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Diagnostico molecular
de patógenos
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¿Cuál es la importancia de un
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Diagnostico molecular de patogenos.pptx

  • 2. ¿Cuál es la importancia de un diaganostico rápido y oportuno?
  • 3. Diagnostic o molecular Es un término amplio que incluye técnicas de biología molecular en beneficio de la salud humana, detectando y/o cuantificando secuencias genéticas específicas de ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN) o proteínas
  • 4. ¿Para que sirve el diagnostico molecular?
  • 6. Biología molecular en el diagnóstico Enfocada principalmente en: Enfermedades infecciosas (50-60%) Cáncer Enfermedades genéticas Usada en: Cribado Diagnóstico Terapia Monitoreo
  • 7. Algunas técnicas utilizadas en el diagnostico molecular
  • 9. PCR • La técnica de amplificación de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que consiste en la amplificación in vitro de un fragmento de ADN específico. • Es necesario conocer la secuencia del fragmento a amplificar (un gen, una parte de un gen, una región no codificadora,...). • Básicamente, se trata de replicar una y otra vez un mismo fragmento de ADN y, para ello, debemos realizar in vitro lo que hacen las células in vivo para replicar su ADN
  • 10. PCR
  • 11. PCR
  • 12. Tipo de RPC Características Aplicaciones RPC Estándar Amplificación de un segmento de ADN utilizando dos partidores. La detección de la amplificación es mediante geles de agarosa. Detección cualitativa de un segmento de ADN. RPC Múltiple Amplificación de 2 o más segmentos de ADN utilizando varios partidores en un sola reacción de amplificación. La detección de la amplificación es mediante geles de agarosa. Detección cualitativa de varios segmentos de ADN en una sola reacción de RPC
  • 13. Tipo de RPC Características Aplicaciones RPC-RFLP (Restriction fragment length polymorphisms) RPC estándar con paso posterior de digestión con enzimas de restricción. Detección de polimorfismos genéticos (SNPs). RT (Reverse transcriptase)-RPC Síntesis de cADN a partir de ARN mediante transcripción reversa, seguido de una RPC. Expresión de genes. Detección de virus ARN. RPC-TR (Real time) o qRPC RPC estándar donde se utilizan tinciones o sondas con fluoróforos para la detección de los fragmentos amplificados. Puede ser del tipo multiplex. Detección cualitativa de uno o varios segmentos de ADN. Cuantificación de ADN en la muestra (cargas) o expresión de genes (asociada a una reacción de transcripción reversa).
  • 18. Microarreglos • Un microarreglo de ADN (también denominado DNA chip ,oligonucleotide DNA chip O gene chip) consiste en múltiples fragmentos de ADN complementario (cada uno de los cuales representa un gen diferente) adheridos a un soporte físico concreto (vidrio, plástico, silicona, etc.) y agrupados de manera su función (receptores, hormonas, factores de transcripción, citocinas, etc.).
  • 21. Microarreglos Es una impresión ordenada del material biológico en una superficie solida cuya aplicación radica en la evaluación simultanea de cientos de genes
  • 22. Secuenciación • La secuenciación de ADN es el proceso que determina la secuencia de bases de los nucleótidos (As, Ts, Cs y Gs) de un fragmento de ADN. Hoy en día, con el equipo y los materiales adecuados, secuenciar un fragmento pequeño de ADN es relativamente sencillo
  • 27. MÚLTIPLEX • Los sistemas múltiplex permiten la detección simultánea de 100 analitos a partir de una muestra biológica y se han extendido a la determinación del perfil de proteínas, diagnóstico molecular en procesos infecciosos, expresión génica y determinación de HLA, entre otras características
  • 28. ELISA • Enzyme Linked Immunosorbent Assay • Se basa en la detección de Ag por medio de Ac unidos a un cromógeno para revelar la reacción • Tipos • Indirecto • Sandwich • Competitiva
  • 29. ELISA indirecto • Puede detectarse anticuerpo o determinarse de modo cuantitativo • Suero o alguna otra muestra que contenga el anticuerpo primario se añade a un pozo recubierto con antígeno
  • 30. ELISA sandwich • El anticuerpo (en lugar del antígeno) se inmoviliza en un pozo • Se añade una muestra que contiene antígeno
