EXTRACCION DEL ADN Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS LABORATORIO DE BIOCIENCIAS
CONTENIDO <ul><li>Generalidades sobre el ADN </li></ul><ul><li>Muestras para extracción del ADN </li></ul><ul><li>Condicio...
EL MATERIAL GENÉTICO
46 CROMOSOMAS  23 PARES DIPLOIDES UN INDIVIDUO TIENE 23 CROMOSOMAS HEREDADOS DE LA MADRE Y 23 HEREDADOS DEL PADRE CROMOSOM...
EL MATERIAL GENÉTICO   Es el responsable de transmitir los caracteres heredados de una generación a otra. Está conformado ...
EL MATERIAL GENETICO BN BN A P BN A P BN A P BASES  NITROGENADAS BN BN BN ADENINA GUANINA CITOSINA TIMINA
REGIONES  DEL ADN De secuencia única  (genes) Medianamente repetitivas Altamente Repetitivas
p q GEN REGIONES REPETIDAS HETEROCROMATINA EUCROMATINA CROMOSOMA ADN
Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN . <ul><li>Cantidad de material de partida  </li></ul><ul><ul...
MUESTRAS EXTRACCION DEL ADN <ul><li>Sangre </li></ul><ul><li>Semen </li></ul><ul><li>Saliva </li></ul><ul><li>Cabello </li...
MUESTRAS PARA EXTRACCION DEL ADN <ul><li>Sangre: derivados porfirinicos de la Hemoglobina.  </li></ul><ul><li>Manchas: sec...
REMISION PARA ANALISIS DE POLIMORFISMO MOLECULAR <ul><li>La posibilidad de extraer el material genético en cualquier indic...
REMISION DE LAS MUESTRAS  PARA ANALISIS DEL ADN <ul><li>NORMAS DE BIOSEGURIDAD. </li></ul><ul><li>CADENA DE CUSTODIA. </li...
PROTECCION DEL PERSONAL <ul><li>Prevenir contacto directo </li></ul><ul><li>Prohibir consumo de comidas y bebidas. </li></...
PROTECCION DE LA MUESTRA <ul><li>CONTAMINACION POR MATERIAL BIOLOGICO HUMANO. </li></ul><ul><li>CONTAMINACION MICROBIOLOGI...
CONTAMINACION POR MATERIAL  MATERIAL BIOLOGICO HUMANO <ul><li>Depósito de material biológico humano sobre las muestras, co...
CONTAMINACION MICROBIOLOGICA <ul><li>Este tipo de contaminación tiene lugar por el desarrollo de microorganismos y suele e...
CONTAMINACION  QUIMICA <ul><li>Presencia de productos químicos que dificultan procesos del análisis genético, como PCR y e...
TRANSFERENCIA DE INDICIOS BIOLOGICOS. <ul><li>Debido al traslado de los indicios de una localización a otra puede dar luga...
DEGRADACION DE LAS MUESTRAS <ul><li>Humedad ambiental. </li></ul><ul><li>Fenómenos meteorológicos, acción de insectos, ent...
DEGRADACION DE LAS MUESTRAS <ul><li>Exponer por mucho tiempo las muestras  a los rayos ultravioleta provoca  daños sobre l...
DOCUMENTOS   NECESARIOS <ul><li>Formulario de envio de muestras. </li></ul><ul><li>Identificacion de Muestras. </li></ul><...
FORMULARIO ENVIO DE MUESTRAS <ul><li>Investigacion solicitada: Investigacion restos de sangre. </li></ul><ul><li>Anteceden...
IDENTIFICACION DE LAS MUESTRAS <ul><li>Listado de muestras de referencia: Numero, tipo de muestra, Nombre de la persona, r...
CADENA DE CUSTODIA <ul><li>Nombre o identificación, firma. </li></ul><ul><li>Fecha y hora de la recogida. </li></ul><ul><l...
METODOS DE EXTRACCION DE ADN <ul><li>SALTING – OUT </li></ul><ul><li>CHELEX  </li></ul><ul><li>FENOL - CLOROFORMO </li></ul>
FENOL  CLOROFORMO <ul><li>Técnica Orgánica (Solventes) </li></ul><ul><li>ADN de muy buena calidad y cantidad. </li></ul><u...
