
muestras se filtraron inmediatamente por
membrana (0,45 micras de tamaño de poro) y
congelado (-20 ° C, en 2 ml viales) hasta el
análisis cromatográfico.

11.  Fue usado Un medidor de pH (Crison micropH
2001), la realización de tres mediciones de pH en
cada muestra.
 Los acidos Málico y láctico fueron anlisados por
HPLC (Alliance 2690; Waters) equipado con un
detector matriz de fotodiodo (Waters 996). Se usó
una columna analítica Spherisorb ODS2 (4.6×250
mm, 3 μm, Teknokroma), siguiendo las
condiciones descritas por Picinelli et al., 2000.
 Los solvents y reactivos fueron de grado HPLC.
Los ácidos orgánicos grado analítico (acidos
málico y láctico) fueron usados como estándares
externos (Fluka and Panreac). La cuantificación se
basó en las mediciones del área de los picos, y el
tratamiento de los datos se llevó a cabo con el
“software millenium”. Los coeficientes de
variación fueron menores al 5 %.

12.  Los recuentos microbiológicos de
células viables se realizaron por el
método de la placa de conteo estándar.
Para cada tiempo de muestreo, los
recuentos de bacterias totales se
realizaron por triplicado, en diluciones
(25-250 colonias por placa) en MRS
suplementado como se describe.

13.  2.3.2.1. La identificación de especies. Para la
identificación molecular, las colonias se
seleccionaron al azar a partir de placas de Petri
que contenían aproximadamente 50 colonias.
 2.3.2.2. La detección de la presencia de genes
relacionados con el deterioro sensorial.
 2.3.2.3. La detección de la presencia de genes
relacionados con la producción aminas
biogénicas. Para garantizar la seguridad
alimentaria en las cepas seleccionadas, se
analizó el potencial para la producción de
aminas biógenas

14. En todos los experimentos (para
la detección de cepas viscosas,
acroleína y aminas biogenéticas
involucradas con la producción de
cepas ) , los productos
amplificados se involucraron con
gel de agarosa al 0.8%( BIO-
RAD) en tampón 1X TBE A 100
V y se visualizaron con tinción de
bromuro de etidio usando un
transiluminador UV( VILBERT
LOURMA).

15. Especie Gen Numero de cepa fuente
Lactobacillus 30° odc +, hdc + ATCC 33222 Colección de cultura
tipo americana
Lactobacillus
collinoides
gdh + IOEB 9527 Faculté d’Oenologie
de Burdeos, Francia
Lactobacillus
collinoides
TBRA4 Este trabajo
Lactobacillus
buchneri
hdc+ DMSZ 5987 Colección German
de microorganismos
y culturas celulares
Oenococcus oeni TBRA 5 Este trabajo
Pediococcus
parvulus
dps + IOEB 8801 Faculté d’Oenologie
de Burdeos, Francia
Pediococcus
parvulus
TBRA6 Este trabajo
Tabla 1:
Especies, identificación y origen de las cepas bacterianas
estudiadas.

17. DISCUSIONES:
A 15 ° C, la tasa de consumo de ácido málico
es más lento que a mayores (20-25 ° C),
aunque el ácido málico puede ser
completamente degradado a ambas
temperaturas (Herrero et al., 1999).
La baja temperatura de fermentación es una
práctica ampliamente preferida en la
elaboración de la sidra ya que las altas
temperaturas de fermentación conducirían a
la formación de productos finales
indeseables volátiles debido al metabolismo
de la levadura (Herreroet al., 1999).
Los depósitos de acero inoxidable
refrigerados utilizados para el muestreo de
las seis bodegas industriales se mantuvieron
a 15 ° C durante el proceso

18. Discusión:
La evolución de la FML bajo condiciones controladas
de laboratorio
Fig. 1. Evolución de la FML después de la inoculación (t =
0 h ) con el uso del Inóculo mixto (de producciones
industriales ): pH ( ▲ ) , ácido málico y ( ♦ ) ácido láctico (
■ ) .
Como se
muestra en la
Fig. 1, el
extremo de la
FML se alcanzó
alrededor de
140 h después
de la
inoculación,
cuando
aproximadame
nte el 88% del
ácido málico
total fue
consumido.
Se observó una
variación
unitaria de 0,3
de pH.

