Red Operativa de Preparación de Muestras Especializadas por Aplicación para Núcleo de Secuenciación NGS

Dr. Eduardo Terranova DMTV
Asesor en Transferencia Tecnológica
28/01/2017 1www.eduardo-terranova.com

Breves conceptos sobre la GTT
El mundo productivo tiene características de
complejidad sin precedentes.
Nunca como en la actualidad, se han combinado de
manera tan profunda, universos que en otros tiempos
eran independientes e inconexos.

Tecnologías correspondientes
Tecnologías de análisis elemental: espectrofotometría de
absorción atómica (AA), espectrofotometría de plasma
acoplado (ICP), cromatografía liquida de alta
eficiencia (HPLC), cromatografía iónica (IC),
espectrometría de masas (LC-MSMS; qTOF) y
Cromatografía Preparativa.
Análisis genético automático (secuenciación, genotipado
STR y SNP) y PCR cuantitativa en tiempo real (OGMs)
Secuenciación Masiva de Nueva Generación (NGS),
como gran capítulo de desarrollo tecnológico mas
reciente.

Al enunciar tecnologías, estamos mencionado de hecho,
diferentes laboratorios especializados expertos en cada
una de ellas.
En efecto así ocurre. Existen diversos laboratorios
diseminados por el territorio que realizan análisis
concretos y especificos.
Resulta obvio que no encontraremos éstos
equipamientos en un establecimiento ganadero o
planta industrial u hospital.
En esta comunicación nos referiremos solamente a las
tecnologías moleculares como epicentro.

¿Como definimos transferencia de
tecnología?
“La transferencia de tecnología es el proceso en el que
se transfieren habilidades, conocimiento, tecnologías,
métodos de fabricación e instalaciones entre los
gobiernos o las universidades y otras instituciones.
Su objetivo es asegurar que los avances científicos y
tecnológicos sean accesibles a un mayor número de
usuarios que puedan desarrollar y explotar aún más
esas tecnologías en nuevos productos, procesos,
aplicaciones, materiales o servicios.1”

¿Cómo definimos el concepto de
gestión?
“Del latín gestĭo, el concepto de gestión hace referencia
a la acción y a la consecuencia de administrar algo.
Al respecto, hay que decir que gestionar es llevar a
cabo diligencias que hacen posible la realización de
una acción específica.”

Nuestra concepción de GTT
comprende
Detectar
necesidad en
campo
identificar
productores
de
conocimiento
y solución
convocar a los
generadores
de la solución
Tomar la
solución
aplicar la
solución a
nivel de
campo

En éste círculo virtuoso, es necesario tener una
visión global y holística del contexto.
Determinar las necesidades a conformar
observando las demandas y características
externas (mercados, gobiernos, agencias).

Resultados de la GTT
Producto mejorado a adaptable
a condicionantes del mercado
capacidad de
aplicación de
solución al
campo
vínculo
biunívoco con
academia
Conocimiento
de campo y
objetivación de
necesidades
tecnológicas

Áreas de experiencia en aplicación
de GTT.
 Sanidad y producción animal
 Sanidad y producción vegetal
 Microbiología agraria e industrial
 Selección asistida por marcadores genéticos (animal y vegetal)
 Caracterización de componentes y diseño de fórmulas alimentarias infantiles en
lácteos.
 Ambientalismo: detección de contaminación química y biológica de suelos y
aguas: Pesticidas y biota oportunista (algas cianofitas y producción de Micro
cistinas)
 Seguridad alimentaria (E. coli O157 H7, STECS, …)
 Residuosen alimentos (carnes: pesticidas, disruptores endocrinológicos,
hormonas, antibióticos)
 Farmacocinética: Biodisponibilidady bioequivalencia en específicos
veterinarios.
 Control de drogas de abuso: anabólicos, dopaje en animales de deporte y cabaña.
 Medicina Veterinaria: desarrollo y puesta a punto de técnicas de diagnóstico
molecular.

Estructura General de Planta
Laboratorio clínico especializado en
diagnósticos moleculares que ofrece
servicios de tercerización.
En estas instalaciones trabajan recursos
humanos altamente especializados y
comprometidos con nuestra política de
calidad
Planta de producción de diagnósticos
con certificación GMP e ISO13485.