CHELEX <ul><li>Técnica inorgánica </li></ul><ul><li>Previene la degradación del ADN por quelación de los iones metálicos d...
SALTING-OUT <ul><li>Técnica de tipo inorgánica </li></ul><ul><li>Utiliza reactivos bajos en toxicidad </li></ul><ul><li>Pe...
<ul><li>1.  Lisis Celular </li></ul><ul><li>2.  Extracción </li></ul><ul><li>3. Precipitación </li></ul><ul><li>4. Resuspe...
LISIS CELULAR <ul><li>Buffer de lisis I: ( lisis glóbulos rojos ). </li></ul><ul><li>-  Sucrosa </li></ul><ul><li>-  MgCl2...
EXTRACCION <ul><li>Lauril sulfato de sodio al 10%: despolariza las proteinas </li></ul><ul><li>Perclorato de sodio 5M </li...
PRECIPITACION <ul><li>Isopropanol </li></ul><ul><li>Etanol al 70% lava el exceso de sales. </li></ul>
RESUSPENSION <ul><li>Se realiza en Buffer T. E. ( Tris EDTA) o también se puede realizar en agua. </li></ul>
EXTRACCION SALTING OUT
CONCLUSIONES <ul><li>El ADN es el material genético a través del cual se transmite la información contenida en los genes d...
BIBLIOGRAFIA <ul><li>MARTINEZ JARRETA, M Begoña. La prueba del ADN en medicina forense. Masson: Buenos Aires.1999. </li></...
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Extraccion ADN

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ADN es la abreviatura del ácido desoxirribonucleico (en inglés, DNA). Constituye el material genético de los organismos. Es el componente químico primario de los cromosomas y el material del que los genes están formados.

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Extraccion ADN

  1. 1. EXTRACCION DEL ADN Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS LABORATORIO DE BIOCIENCIAS
  2. 2. CONTENIDO <ul><li>Generalidades sobre el ADN </li></ul><ul><li>Muestras para extracción del ADN </li></ul><ul><li>Condiciones sobre la remisión de muestras. </li></ul><ul><li>Métodos de extracción del ADN </li></ul><ul><li>- Salting out </li></ul>
  3. 3. EL MATERIAL GENÉTICO
  4. 4. 46 CROMOSOMAS 23 PARES DIPLOIDES UN INDIVIDUO TIENE 23 CROMOSOMAS HEREDADOS DE LA MADRE Y 23 HEREDADOS DEL PADRE CROMOSOMA S
  5. 5. EL MATERIAL GENÉTICO Es el responsable de transmitir los caracteres heredados de una generación a otra. Está conformado por millones de unidades de nucleótidos Cada nucleótido esta a su vez formado por: Base nitrogenada, Azúcar y grupo fosfato
  6. 6. EL MATERIAL GENETICO BN BN A P BN A P BN A P BASES NITROGENADAS BN BN BN ADENINA GUANINA CITOSINA TIMINA
  7. 7. REGIONES DEL ADN De secuencia única (genes) Medianamente repetitivas Altamente Repetitivas
  8. 8. p q GEN REGIONES REPETIDAS HETEROCROMATINA EUCROMATINA CROMOSOMA ADN
  9. 9. Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN . <ul><li>Cantidad de material de partida </li></ul><ul><ul><li>Número de copias de las moléculas de AN </li></ul></ul><ul><ul><li>Cantidad de tejido </li></ul></ul><ul><li>Condiciones en las que se encuentra el material de inicio (fresco, congelado, fijado) </li></ul><ul><li>Contaminantes e interferentes en el material biológico </li></ul>
  10. 10. MUESTRAS EXTRACCION DEL ADN <ul><li>Sangre </li></ul><ul><li>Semen </li></ul><ul><li>Saliva </li></ul><ul><li>Cabello </li></ul><ul><li>Hueso </li></ul><ul><li>Diente </li></ul><ul><li>Tejido </li></ul>
  11. 11. MUESTRAS PARA EXTRACCION DEL ADN <ul><li>Sangre: derivados porfirinicos de la Hemoglobina. </li></ul><ul><li>Manchas: secado. </li></ul><ul><li>Residuo metanolico: Chelex. </li></ul><ul><li>Soportes: Absorbente o no. </li></ul>
