Mecanismo molecular de Replicación. Rapid learning; http://www.facebook.com/OralBiology http://munevarjuan.blogspot.com/

1. BIOLOGIA ORAL
• JUAN CARLOS MUNEVAR.
• Odontólogo
• PROFESOR ASOCIADO
• Unidad de Investigación Básica Oral. U.I.B.O
• UNIVERSIDAD EL BOSQUE.
• Postgrado en Biología Oral. MSc
• Maestría en Ciencias Básicas Biomédicas
• D.E.A Biología Ósea.
• Especialista en Bioética
• Especialista en Docencia Universitaria.

2. REPLICACION DEL ADN
1. Modelos de Replicación del ADN: Experimento de Meselson-Stahl
2. Síntesis y elongación del ADN
3. ADN polimerasas
4. Origen e iniciación de la replicación del ADN
5. Replicación del Telómero
© Dr. Juan Carlos Munévar Niño

3. Modelos de replicación del ADN
© Dr. Juan Carlos Munévar Niño

4. 1958: Experimento de Matthew Meselson & Frank Stahl
Centrifugación en gradientes de densidad
© Dr. Juan Carlos Munévar Niño

5. 1958: Experimento de Matthew Meselson & Frank Stahl
Modelo Semiconservativo de replicación del ADN
© Dr. Juan Carlos Munévar Niño

6. 1955: Arthur Kornberg
Trabajo con E. coli.
Descubrió los mecanismos de Síntesis de ADN.
Se requieren 4 componentes:
1. dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dCTP
(deoxiribonucleósidos 5’-trifosfatos)
(azúcar-base + 3 fosfatos)
2. Cebador de ADN
3. ADN polimerasa (enzima de Kornberg)
4. Mg 2+ (optimiza la actividad de la ADN polimerasa)
1959: Arthur Kornberg (Stanford University) & Severo Ochoa (NYU)
© Dr. Juan Carlos Munévar Niño

7. 3 aspectos principales en la reacción de síntesis de ADN:
1. La ADN polimerasa I cataliza la formación de enlaces fosfodiester entre
3’-OH de la desoxirribosa (sobre el último nucleótido) y el carbono 5’
del dNTP.
• La energía para esta reacción proviene de la liberación de 2 de 3
fosfatos del dNTP.
2. La ADN polimerasa “localiza” el dNTP complementario correcto en cada
etapa durante el proceso de elongación.
• Tasa ≤ 800 dNTPs/segundo
• Baja tasa de error!
3. La dirección de síntesis es 5’ hacia 3’
ADN polimerasa
© Dr. Juan Carlos Munévar Niño Protein Data Bank

8. Elongación del ADN
© Dr. Juan Carlos Munévar Niño

9. Elongación del ADN
© Dr. Juan Carlos Munévar Niño

10. Tipos diferentes de ADN polimerasa
Polimerasa Polimerización (5’-3’) Exonucleasa (3’-5’) Exonucleasa (5’-3’) No Copias
I Si Si Si 400
II Si Si No ?
III Si Si No 10-20
•Actividad exonucleasa 3’ - 5’= Capacidad de remover nucleótidos desde el
extremo 3’ de la cadena
•Importante capacidad de corrección de errores
•Tasa de mutaciones sin la capacidad de corrección es 1 x 10-6
•Con capacidad de corrección la tasa es 1 x 10-9 (1000-veces menos)
•La actividad exonucleasa funciona en la replicación y reparación del ADN.
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11. Enzimas eucariotas:
5 ADN polimerasas en mamíferos.
1. Polimerasa  (alfa): nuclear, replicación de ADN.
2. Polimerasa  (beta): nuclear, reparación de ADN.
3. Polimerasa  (gamma): mitocondria, síntesis de ADN, corrección de errores
4. Polimerasa  (delta): nuclear, replicación de ADN, corrección de errores
5. Polimerasa  (épsilon): nuclear, reparación de ADN (?), corrección de errores
• Polimerasas diferentes para el núcleo y el ADNmt
• Algunas polimerasas corrigen errores; otras no.
• Algunas polimerasas se emplean durante la replicación; otras para
reparación.
• Las polimerasas varían entre las especies.
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12. Origen de replicación (ej, procariotas):
 Empieza con la desnaturalización de la doble hélice en cadenas
sencillas dejando expuestas las bases.
 Se constituye una burbuja de replicación desde la cual se desencadena
la síntesis de ADN en ambas direcciones.
~245 pb en E. coli
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13. Inicio de la replicación, principales elementos:
 Los segmentos de ADN de cadena sencilla se denominan cadenas patrón
“template strand”
 La Girasa (un tipo de topoisomerasa) relaja el ADN superenrollado
 Las proteínas Iniciadoras y la helicasa se unen al ADN en la horquilla de
replicación, y el desenrollamiento de ADN utilizan energía derivada del
ATP (trifosfato de adenosina).
(La Hidrolisis de ATP causa un cambio de configuración de la ADN helicasa)
 La ADN primasa se une a la helicasa formando el primosoma (la primasa
es necesaria para la síntesis),
 La Primasa sintetiza un corto primer de ARN de 10-12 nucleótidos, al cual
la ADN polimerasa III incorpora nucleótidos.
 La Polimerasa III incorpora nucleótidos 5’ - 3’ en ambas cadenas
comenzando en el cebador o primer de ARN.
 El cebador o primer de ARN es removido y reemplazado con ADN por la
polimerasa I, y el espacio es sellado por la ADN ligasa.
 Las proteínas “Single-stranded DNA-binding” (SSB) estabilizan el molde
de cadena sencilla de ADN durante el proceso.

