MEDIOS DE CULTIVO, COLORACIÓN Y/O TINCIÓN DE GRAM

1. UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL DE LA
AMAZONIA
FACULTAD DE INGENIERÍA Y CIENCIAS AMBIENTALES
CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERIA
AGROINDUSTRIAL
Practica: N° 01
MEDIOS DE CULTIVO, COLORACIÓN Y/O TINCIÓN DE
GRAM
ASIGNATURA: MicrobiologíaAgroindustrial.
DOCENTE: Ing.Darwin Josué Estacio Albornoz
ESTUDIANTE: Jorge RobinsonYagkug Mantu
CICLO: V
FECHA DE ENTREGA: 19 / 02 /18
SEMESTRE: 2018-0
YARINACOCHA _ PUCALLPA
PERÚ

2. I. INTRODUCCION
La práctica realizada en laboratorio de agua se trata de preparación de materiales y medios
de cultivo para el aislamiento de análisis microbiológicos de muestras liquidas y sólidas. Un
medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe
estar exento de todo microorganismo contaminante.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir
una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno
adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad.
En esta práctica se llevó a cabo el cultivo y el aislamiento de diferentes bacterias. Para ello
se empleó distintos medios de cultivo cada uno de ellos con propiedades iguales, por otra
parte, para llevar a fin dicha siembrase ha realizado cada uno diferentes métodos de cultivo.
Todo esto se realizó con la finalidad de identificar los distintos tipos de crecimiento de
algunos microorganismos dependiendo del medio de cultivo.
Los medios de cultivo se dividen dependiendo del objetivo. pueden ser clasificados por su
aspecto en: Líquidos, Semisólidos, Sólidos. Y por su uso en: Medios de cultivos básicos y
Medios de cultivos especiales como: mejorados, selectivos, diferenciales, de transporte.
(Madigan, 2004).
II. OBJETIVO
 Elaborar medios de cultivo sólido y líquido para el crecimiento de
microorganismos
III. MARCO TEORICO
Para aislar e identificar una especie bacteriana del medio y de otra especie que pueda
confundirse morfológicamente es necesario usar medios de cultivo, ya que nos permite
diferenciar las características de crecimiento de las bacterias y establecer su identidad
según el medio de cultivo que se usa.
Los microorganismos se encuentran en muchos ambientes naturales como el agua, el
suelo, aire, el hombre y otros seres vivos, alimentos entre otros, haciendo parte de los

3. diferentes ecosistemas. Por esto se deben usar los medios de cultivo adecuados que se
asemejen al ambiente si queremos posibilitar el crecimiento de la bacteria.
Un medio de cultivo está diseñado para posibilitar el desarrollo y nutrición de las bacterias
por esto cuenta con una cantidad sustancias como: carbono, agua, azufre, fosforo,
nitrógeno, potasio, sodio, magnesio, entre otros. También su crecimiento depende de
muchos factores entre ellos: un PH preferiblemente neutro, humedad, oxigeno,
temperatura, presión osmótica todo esto en condiciones adecuadas.
Los medios de cultivo se clasifican dependiendo de las características que se necesiten
para su óptimo desarrollo los cuales según su consistencia pueden ser.
Liquido:
no contiene agar y favorece el crecimiento de bacterias ya que las bacterias poseen una
gran libertad de movimiento y al difundirse por todo el medio encuentra su componente
nutritivo y requerimiento de oxigeno más optimo con gran facilidad.
Solidos:
su concentración de agar es de 1.5% a 2%, en estos las bacterias crecen con mayor
dificultad, ya que los nutrientes pueden agotarse fácilmente, se utiliza para ver colonias,
aislar microorganismos, características de crecimiento, color, tamaño, taxonomía, entre
otros.
semi-solidos:
su concentración de agar es de 0.5% y se utiliza para estudiar el moviente de algunas
propiedades químicas.
PREPARACIÓN DE LOS MATERIALES.
Los materiales que se usan para el análisis microbiológico deben ser esterilizados por calor
seco o calor húmedo según sea su aplicación.
Esterilización:
Es el proceso mediante el cual se eliminan todas las formas de vida incluyendo las esporas
bacterianas. Se realiza por métodos físicos o químicos (Salazar Wilson. 2007).