  12. 12. REMISION PARA ANALISIS DE POLIMORFISMO MOLECULAR <ul><li>La posibilidad de extraer el material genético en cualquier indicio biológico. </li></ul><ul><li>Análisis por medio de técnicas como la PCR ,ha permitido obtener ADN a partir de indicios biológicos en cantidades escasas </li></ul>
  13. 13. REMISION DE LAS MUESTRAS PARA ANALISIS DEL ADN <ul><li>NORMAS DE BIOSEGURIDAD. </li></ul><ul><li>CADENA DE CUSTODIA. </li></ul><ul><li>FORMATOS EN CASOS ESPECIFICOS. </li></ul>
  14. 14. PROTECCION DEL PERSONAL <ul><li>Prevenir contacto directo </li></ul><ul><li>Prohibir consumo de comidas y bebidas. </li></ul><ul><li>Condiciones de asepsia y material desechable. </li></ul><ul><li>Vacunación. </li></ul>
  15. 15. PROTECCION DE LA MUESTRA <ul><li>CONTAMINACION POR MATERIAL BIOLOGICO HUMANO. </li></ul><ul><li>CONTAMINACION MICROBIOLOGICA. </li></ul><ul><li>CONTAMINACION QUIMICA. </li></ul><ul><li>TRANSFERENCIA DE INDICIOS BIOLOGICOS. </li></ul>
  16. 16. CONTAMINACION POR MATERIAL MATERIAL BIOLOGICO HUMANO <ul><li>Depósito de material biológico humano sobre las muestras, con posterioridad a la toma de las mismas. </li></ul>
  17. 17. CONTAMINACION MICROBIOLOGICA <ul><li>Este tipo de contaminación tiene lugar por el desarrollo de microorganismos y suele estar favorecida por la humedad y las altas temperaturas. </li></ul>
  18. 18. CONTAMINACION QUIMICA <ul><li>Presencia de productos químicos que dificultan procesos del análisis genético, como PCR y extracción del ADN </li></ul>
  19. 19. TRANSFERENCIA DE INDICIOS BIOLOGICOS. <ul><li>Debido al traslado de los indicios de una localización a otra puede dar lugar a una contaminación o puede ocasionar la pérdida de la prueba. </li></ul>
  20. 20. DEGRADACION DE LAS MUESTRAS <ul><li>Humedad ambiental. </li></ul><ul><li>Fenómenos meteorológicos, acción de insectos, entre otros. </li></ul><ul><li>Recogida y envió al laboratorio de estas evidencias de una manera adecuada para evitar la proliferación bacteriana y por consiguiente la degradación del material genético </li></ul>
  21. 21. DEGRADACION DE LAS MUESTRAS <ul><li>Exponer por mucho tiempo las muestras a los rayos ultravioleta provoca daños sobre la estructura del ADN, o aplicar ciertos conservantes que puedan provocar efectos sobre la cadena del ADN. </li></ul>
  22. 22. DOCUMENTOS NECESARIOS <ul><li>Formulario de envio de muestras. </li></ul><ul><li>Identificacion de Muestras. </li></ul><ul><li>Cadena de Custodia. </li></ul>
  23. 23. FORMULARIO ENVIO DE MUESTRAS <ul><li>Investigacion solicitada: Investigacion restos de sangre. </li></ul><ul><li>Antecedentes y datos sobre el caso: Causa de los hechos, lugar, fecha. </li></ul><ul><li>Datos de la victima: Edad, sexo, Grupo poblacional, causa de la muerte, relacion con el sospechoso. </li></ul><ul><li>Datos del sospechoso: </li></ul>
  24. 24. IDENTIFICACION DE LAS MUESTRAS <ul><li>Listado de muestras de referencia: Numero, tipo de muestra, Nombre de la persona, relación con el caso. </li></ul><ul><li>Listado de indicios biológicos: numero de referencia, tipo de muestra (toma vaginal), a quien pertenece y localización, tipo de indicio a estudiar. </li></ul>
  25. 25. CADENA DE CUSTODIA <ul><li>Nombre o identificación, firma. </li></ul><ul><li>Fecha y hora de la recogida. </li></ul><ul><li>Condiciones de almacenaje de las muestras hasta su envío. </li></ul>