19. La población LAB fue seguida durante la FML y los resultados
obtenidos se muestran en la Fig. 2.
Fig. 2. La sucesión de LAB (a nivel de especie) durante la
FML: Lactobacillus collinoides (gris); Oenococcus oeni
(blanco), Pediococcus parvulus (negro) y (♦) la evolución de
la población de las LAB viable.
La población de
BAL se mantuvo
casi constante
aproximadamen
te durante los
primeras 88 h.
Desde este
momento, la
fase exponencial
dio su inicio y la
población
aumentó casi un
orden de
magnitud

20. Basándose en los resultados obtenidos, se pudo confirmar que las LAB
en el inóculo mixto procedentes de las muestras correspondientes al
IVA de seis bodegas industriales seleccionadas, eran adecuados para
llevar a cabo con éxito la FML, incluso bajo las duras prácticas de
elaboración de sidra utilizadas
Identificación molecular de las LAB
Un total de 84 cepas Gram-positivas y aislamientos negativos de catalaza que
fueron identificados durante la fermentación (40 bacillus y 44 coccus);todos
los aislados fueron identificados a nivel de especie mediante herramientas
moleculares. Durante toda la FML los Lactobacillus collinoides fueron la
especie más abundante (42,8% de del total de los aislados), seguido de O. oeni
(28,6%), Pediococcus parvulus (21,4%) y otras especies menores (<10%) como
Lactobacillus casei (6%) y ethanodurans Pediococcus (1%)

21.  Dado que tanto P. parvulus y L. collinoides
especies han sido ampliamente descritas como
productoras de compuestos indeseables desde
un punto de vista organoléptico, las cepas se
analizaron con el fin de evaluar si llevan los
genes relacionados con estas posibles
alteraciones. La cepa O. oeni también fue
probada.

22.  Con respecto a la viscosidad, se puso a prueba
la amplificación del gen dps, ya que es
considerado como un precursor para la enzima
glucano sintetasa responsable de la producción
de exopolisacáridos.
 Los resultados obtenidos mostraron que la cepa
de P. parvulus TBRA6 lleva el gen dps
mientras que la cepa O. oeni TBRA5 fue
negativa para este gen (Fig. 4).

23. • Figura 4. Multiplex PCR basado en la
detección de dps + cepas aisladas de la
FML. Fila 1, H2O control negativo; 2,
control positivo (IOEB 8801); 3, O. oeni
cepa TBRA5 y 4, P. parvulus cepa TBRA6.

24.  La expresión de la enzima diol deshidratasa en
un medio que contiene glucosa y su capacidad
degradante de glicerol, puede conducir a la
alteración de amargura.
 La detección PCR se centró en el gen
codificador para la enzima diol deshidratasa.
Para ambas cepas TBRA4 y TBRA5, los
resultados obtenidos fueron negativos (Fig. 5).

25. • Figura 5. Multiplex PCR basado en la
detección de pdu + cepas aisladas de la
FML. Fila 1, H2O control negativo; 2,
control positivo (IOEB 9527); 3, L.
collinoides cepa TBRA4 y 4, O. oeni cepa
TBRA5.

26.  Putrescina, histamina y tiramina se han
descrito como las aminas biógenas
prevalecientes presentes en la sidra.
 Los resultados obtenidos (Fig. 6) mostraron que
sólo TBRA4 lleva el gen de la ornitina
descarboxilasa. Las cepas ensayadas fueron
negativas para los genes de la histidina y
tirosina descarboxilasa.

27. • Figura 6. Multiplex PCR basado en la detección
de hdc /tyrdc /odc cepas aisladas de la FML.
Fila 1, H2O control negativo; 2, control positivo
(ATCC 33.222); 3, control positivo (DMSZ 5987);
4, L. collinoides cepa TBRA4; 5, O. oeni cepa
TBRA5 y 6, P. parvulus cepa TBRA6.