4. Autoclave:
Horno a presión, consiste en una cámara en la que el aire puede ser sustituido por vapor
de agua sometida a presión. Se opera a 121ºC y 1 ATM. De presión durante 20 minutos.
De esta forma se consigue destruir todas las formas vegetativas y esporas. Se lo utiliza
para esterilizar todo material resistente a esa temperatura y es muy utilizado para la
esterilización de medios de cultivos.
Estufa:
Calor seco a alta temperatura, 20 minutos durante 180º, 60 minutos a 160º, siendo
suficiente la esterilización durante 60 minutos a 100-140º, se lo utiliza para esterilizar
material de vidrio debidamente envuelto en papel, metal. etc.
MEDIOS DE CULTIVO PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS.
Un medio de cultivo consta de un gel o una solución que cuenta con los nutrientes
necesarios para permitir, en condiciones favorables de pH y temperatura, el crecimiento de
virus, microorganismos, células, tejido vegetales o incluso pequeñas plantas. Según lo que
se quiera hacer crecer, el medio requerirá unas u otras condiciones. Generalmente se
presentan desecados en forma de polvo fino desecados en forma de polvo fino o granular
antes de ser preparados; ya preparados pueden encontrarse en estado sólido, semisólido
o líquido. El objetivo último del cultivo es variado: antibiograma, identificación,
multiplicación. Uno de los sistemas más importantes para la identificación de
microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales
preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos
es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han
preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes (Jawetz Ernest. 2002).
Según M.J. Pelczar y R.D. Reid.1996. Afirma que los medios de cultivos permiten el
crecimiento y desarrollo de microorganismos, gracias a que proporcionan sustancias
nutritivas.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir
una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno
adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe
contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo
microorganismo contaminante.

5. Lisina Hierro Agar.
Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella
spp., basado en la decarboxilación / desaminación de la lisina y en la producción de
ácidosulfhídrico.
produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilación de la lisina, tiene lugar en
medio ácido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada.
Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores
de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las
24 hr de incubación se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas,
y el fondo amarillo.
Agar lisina hierro.
Composición
Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones
Peptona de gelatina 5.0 Suspender 35 g del medio deshidratado en
un litro de agua destilada. Dejar embeber
unos 15 minutos. Calentar
cuidadosamente, agitando con frecuencia
y hervir durante un minuto hasta la
disolución completa. Distribuir y esterilizar
a 121°C durante 15 minutos. Enfriar en
pico de flauta dejando un fondo vertical
apto para la punción.
Extracto de levadura 3.0
Glucosa 1.0
Lisina 10.0
Citrato de hierro y amonio 0.5
Tiosulfato de sodio 0.04
Púrpura de bromocresol 0.02
Agar 15.0
pH final: 6.7 ± 0.2

6. IV. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS
4.1. Materiales
 pipeta
 vaso de precipitación
 placa Petri
 mechero de alcohol
 matraz Erlenmeyer
 asa de siembra
 tubos de ensayo
 algodón
 probeta
 papel Kraft
4.2. equipos
 Microscopio
 incubadora
 Autoclave
 Balanza electrónica
4.3. Reactivos
 Medio de cultivo de agar
 peptona
 Agar lisina de hierro
 agua destilada
V. METODO Y PROCEDIMIENTO
En la práctica realizada se procedió de la siguiente manera:
Cada alumno esterilizo los materiales de vidrio previamente envueltos en papel kraft a la
temperatura correspondiente y tiempos correspondientes. Los medios de cultivo se
prepararon según instructivos para el reconocimiento y recuento de bacterias. Todo el
material será rotulado y guardado en los casilleros respectivos.