Estructura de Negocio
I/D
Producción:
Proteínas
recombinantes
Kits Biología
Molecular Y
ELISA
Laboratorio de
Servivios
Aplicación Local
(Transferecnia de
Tecnologìa o
Exportación

Mercado actual y potencial
Distribución de las ventas
14%
Plaza : 86%
Exportaciones: 14 %
Distribuidores y contratos OEM con
empresas locales de diagnóstico.
Tenemos presencia en Paraguay, Bolivia,
Venezuela, Brasil, Chile, Perú y Colombia.

Para el área DIAGNÓSTICA se cuenta con un
Laboratorio Clínico de referencia en diagnóstico
molecular y recibe muestras de laboratorios
clínicos no especializados del país y la región.
Ofrece un amplio portafolio de servicios y mínimo
tiempo de respuesta con resultados publicados on-
line y accesibles a través de usuario y contraseña.
El laboratorio clínico tiene acreditación ISO 9001-
2008 y participa en los controles de calidad
externos del College of American Pathologists.
Brinda programas de transferencia tecnológica y
servicios de asesoramiento para el montaje de
áreas especializadas en diagnóstico molecular.

Area Diagnóstica
Se ofrece el soporte necesario para diseñar e implementar
una planta de elaboración de reactivos de diagnóstico en
total cumplimiento con las normativas internacionales
vigentes.
Nuestro servicio se divide en las siguientes etapas:
• Definición del alcance y los requerimientosdel usuario
• Diseño de la planta y selección del equipamiento
• Selección de proveedores de insumos para la producción
• Selección y entrenamiento de los recursos humanos
• Implementación del sistema de gestión de calidad
• Asesoramiento continuo post-transferencia

Diseño y Desarrollos a Medida
Nuestro servicio se divide en las siguientes etapas:
• Definición del alcance y los requerimientos del reactivo a
desarrollar
• Diseño del producto a desarrollo y estudio de factibilidad
• Desarrollo de los componentes críticos
• Selección de proveedores de insumos para la producción
• Desarrollo y optimización del reactivo
• Definición de sistema y parámetros de control de calidad
• Producción en escala piloto
• Validación interna y externa
• Obtención de Certificado de Libre de Venta
• Producción

Modo de trabajo
Con nuestros aliados estratégicos:
 Se trabaja particularmente en la adquisición de destrezas para el
manejo de diversas metodologías y técnicas como la producción,
cuantificación y análisis de moléculas biológicas, técnicas
avanzadas de biología molecular, biología celular, tecnología de
ADN recombinante, biología molecularvegetal, microbiología,
enzimologíay nanotecnología, entre otras.
 El laboratorio cuenta con un equipo de investigación que trabaja
en diversas áreas como la producción de proteínas por métodos
recombinantes o fermentativos, la inmovilización de enzimas
con fines productivos, nanotecnologíay microbiología aplicada.
Este grupo de investigadores cuenta con vínculos y proyectos
conjuntos con distintas empresas, universidades e institutos de
investigación, tanto a nivel nacional como internacional.

Antecedentes
 Desarrollo de métodos cromatográficos a medida para
el mejoramiento de bioprocesos: purificación de
toxoides para la preparación de vacunas veterinarias
 Nuevos enfoques para el desarrollo de biopesticidas
de uso agrícola
 Producción de Quimosina recombinante
 Caracterización de bancos clostridiales
 Estudio de la estabilidad de una vacuna producto del
sobrenadante de una fermentación
 Medida de la eficacia de conservantes
antimicrobianos

Nanobiosensor colorimétrico para la detección
de Campilobacter fetus
Diseño de procesos para la obtención
de biocombustibles a partir de microalgas
Hongos solubilizadores de fosfato como
herramienta alternativa al uso de agroquímicos
Screening de rizobacterias promotoras
de crecimiento en Eucalyptus
Producción de biodiesel mediante lipasas
inmovilizadas
Generación de electricidad a partir de suelos y
sedimentos uruguayos utilizando celdas de
combustible microbianas

Expertise especializado
• Producción de proteínas recombinantes en bacterias, levaduras o células
eucariotas superiores.
• Puesta a punto de procesos fermentativos a escala de laboratorio y piloto.
• Estabilización de proteínas.
• Mejoramiento de las propiedades de enzimas como catalizadores de
procesos industriales.
• Desarrollo de sistemas de detección de proteínas u otras biomoléculas
sobre soportes en escala nanométrica.
• Desarrollo de nuevas estrategias para la purificación, inmovilización y
estabilización de proteínas.
• Diseño y desarrollo de sistemas de detección molecular.
• Análisis de comunidades microbianas mediante técnicas de biología
molecular.
• Aislamiento de bacterias y hongos de interés biotecnológico.