  26. 26. METODOS DE EXTRACCION DE ADN <ul><li>SALTING – OUT </li></ul><ul><li>CHELEX </li></ul><ul><li>FENOL - CLOROFORMO </li></ul>
  27. 27. FENOL CLOROFORMO <ul><li>Técnica Orgánica (Solventes) </li></ul><ul><li>ADN de muy buena calidad y cantidad. </li></ul><ul><li>Peptidos y proteinas son extraidas en la fase organica (Fenol), después se realiza digestión con proteinasa K. </li></ul><ul><li>El cloroformo permite que todo el fenol pueda ser lavado. </li></ul><ul><li>DESVENTAJAS : </li></ul><ul><li>Reactivos altamente tóxicos </li></ul><ul><li>Perdidas significativas de ADN y mucho mas si esta degradado. </li></ul>
  28. 28. CHELEX <ul><li>Técnica inorgánica </li></ul><ul><li>Previene la degradación del ADN por quelación de los iones metálicos durante la ebullición al 5%. </li></ul><ul><li>Tiene copolimeros de estireno dibenzeno- inones iminodiacetato. </li></ul><ul><li>los reactivos no son tóxicos y no se pierde ADN. </li></ul><ul><li>DESVENTAJAS : </li></ul><ul><li>El ADN aislado es de cadena sencilla, utilizado en PCR pero no en RFLPS. </li></ul>
  29. 29. SALTING-OUT <ul><li>Técnica de tipo inorgánica </li></ul><ul><li>Utiliza reactivos bajos en toxicidad </li></ul><ul><li>Permite visualizar la malla del ADN. </li></ul><ul><li>Desventajas: Requiere una mayor cantidad de muestra. </li></ul>
  30. 30. <ul><li>1. Lisis Celular </li></ul><ul><li>2. Extracción </li></ul><ul><li>3. Precipitación </li></ul><ul><li>4. Resuspensión </li></ul>SALTING OUT
  31. 31. LISIS CELULAR <ul><li>Buffer de lisis I: ( lisis glóbulos rojos ). </li></ul><ul><li>- Sucrosa </li></ul><ul><li>- MgCl2 1M </li></ul><ul><li>- Triton x 100 </li></ul><ul><li>Buffer de lisis II: ( lisis glóbulos blancos) </li></ul><ul><li>EDTA de Na </li></ul><ul><li>NaCL. </li></ul>
  32. 32. EXTRACCION <ul><li>Lauril sulfato de sodio al 10%: despolariza las proteinas </li></ul><ul><li>Perclorato de sodio 5M </li></ul><ul><li>NaCl 6M </li></ul>
  33. 33. PRECIPITACION <ul><li>Isopropanol </li></ul><ul><li>Etanol al 70% lava el exceso de sales. </li></ul>
  34. 34. RESUSPENSION <ul><li>Se realiza en Buffer T. E. ( Tris EDTA) o también se puede realizar en agua. </li></ul>
  35. 35. EXTRACCION SALTING OUT
  36. 36. CONCLUSIONES <ul><li>El ADN es el material genético a través del cual se transmite la información contenida en los genes de generación en generación. </li></ul><ul><li>El ADN esta presente en los indicios biológicos como sangre, semen saliva, tejido, hueso, pelo etc. </li></ul><ul><li>Es muy importante conocer las condiciones para la remision adecuada de las muestras. </li></ul><ul><li>El Salting-out es uno de los métodos de extracción de ADN mas utilizados por su fácil implementacion, baja toxicidad de los reactivos y permite la visualizacion del ADN. </li></ul>
  37. 37. BIBLIOGRAFIA <ul><li>MARTINEZ JARRETA, M Begoña. La prueba del ADN en medicina forense. Masson: Buenos Aires.1999. </li></ul><ul><li>Grupo Español y portugués de la ISFG. Recomendaciones para la recogida y envío de la muestras con fines de identificación genética. Madeira, 2 de Junio 2000. </li></ul><ul><li>MILLER S, DYKES D, POLESKY H, A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells, Nucl. Ac. Res. 16: 1215. 1988. </li></ul>
  38. 38. GRACIAS

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