7. 5.1. Procedimiento de preparación de muestras solidas
 Preparación de agar plate count
 Grupo de tres estudiantes cada uno utilizado 6 tubos total 18 tubos de
ensayo.
 Cada placa Petri contiene 15ml
15 x 18 = 270ml
23.5 1000ml
X 270ml
X= 6.35
 Preparación de la peptona
Pesamos 1 gr de peptona para diluirlo en 100 ml de agua destilada.
Procedimiento
Para ese caso se procederá de la siguiente manera (siguiendo las instrucciones de la
etiqueta del frasco):
 Pesar 23.5 g. de agar Plate count
 Diluirlo en 1 L de agua destilada dentro del matraz
 Corregir pH a con NaOH 10N, o HCl 0.1N.
 Aforar hasta volumen definitivo
 Cubrir el matraz con tapón de algodón y autoclavear a 15 lb, 120°C
durante 15 min.
 Una vez transcurrido el tiempo se procedió a enfriar las muestras hasta
los 40 ºC.
 Vaciar en placas Petri dentro de campana de flujo laminar.
 Después se coloca 90 ml de agua peptonada en un matraz Erlenmeyer
con ayuda de la probeta, luego se agrega la muestra (agua lavado de
guayaba). Seguidamente se agita por un lapso de tiempo. Así se obtiene
dilución 10-1
 Luego en dos tubos de ensayo se coloca 9 ml de agua peptonada,
obteniéndose así la dilución 10-2
y 10-3

8.  En segunda se pipetea una porción de 1 ml de solución 10-1
al tubo de
dilución 10-2
.
 Luego se agita cuidadosamente en el agitador bortex.
 Después se pasa con la misma pipeta 1ml de la dilución 10-2
al tubo de
dilución 10-3
.
 En seguida se agita cuidadosamente en el agitador bortex.
 Se agregó rápidamente a las 3 placas Petri unos 15 ml de Agar plate
count y se realiza la siembra de la siguiente manera:
Placa I: testigo (agua peptonada)
 Placa II dilución 10-1
 Una vez solidificado el agar, se invierte las placas Petri para así incubar
a 37° por 48 horas. Luego se realiza el recuento en placas Petri.

9. COLORACIÓN Y/O TINCIÓN DE GRAM
I. INTRODUCCIÓN
Las bacterias son organismos procariotas, que miden uno o varios micrómetros, las
podemos diferencias en dos grandes grupos: Las bacterias Gram positivas y bacterias
Gram negativas. En términos generales, las capas que rodean a la célula bacteriana, se
conocen como envoltura celular o pared celular. La estructura y organización de ésta
difieren en las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
El componente químico común en ambas es el peptidoglucano o mureína, que es el
responsable de la forma y consistencia de la pared celular. La cantidad de peptidoglucano
de la pared de las células bacterianas varía desde el 90% en la pared de algunas bacterias
Gram-positivas hasta menos del 10% en las bacterias Gram-negativas.
La pared celular de las bacterias Gram-positivas contiene pequeñas cantidades de
proteínas y polisacáridos, a menudo también ácidos teicoicos (polímeros de ribitolfosfato o
glicerol-fosfato unidos mediante enlaces fosfodiéster) o de ácidos teicurónicos.
Estos ácidos están unidos al péptido-glucano por los fosfatos. En las proteobacterias,
Gram-negativas, la capa interna de la pared celular es pobre en peptidoglucano y la capa
externa rica en lipoproteínas y lipopolisacáridos, los cuales constituyen más del 80% del
peso seco de la pared. El espacio entre la membrana externa y la capa de peptidoglucano,
llamado periplásmico, contiene un gran número de proteínas enzimáticas (Carrillo, 2005).
A través de la coloración de Gram, podemos diferencias ambos grupos bacteriano; el
fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las
bacterias Gram (+) tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las
bacterias Gram (-) tienen una capa de peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica
externa. Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con
etanol que arrastrará al colorante sólo en las Gram negativas, mientras que en las Gram
positivas el colorante queda retenido y las células permanecerán azules. Las células Gram
negativas se teñirán después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan
observarse. (Jawest, 2005).

