El documento describe las técnicas de diagnóstico molecular utilizadas en la clínica. Explica que el diagnóstico molecular incluye técnicas de biología molecular para detectar o cuantificar secuencias genéticas específicas. Se enfoca principalmente en enfermedades infecciosas, cáncer y enfermedades genéticas, y se usa para cribado, diagnóstico, terapia y monitoreo. Algunas técnicas comunes son PCR, microarreglos, secuenciación y ensayos inmunoenzim

1. Diagnostico molecular
de patógenos
Biología molecular en la clínica

2. ¿Cuál es la importancia de un
diaganostico rápido y
oportuno?

3. Diagnostic
o
molecular
Es un término amplio que incluye
técnicas de biología molecular en
beneficio de la salud humana,
detectando y/o cuantificando
secuencias genéticas específicas de
ácido desoxirribonucleico (ADN),
ácido ribonucleico (ARN) o
proteínas

4. ¿Para que sirve el diagnostico
molecular?

6. Biología
molecular en
el diagnóstico
Enfocada principalmente en:
Enfermedades infecciosas (50-60%)
Cáncer
Enfermedades genéticas
Usada en:
Cribado
Diagnóstico
Terapia
Monitoreo

7. Algunas técnicas
utilizadas en el
diagnostico molecular

8. Algunas Técnicas
PCR
Microarreglos
Secuenciación
Ensayos inmunoenzimaticos

9. PCR
• La técnica de amplificación de ADN mediante la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) es una técnica que consiste en la amplificación in
vitro de un fragmento de ADN específico.
• Es necesario conocer la secuencia del fragmento a amplificar (un gen,
una parte de un gen, una región no codificadora,...).
• Básicamente, se trata de replicar una y otra vez un mismo fragmento
de ADN y, para ello, debemos realizar in vitro lo que hacen las
células in vivo para replicar su ADN

10. PCR

11. PCR

12. Tipo de RPC Características Aplicaciones
RPC Estándar
Amplificación de un
segmento de ADN
utilizando dos partidores.
La detección de la
amplificación es
mediante geles de
agarosa.
Detección cualitativa de
un segmento de ADN.
RPC Múltiple
Amplificación de 2 o más
segmentos de ADN
utilizando varios
partidores en un sola
reacción de
amplificación. La
detección de la
amplificación es
mediante geles de
agarosa.
Detección cualitativa de
varios segmentos de
ADN en una sola
reacción de RPC

13. Tipo de RPC Características Aplicaciones
RPC-RFLP
(Restriction fragment
length polymorphisms)
RPC estándar con paso
posterior de digestión con
enzimas de restricción.
Detección de
polimorfismos genéticos
(SNPs).
RT (Reverse
transcriptase)-RPC
Síntesis de cADN a partir
de ARN mediante
transcripción reversa,
seguido de una RPC.
Expresión de genes.
Detección de virus ARN.
RPC-TR (Real time) o
qRPC
RPC estándar donde se
utilizan tinciones o
sondas con fluoróforos
para la detección de los
fragmentos amplificados.
Puede ser del tipo
multiplex.
Detección cualitativa de
uno o varios segmentos
de ADN.
Cuantificación de ADN en
la muestra (cargas) o
expresión de genes
(asociada a una reacción
de transcripción reversa).

14. Pcr rflp

15. Pcr frlp

16. Pcr en tiempo real

17. Preguntas

18. Microarreglos
• Un microarreglo de ADN (también denominado DNA chip
,oligonucleotide DNA chip O gene chip) consiste en
múltiples fragmentos de ADN complementario (cada uno
de los cuales representa un gen diferente) adheridos a un
soporte físico concreto (vidrio, plástico, silicona, etc.) y
agrupados de manera su función (receptores, hormonas,
factores de transcripción, citocinas, etc.).

20. Preguntas

21. Microarreglos
Es una impresión ordenada
del material biológico en
una superficie solida cuya
aplicación radica en la
evaluación simultanea de
cientos de genes

22. Secuenciación
• La secuenciación de ADN es el proceso que
determina la secuencia de bases de los
nucleótidos (As, Ts, Cs y Gs) de un fragmento de
ADN. Hoy en día, con el equipo y los materiales
adecuados, secuenciar un fragmento pequeño de
ADN es relativamente sencillo

26. Secuenciación

27. MÚLTIPLEX
• Los sistemas múltiplex
permiten la detección
simultánea de 100 analitos a
partir de una muestra
biológica y se han extendido
a la determinación del perfil
de proteínas, diagnóstico
molecular en procesos
infecciosos, expresión génica
y determinación de HLA,
entre otras características

28. ELISA
• Enzyme Linked
Immunosorbent Assay
• Se basa en la detección
de Ag por medio de Ac
unidos a un cromógeno
para revelar la reacción
• Tipos
• Indirecto
• Sandwich
• Competitiva

29. ELISA indirecto
• Puede detectarse anticuerpo o determinarse de
modo cuantitativo
• Suero o alguna otra muestra que contenga el
anticuerpo primario se añade a un pozo
recubierto con antígeno

30. ELISA sandwich
• El anticuerpo (en lugar del antígeno) se
inmoviliza en un pozo
• Se añade una muestra que contiene antígeno