14. Modelo de replicación in E. coli
© Dr. Juan Carlos Munévar Niño

15. La replicación del ADN es continua en la cadena patrón “leading strand” y
semidiscontinua sobre la cadena retardada “lagging strand”:
El relajamiento y desenrollamiento de una sola cadena de ADN en la burbuja
de replicación procede en una sola dirección
Las 2 cadenas de ADN son de polaridad opuesta, y la ADN polimerasa solo
sintetiza ADN en dirección 5’ a 3’.
Solución: El ADN ES SINTETIZADO EN DIRECCIONES OPUESTAS SOBRE CADA
MOLDE
•Cadena patrón síntesis 5’ hacia 3’ en la dirección del movimiento
de la burbuja de replicación.
síntesis continua
requiere un solo primer de ARN
•Cadena Retardada sintesís 5’ hacia 3’ en la dirección opuesta.
semidiscontinua (no continua)
requiere varios primers de ARN; EL ADN es
sintetizado en fragmentos cortos.
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16. El ADN superenrollado es relajado por la girasa y desenrollado por
Helicasa y proteínas:
5’ Proteínas SSB
Fragmentos de Okazaki
1 ATP
Polimerasa III 2
Helicasa
Cadena retardada 3 +
Proteínas Iniciadoras
3’
primasa PARES DE BASES
Polimerasa III 5’
El primer de ARN es reemplazado por
la ADN Pol I y los espacios son
sellados por ligasas
Cadena molde
Primer ARN
3’
© Dr. Juan Carlos Munévar Niño

17. Modelo de replicación del ADN
Peter J. Russell, Genetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.

18. La ADN ligasa sella los espacios entre los fragmentos de
Okazaki con un enlace fosfodiéster
© Dr. Juan Carlos Munévar Niño

19. Modelo de replicación del ADN
Peter J. Russell, Genetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.

20. Modelo de replicación del ADN
Peter J. Russell, Genetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.

21. Replicación del ADN en eucariotas:
Copiar cada cromosoma eucariotico durante la fase S del ciclo celular
presenta algunos desafíos:
Puntos de control “checkpoints” en el
sistema
1. Las células deben estar preparadas
y el medio ambiente debe ser
favorable.
2. La Célula no entra a MITOSIS hasta
que todo el ADN este replicado.
3. Los cromosomas también deben
estar unidos al huso mitótico para
que se efectúe la mitosis.
4. Los Checkpoints en el sistema
incluyen proteínas llamadas ciclinas
y enzimas denominadas cinasas
dependientes de ciclinas “cyclin-
dependent kinases” (Cdks).
© Dr. Juan Carlos Munévar Niño

22. • Cada cromosoma eucariótico es una doble hélice de ADN lineal
• En Promedio ~108 pares de bases de longitud
• Con una tasa de replicación de 2 kb/minuto, la replicación de 1
cromosoma humano requiere ~35 días.
• Solución ---> la replicación del ADN comienza en varios sitios diferentes
de manera simultanea.
Las tasas son especificas
de las células!

23. Horquillas de Replicacion visibles en Drosophila
© Dr. Juan Carlos Munévar Niño

24. Que sucede con los extremos (o telómeros) en los cromosomas lineales?
La ADN polimerasa/ligasa no rellena el espacio en el extremo del
cromosoma después de la remoción del cebador de ARN. De ese modo los
cromosomas se reducen al final de cada replicación!
Solución:
1. Las eucariotas poseen secuencias repetidas en tándem en los
extremos de sus cromosomas.
2. La Telomerasa (compuesta de proteína y ARN complementario a la
repetición del telomero) se acopla a la repetición terminal del
telómero y cataliza la incorporación de nuevas repeticiones.
3. Compensación mediante alargamiento del cromosoma.
4. La ausencia o mutación de la actividad telomerasa resulta en el
acortamiento del cromosoma y división celular limitada.
© Dr. Juan Carlos Munévar Niño

25. Síntesis de ADN telomérico por la ARN telomerasa
Peter J. Russell, Genetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.

26. Etapa Final – Ensamble en Nucleosomas:
• A medida que el ADN se desenrolla los nucleosomas deben
desensamblarse.
• Las Histonas y las proteínas asociadas a la cromatina deben duplicarse
mediante nueva síntesis de proteínas.
• El ADN recién replicado se ensambla en nucleosomas casi de inmediato.
• Las proteínas chaperonas de las histonas controlan el ensamble.
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27. ADN POLIMERASAS
• Topoisomerasas: pueden producir o eliminar nudos o
enlaces en una hélice.
• Helicasas: son enzimas que rompen los puentes de
hidrógeno que mantienen unidas las dos cadenas de la doble
hélice.
• La ADN Pol III es la enzima que realiza la mayoría de la
replicación del DNA. Complejo enzimático que lleva a cabo la
replicación es un multímero denominado Holoenzima de
DNA Pol III que posee muchas cadenas o subunidades
polipeptídicas
• A la ADN Pol II se la asigna exclusivamente una función
reparadora, pero muchas de sus características y el papel que
juega en la replicación del DNA, si es que juega alguno, son
desconocidas.
• La ADN Pol I tiene un papel reparador, retira los cebadores
con su actividad exonucleasa 5'- 3' y rellena el espacio con su
actividad polimerasa 5'- 3'.

28. © Dr. Juan Carlos Munévar Niño

29. http://www.seinan-gu.ac.jp/~djohnson/DNARepl.htmel
http://oak.cats.ohiou.edu/~ballardh/pbio475/Heredity/DNA-replication.JPG

31. Gracias!
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JUAN CARLOS MUNEVAR N