10. II. Objetivos:
 Diferenciar frente al microscopio las bacterias Gram positivas y Gram
negativas.
III. Materiales:
 Cofia
 Mascarilla
 Guante
 Alcohol
Material biológico:
 Guayaba
Material de vidrio:
 Láminas porta objeto
 Láminas cubre objeto
 Gotero Pasteur
 Mechero
Reactivos:
 Cristal de violeta
 Lugol
 Alcohol acetona
 Safranina
Equipo:
 microscopio
 Cuaderno
 Plumón Indeleble
 Lápiz o lapicero


11. IV. PROCEDIMIENTO
1.1. Coloración diferencial de Gram
 Con un asa o mondadiente picar una colonia de Escherichia coli y
Bacillus, y colocarlo sobre una lámina porta objeto.
 Bañar con cristal violeta esperar 1 minuto
 Lavar con agua destilada o agua de caño
 Agregar Lugol esperar 1 minuto
 Lavar con agua destilada o agua de caño
 Decolorar con alcohol acetona esperar 20 segundos
 Lavar con agua destilada o agua de caño
 Aplicar la safranina esperar 30 segundos
 Lavar y secar

12. V. DISCUSION
 Discusión de medios de cultivo
M.J. Pelczar y R.D. Reid (1996) Afirma que los medios de cultivos permiten el
crecimiento y desarrollo de microorganismos, gracias a que proporcionan sustancias
nutritivas.
En la practica realizada de medios de cultivo de agar plate count con el material
biológico de guayaba se observó el crecimiento de bacterias en placas Petri.
 Discusión de coloración Gram
Según (Jawetz Ernest, 2002), se denominan bacterias Gram positivas a aquellas
bacterias que se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram, de ahí el nombre
de "Gram negativas" o también "Gram positivas” se denominan bacterias Gram
negativas a aquellas bacterias que no se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de
Gram, y lo hacen de un color rosado tenue, de ahí el nombre de "Gram negativas" o
también "Gram positivas. Se puede observar las diferencias entre Gram positiva y Gram
negativas.
VI. CONCLUSION
 Conclusión de medios de cultivo
En la práctica realizada de medios de cultivo concluimos que a la mala
manipulación y debido a la alta temperatura no crecieron como debería de ser
algunos crecieron en otros no crecieron. Además, a ello contribuyó a que no lo
guardamos en flujo laminar donde se guarda normalmente si no guardamos en
una caja de Tecnopor.
 Conclusión de coloración o tinción de Gram
gracias a la técnica de coloración y/o tinción, que Hans Christian Gram planteo, y que
hoy en día lo usamos para la identificación de microorganismos.
Durante la práctica realizada no pudimos observar las bacterias Gram positivas y Gram
negativas por falta de microscopio.

13. VII. BIBLIOGRAFIA
 Bibliografía de medios de cultivo
 Bailey & Scott. Diagnostico microbiano. 11ª edición, editorial
panamericana. Buenos aires – argentina. 2004.
 . J. Pelczar y R.D. Reid. “Microbiología”. 2ª edición, editorial
Castillo, Estados Unidos. Pág. 59-60. 1966.
 Salazar Wilson. Guías de laboratorio de microbiología.
Departamento de publicaciones de la facultad de ciencias médicas.
Quito – Ecuador. 2007.
 Bibliografía de coloración y/o tinción de Gram
 Bailey & Scott. Diagnostico microbiano. 11ª edición, editorial
panamericana. Buenos aires – argentina. 2004.
 Jawetz Ernest, Microbiología médica, 17ª edición en español,
Manual moderno. México. 2002.
 M.J. Pelczar y R.D. Reid. “Microbiología”. 2ª edición, editorial
Castillo, Estados Unidos. Pág. 59-60. 1966.
 http://es.slideshare.net/Milvida-revisado 13-o6-16