31. ELISA competitivo
• Útil para medir cantidades de antígeno
• Se incuba primero anticuerpo en solución con una
muestra que contiene antígeno
• Después la mezcla de antígeno y anticuerpo se
añade a un pozo recubierto con antígeno
• Cuanto más antígeno se encuentra en la muestra,
tanto menos anticuerpo libre está disponible para
unirse al pozo recubierto con antígeno

32. ELISA competitiva

34. Curva de estándares

35. ELISA

36. Resultados ELISA

37. Preguntas

38. ¿Cuándo utilizar el diagnostico molecular?
• En la actualidad una disyuntiva del médico consiste en determinar
el momento de indicar un estudio molecular para llevar a cabo un
diagnóstico más certero; con posterioridad, se pregunta qué tipo
de estudio es el indicado, qué muestra biológica del paciente debe
analizarse y cómo debe tomarla y manejarla.
• Algunos estudios de los que pueden echar mano: determinación
de polimorfismos; análisis basados en sistemas del tipo múltiplex;
microarreglos y genotipificación

39. Muestras para biología molecular
Determinar el
ácido nucleico de
interés
Tipo de prueba a
realizar
Toma de muestra
Almacenamiento Procesamiento

41. Tipo de prueba
• Ácido nucleico endógeno
• Pruebas genómicas: Cualquier célula nucleada
• Expresión génica: ARNm es necesario tomar en cuenta la
regulación espacial y temporal. CONONCER EL CURSO DE LA
ENFERMEDAD
• Ácido nucleico exógeno
• Útil para diagnostico
• No es una alternativa económica
• CONONCER EL CURSO DE LA ENFERMEDAD

42. Aspectos a cuidar en la toma de muestra
• Ayuno recomendable
• Material estéril y libre de nucleasas
• Utilizar equipo de protección
• Limpieza del área de trabajo
• Antes de realizar la toma determinar donde se va
almacenar

43. Tipo de muestra:
¿Tubos con EDTA, secos?
Extracción de
DNA
Extracción de
RNA
RT-PCR (mRNA)
PCR (gDNA)
PCR-RFLP
Biopsias

44. OBTENCIÓN, CONSERVACIÓN Y
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
BIOLÓGICA
•¿Qué se necesita?

45. OBTENCIÓN, CONSERVACIÓN Y
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
BIOLÓGICA
• Material adecuado (estéril)
• Cuidar el tiempo
• Almacenamiento (-80°C)
• Evitar ciclos de congelación

46. almacenamiento
• Antes de la extracción
• ADN a 4ºC hasta por 5 días
• RNA procesar de inmediato
• Después de la extracción
• ADN -20ºC por semanas
• ADN -70ºC por años
• ARN -70º C

48. Se puede obtener material genético de:
• Sangre, esputos, lesiones
cutáneas
• Lavados nasales y oculares
• Heces, orina, líquido
cefalorraquídeo
• Biopsias

50. Tipo de material utilizado para
estudios moleculares:
• Campanas de bioseguridad
especiales/UV para:
• Extracción de ácidos
nucleicos
• PCR

51. Importante...
• Delimitar áreas de trabajo exclusivas para:
• Extracción de DNA/RNA
• PCR
• Desinfectar el área
• Alcohol 70%
• Campanas: luz uv
• Utilizar inhibidores de RNasas: DEPC
• En la extracción de RNA

52. Extracción de DNA y RNA:
• Métodos clásicos:
• Lisis de la célula con lisozima, álcali o detergentes
• La eliminación de proteínas y otros contaminantes se
efectúa o extracción con fenol y cloroformo
• En caso de extracción de DNA, el RNA se elimina usando
ribonucleasa pancreática
• La proteinasa K libera el DNA desde la cromatina y destruye
nucleasas

53. Diferencias entre el diagnóstico
tradicional y el diagnóstico molecular

54. Diferencias entre el diagnóstico tradicional y el diagnóstico
molecular
TRADICIONAL
• Examinación directa
• Cultivo
• Estudio histopatológico
¿Ventajas y
desventajas?

55. Diferencias entre el diagnóstico tradicional y el diagnóstico
molecular
MOLECULAR
• Ensayos inmunoenzimáticos y westen blot
• PROBE TESTS:
• Hybridization Protection Assays
• Hybrid capture technique
• Peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization
• Affirm VPIII microbial identification test
• QUANTITATIVE TECHNIQUES:
• PCR tiempo real
• Mass Spectrometry and Spectroscopy for the Identification of Pathogens
• Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF)
• Laser-induced breakdown spectroscopy
• Raman spectroscopy
• Multiplexed Automated Digital Microscopy (Time Lapse Imaging): Accelerate Pheno System

56. Ejemplo: Tuberculosis
• Objetivo del diagnostico:
• Aislamiento
• Identificación
• Sensibilidad a fármacos
TRADICIONAL
• Aislamiento y observación al
microscopio a partir de esputo
• Cultivo
• Pruebas bioquímicas
MOLECULAR
◼ Técnicas de hibridación de ácidos nucleicos
◼ Direct Nucleic Acid Amplification Test
◼ Secuenciación
◼ PCR-RFLP

57. Médicos Sin Limites