Plataforma Instrumental
• PCR en tiempo final
• HPLC
• FPLC
• Liofilización
• Sala de cultivo de células eucariotas
• Sala de cultivo de bacterias
• Sala de cultivos de plantas y otros organismos fotosintéticos
• Producción de medios de cultivo
• Fermentación a escala de laboratorio y piloto

5
Natch CS--Megnetic beads+One tube

Extraction platform
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7
Natch CS--Standardization Layout of PCR Laboratory

8
Natch
Piping Volume :
10-1000μL

9
Natch CS--Self Elevating Magnetic Grate

10
Natch CS--Humanized Design
Air gapPortable Tips

Visual Operation window
No. 1 compact system ever in history to save your space!

- Molecular diagnostic
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Red Operativa de Preparación de
Muestras Especializadas por Aplicación
para Núcleo de Secuenciación NGS
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Ejemplos de Remitentes a Núcleo Analítico
Preparación
de Librerías
para
genómica
Preparación
de Librerías
para
Microbiología
(infectologia)
Centro de
Secuenciación
Masiva de
Aplicación
Genérica

Optimización de plataformas
 Creación de Centros de Secuenciación
Reciben las muestras preparadas por especialidad, respetando
las condiciones específicas de su proceso.
Generan los informes de secuencias que retornan a los
laboratorios remitentes.
 Creación laboratorios preparadores de muestras para
NGS ubicados in situ donde se requiere una aplicación concreta.
Equipado con los instrumentos y reactivos especialmente
destinados a la aplicación, que redundará en un chip que se remite
al núcleo de secuenciación, evitando multiplicación de costos.

Resultado de la Red Optimizada
 La Tecnología NGS, debido a su idiosincrasia requiere de
grandes cantidades de muestras para procesar una sola
corrida.
 El costo operativo por muestra resulta muy atractivo. Sin
embargo, requiere de grandes volúmenes para alimentar al
sistema.
 Las muestras son altamente específicas para cada
aplicación. Su método de preparación requiere reactivos y
consumibles específicos y en gran cantidad
 La creación de laboratorios preparadores de muestras in
situ, hace factible la inversión para cada uno de los
usuarios y la del Núcleo que solo invierte en la plataforma
instrumental central.

Aplicaciones en Genómica

PCR Y qPCR
 PCR: Técnicas e instrumentación para detección de Fragmentos
de DNA, cDNA genómico o general. Aplicado a micro organismos,
factores de expresión y detección de eventos genéticos de orden
cualitativo.
 qPCR: Técnicas para la detección de productos de amplificación
in vitro y su cuantificación en tiempo real durante la etapa
exponencial de amplificación. Aplicado a la detección de genes
de expresión y mecanismos de cinética de transcripción de DNA
Genómico, aplicado a procesos dinámicos y funcionales.
Existen numerosos kits comerciales de diagnóstico para un amplio
portafolios de patologías y estudios genéticos aplicados a diferentes
áreas. Esto incluye plataformas instrumentales, reactivos, consumibles
validados y kits de reactivos personalizados para estudios de expresión
génica, polimorfismos SNPs, Oncología, entre otros.