28.  A partir de este trabajo se puede concluir que
L. collinoides, O. oeni y P. parvulus fueron las
especies dominantes que intervienen en la
dinámica del proceso de la FML, durante la
producción espontánea de sidra. Sin embargo,
en las mismas condiciones sólo L. collinoides y
O. oeni podrían llevar a cabo la FML. Por
último, y en base a los resultados aquí
obtenidos, la cepa O. oeni resulta ser la más
adecuada para ser utilizada como un cultivo
iniciador maloláctico en la producción de sidra.

30. P. PARVULUS
 P. parvulus es capaz de tolerar los condiciones
ambientales cambiantes asociados a la FML en
vinos que presentan un pH superior a 3.5 .
 Sin embargo en la sidra, P. Parvulus es la
especie más incriminada frecuentemente en la
alteración de sidra llamada "viscosidad“.

31.  Aunque L. Collinoides y P. Parvulus pudieran estar
relacionadas con algunas alteraciones de la sidra, se
señalo que especies pertenecientes a
Pediococcus o géneros Lactobacillus pueden contribuir
a alcanzar características de calidad deseables en el vino.
 El papel desempeñado por las diferentes especies
de Pediococcus y Lactobacillus en la sidra y su impacto
global en las propiedades organolépticas todavía sigue
siendo desconocido. Los mecanismos específicos por los
cuales el sabor es generado aún no se entienden
completamente (Leroy, & De Vuyst, 2004).

32. La calidad del vino
depende de diferentes
condiciones:
 El crecimiento de
determinadas especies o
cepas
 Interacciones
metabólicos entre ellas
 De las prácticas de
elaboración del vino
 De una combinación de
todos estos factores.

33. Evolución de la FML en el laboratorio:
 Esto involucra a
los Lactobacillus, Oenococcus y Pediococcus
encontrados a lo largo de la FML.
 Como se muestra (Fig. 2), L. Collinoides estuvo
presente durante todo el proceso. fue la especie
predominante durante la Fase lag (0-15 h) .
Fig. 2. La sucesión de LAB (a nivel de especie) durante la FML: Lactobacillus
collinoides (gris); Oenococcus oeni (blanco), Pediococcus parvulus (negro) y
(♦) la evolución de la población de las LAB viable.

34.  Estos resultados concuerdan con otras
observaciones en vino de varios países,
indicando que la O. oeni es la especie
predominante dirigiendo la FML.
 En vinos de pH por debajo de 3,5 generalmente
contienen sólo cepas O. oeni, mientras que los
vinos con pH por encima de 3.5 puede contener
varias especies así como Pediococcus y Cepas
heterofermentativas de Lactobacillus (Wibowo
et al., 1985).
 En este trabajo, durante la FML de la sidra, el
pH se mantuvo siempre por encima de 3,5.

35. Capacidad fermentativa de cepas
representativas pertenecientes a las Especies
aisladas como cultivos puros:
 A fin de evaluar si, individualmente, las tres
principales especies aisladas (L. collinoides, O.
oeni y P. parvulus) fueron capaces de conducir
con éxito La FML en la sidra, una cepa
representativa de cada especie fue
probado para ser utilizado como cultivo puro.

36.  En primer lugar, el análisis de los
polimorfismos interespecificos en la
secuenciación de los 16S rRNA de los 84
aislamientos fue comparado para cada especie
Individualmente.
- Resultado: Todas las secuencias de cada
especie (36 L. collinoides, 24 de O. oeni y
18 P.parvulus) no mostraron diversidad.

37.  Como el análisis de los polimorfismos
interespecificos en 16S rRNA no generó un
criterio de selección, se eligio una cepa
perteneciente a L. collinoides (TBRA4), O.
oeni (TBRA5) y P. parvulus (TBRA6) aislados
en la mitad de la FML (66 h).
 Cuando el ácido málico fue degradado a una
velocidad elevada, fueron seleccionados para
probar su capacidad fermentativa en sidra
verde como cultivos puros.

38. Fig 3. Málico (símbolos abiertos) y láctico (símbolos rellenos) evolución de ácidos
tras la Inoculación individual (t = 0 h) con las cepas seleccionadas de cada especie
(aislados): cepa TBRA4 (L. collinoides) (♦) , cepa TBRA5 (O. oeni) (●), y cepa
TBRA6 (P. parvulus) (■).