  • 31. ELISA competitivo • Útil para medir cantidades de antígeno • Se incuba primero anticuerpo en solución con una muestra que contiene antígeno • Después la mezcla de antígeno y anticuerpo se añade a un pozo recubierto con antígeno • Cuanto más antígeno se encuentra en la muestra, tanto menos anticuerpo libre está disponible para unirse al pozo recubierto con antígeno
  • 35. ELISA
  • 38. ¿Cuándo utilizar el diagnostico molecular? • En la actualidad una disyuntiva del médico consiste en determinar el momento de indicar un estudio molecular para llevar a cabo un diagnóstico más certero; con posterioridad, se pregunta qué tipo de estudio es el indicado, qué muestra biológica del paciente debe analizarse y cómo debe tomarla y manejarla. • Algunos estudios de los que pueden echar mano: determinación de polimorfismos; análisis basados en sistemas del tipo múltiplex; microarreglos y genotipificación
  • 39. Muestras para biología molecular Determinar el ácido nucleico de interés Tipo de prueba a realizar Toma de muestra Almacenamiento Procesamiento
  • 41. Tipo de prueba • Ácido nucleico endógeno • Pruebas genómicas: Cualquier célula nucleada • Expresión génica: ARNm es necesario tomar en cuenta la regulación espacial y temporal. CONONCER EL CURSO DE LA ENFERMEDAD • Ácido nucleico exógeno • Útil para diagnostico • No es una alternativa económica • CONONCER EL CURSO DE LA ENFERMEDAD
  • 42. Aspectos a cuidar en la toma de muestra • Ayuno recomendable • Material estéril y libre de nucleasas • Utilizar equipo de protección • Limpieza del área de trabajo • Antes de realizar la toma determinar donde se va almacenar
  • 43. Tipo de muestra: ¿Tubos con EDTA, secos? Extracción de DNA Extracción de RNA RT-PCR (mRNA) PCR (gDNA) PCR-RFLP Biopsias
  • 44. OBTENCIÓN, CONSERVACIÓN Y PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA BIOLÓGICA •¿Qué se necesita?
  • 45. OBTENCIÓN, CONSERVACIÓN Y PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA BIOLÓGICA • Material adecuado (estéril) • Cuidar el tiempo • Almacenamiento (-80°C) • Evitar ciclos de congelación
  • 46. almacenamiento • Antes de la extracción • ADN a 4ºC hasta por 5 días • RNA procesar de inmediato • Después de la extracción • ADN -20ºC por semanas • ADN -70ºC por años • ARN -70º C
  • 48. Se puede obtener material genético de: • Sangre, esputos, lesiones cutáneas • Lavados nasales y oculares • Heces, orina, líquido cefalorraquídeo • Biopsias
  • 50. Tipo de material utilizado para estudios moleculares: • Campanas de bioseguridad especiales/UV para: • Extracción de ácidos nucleicos • PCR
  • 51. Importante... • Delimitar áreas de trabajo exclusivas para: • Extracción de DNA/RNA • PCR • Desinfectar el área • Alcohol 70% • Campanas: luz uv • Utilizar inhibidores de RNasas: DEPC • En la extracción de RNA
  • 52. Extracción de DNA y RNA: • Métodos clásicos: • Lisis de la célula con lisozima, álcali o detergentes • La eliminación de proteínas y otros contaminantes se efectúa o extracción con fenol y cloroformo • En caso de extracción de DNA, el RNA se elimina usando ribonucleasa pancreática • La proteinasa K libera el DNA desde la cromatina y destruye nucleasas
  • 53. Diferencias entre el diagnóstico tradicional y el diagnóstico molecular
  • 54. Diferencias entre el diagnóstico tradicional y el diagnóstico molecular TRADICIONAL • Examinación directa • Cultivo • Estudio histopatológico ¿Ventajas y desventajas?
  • 55. Diferencias entre el diagnóstico tradicional y el diagnóstico molecular MOLECULAR • Ensayos inmunoenzimáticos y westen blot • PROBE TESTS: • Hybridization Protection Assays • Hybrid capture technique • Peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization • Affirm VPIII microbial identification test • QUANTITATIVE TECHNIQUES: • PCR tiempo real • Mass Spectrometry and Spectroscopy for the Identification of Pathogens • Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) • Laser-induced breakdown spectroscopy • Raman spectroscopy • Multiplexed Automated Digital Microscopy (Time Lapse Imaging): Accelerate Pheno System
  • 56. Ejemplo: Tuberculosis • Objetivo del diagnostico: • Aislamiento • Identificación • Sensibilidad a fármacos TRADICIONAL • Aislamiento y observación al microscopio a partir de esputo • Cultivo • Pruebas bioquímicas MOLECULAR ◼ Técnicas de hibridación de ácidos nucleicos ◼ Direct Nucleic Acid Amplification Test ◼ Secuenciación ◼ PCR-RFLP