Secuenciación y Análisis Genético
Definimos y diferenciamos ambos términos como entidades
separadas.
- Secuenciación: Técnicas destinadas a determinar las
secuencias nucleotídicas de un fragmento o la totalidad de
un genoma y determinación de mutaciones puntuales
relacionadas a patologìas. (Métodos de Sanger,
Pirosecuenciación, o Secuenciación Masiva de Nueva
Generación –NGS_)
- Análisis de Fragmentos: Análisis de fragmentos de ADN
genómico que se comportan como unidad genética y
analítica a los efectos de su estudio automatizado.
Generalmente se transmiten en forma mendeliana y se
relacionan con caracteres genotípicos de interés.
(Microsatélites, AFLP)

Secuenciación Masiva de Nueva
Generación (NGS)
Se trata de la tecnología mas nueva e innovadora per se
Por estar en constante actualización y generando nuevos
campos de aplicación en la totalidad del espectro de la
genómica.
De la evolución competitiva de las grandes compañías
surgió el liderazgo internacional de ILLUMINA.
Liderazgo que se soporta en el constante y racional
proceso de creación de métodos aplicados y adecuados
a las condiciones reales de cada sector.

Secuenciación Sanger y
Pirosecuenciación
Siendo la primera, la tecnología líder en el mundo
desde fines de la década del noventa, tuvo su papel
protagónico en la secuenciación del Genoma Humano
en 2000 y predominó como Gold Standard de los
estudios de Genómica.

Áreas de Aplicación NGS
Tecnología ILLUMINA

Areas de Aplicación
 Ciencias Básicas
 Genómica aplicada:
o perinatología y Screening prenatal de
enfermedades cromosómicas
o Enfermedades Raras
 Transplantes de órganos y Tejidos: Genotipado HLA.
 Oncología y Genómica Médica
 Microbiología en todas sus áreas.
 Veterinaria: Patología Animal y Producción

 Agronomía :
 Producción vegetal
 Patología vegetal
 Aplicaciones Forenses
 Aplicaciones ambientales y agroindustrias

Concepto de Ciclo de Trabajo
 Muestras a procesar
 Muestras de diferente naturaleza: Muestras biológicas
sangre, suero, plasma, líquidos biológicos, biopsias
líquidas, tejidos y órganos, alimentos, materias primas,
muestras de suelos y vegetales.
 Métodos a correr:
 métodos analíticos específicos para cada tipo de muestra
 Soluciones a aportar
 Elección del método óptimo para análisis
 Medios y herramientas
 Selección óptima de la/s tecnología/s disponible/s

Tecnología para la Preparación de
Muestras para NGS
Tecnología de Análisis Automático de Fragmentos por
electroforesis Capilar:
Advanced Analytical,
Fragment Analyzer
¿Qué aporta la tecnología de análisis de fragmentos?

Fragment Analysis Mejora el Flujo de Trabajo
mediante las siguientes prestaciones:
1. Producción de Librerías para NGS
2. Análisis de fragmentos de DNA Genómico hasta
40,000 pb
3. Fragmentos de DNA de hasta 20,000 pb
4. Procesamiento de RNA total, RNA Mensajero, cDNA
y microRNA
5. Análisis de Genética Reversa (TILLiNG), Detección
de Mutaciones
6. SSR, Genotipado y Análisis de Fragmentos de PCR

Fragment Analyzer

Data Analysis Software

Tecnología actualizada

Medios y Herramientas
Identificación, de los tipos de instrumentación adecuada y su
integración óptima en base al objetivo general del núcleo
tecnológico.
Determinación de flujo de personal y materiales en planta.
 Fase Preparativa: métodos, equipos e insumos para
extracción / Purificación de Acidos Nucleicos.
PreAmplificación . Preparación de librerías específicas por
aplicación para NGS
 Fase de Procesamiento, Post Amplificación: Selección e
integración de Instrumentación y materiales,. Métodos y
técnicas.
 Fase de derivatización a estudios pormenorizados:
Secuenciación Sanger o PPS o NGS
 Interpretación de resultados y elaboración de informes

CICLO DE TRABAJO
Corte/ fijaciónj.Microsc. Proces. ImagenImag. Molec. RESULTADOSP-
INFORME
PCR-RTPCRSEQ./ NGS RESULTADO
Extracción, Separación, Análisis
Purific.

Curva de Aprendizaje
Nuestra propuesta contempla una transferencia total de
tecnología, que incluye Hardware, software, métodos y
bibliotecas puestos a punto, así como entrenamiento
especializado con seguimiento para asegurar que el
equipo técnico del laboratorio esté produciendo
resultados con parámetros de GLP en un período de 3
a 6 meses.

Dr. Eduardo Terranova
Gestión de Transferencia de Tecnología

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