1. Tecnologia del ADN recombinante Pablo Martín Seijo 2º LACC

2. ADN recombinante es una molécula que proviene de la unión artificial de dos fragmentos de ADN. La tecnología de ADN recombinante es el conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro diferente. De esta manera podemos hacer que un organismo (animal, vegetal, bacteria, hongo) o un virus produzca una proteína que le sea totalmente extraña. Estas técnicas se emplean normalmente para la producción de proteínas en gran escala, ya que podemos hacer que una bacteria produzca una proteína humana y lograr una superproducción, como en el caso de la insulina humana, que actualmente es producida por bacterias en grandes recipientes de cultivo, denominados biorreactores. Como las bacterias se multiplican muy rápidamente y pueden expresar grandes cantidades de proteínas, es posible lograr una sobreproducción de la proteína deseada. A esto justamente se dedica la biotecnología, es decir a la utilización de organismos vivos o de sus productos con fines prácticos. El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante fue posible gracias a varias líneas de investigación: el conocimiento de las enzimas de restricción, la replicación y reparación de ADN, la replicación de virus y plásmidos la síntesis química de secuencias de nucleótidos.

3. Como cortar y pegar el ADN? En 1975 Daniel Nathans y Hamilton O. Smith descubrieron un tipo de proteínas (las enzimas endonucleasas o enzimas de restricción) que actúan como “tijeras moleculares”, cortando la doble cadena de ADN a través del esqueleto de fosfatos sin dañar las bases. Las enzimas de restricción son producidas por bacterias como método de defensa contra virus y degradan el ADN extraño. A su vez, el propio genoma bacteriano está protegido contra sus enzimas de restricción mediante metilaciones en un átomo específico de ciertos nucleótidos. Las enzimas de restricción cortan dejando extremos cohesivos o romos. Las enzimas de restricción permiten cortar el genoma de cualquier organismo en pequeños fragmentos llamados fragmentos de restricción. La colección de miles o millones de estos fragmentos se llama biblioteca génica.

4. ¿Cómo introducir ADN recombinante en las bacterias? Creación de un plásmido e introducción en una bacteria Éste método se usaba al principio para producir múltiples copias de material genético. En la actualidad se utiliza para la producción de proteínas. Tras la transformación de las bacterias seleccionaremos a aquellas que han introducido el plásmido con la ayuda de antibióticos. Dado que los plásmidos contienen un gen de resistencia a antibiótico, al exponer las bacterias a ese antibiótico, sólo las que hayan incorporado el plásmido (y con él la resistencia) sobrevivirán. Un clon es un grupo de células u organismos genéticamente idénticas. El uso fragmentos de ADN como vectores cumple un rol fundamental en la ingeniería genética, ya que sirven para transferir material genético de un organismo a otro. Vector: cualquier organismo o virus capaz de mover genes de un organismo a otro

5. ¿Cómo amplificar el ADN? Reacción en cadena de la polimerasa A mediados de la década de los 80, KaryMullisinventó ésta técnica que es capaz de generar centenares de miles de copias de una secuencia sin la necesidad de clonarla en ningún tipo de vector. Esta aplicación tiene múltiples utilidades en investigación científica, médica y criminal. Además puede combinarse con la transcripción inversa de ARNm, con lo que se obtiene una gran cantidad de ADN a partir de unas pocas moléculas de ARNm. Esta técnica es muy empleada para el estudio de expresión génica, así como para la producción de proteínas en diferentes organismos.

6. ¿Cómo encontrar el gen adecuado? Imanes biológicos: sondas y anticuerpos Podemos encontrar genes o proteínas usando, respectivamente, sondas y anticuerpos, que actúan como imanes moleculares. Las sondas son fragmentos de ADN o ARN de simple cadena complementarias a la región de ADN o ARN que queremos encontrar. Las sondas pueden ser “coloreadas” durante su síntesis utilizando nucleótidos marcados con isótopos radiactivos, moléculas fluorescentes, un marcador químico que pueda ser detectado por un anticuerpo, o una enzima cuya actividad produce el cambio de color de su sustrato. Una de las técnicas más empleadas para localizar fragmentos determinados del genoma (o la expresión de algún gen en particular por medio de la detección de la presencia de su correspondiente ARNm) es la hibridación in situ. Durante este proceso se incuba el ADN con una sonda (de ADN o ARN) complementaria a la secuencia buscada, y marcada radiactiva o químicamente. Se puede también utilizar colonias de bacterias con ADN recombinante con una técnica similar, pero que usa anticuerpos en vez de sondas.

7. ¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes? La electroforesis en gel se utiliza para separar ácidos nucleicos o proteínas, de acuerdo con su tamaño. Esto se logra por la diferencia de desplazamiento de las moléculas a lo largo de un gel sometido a un campo eléctrico. Existen distintos tipos de gel; comúnmente se utiliza agarosa o poliacrilamida. La velocidad de desplazamiento de las moléculas es inversamente proporcional a su tamaño. Para un tiempo determinado, las moléculas más grandes quedarán más retrasadas en el gel que las moléculas más pequeñas. La separación de proteínas es más complicada, ya que éstas poseen una estructura tridimensional compleja y compacta, además de una carga neta que depende de la identidad de los aminoácidos que la componen. Esto hace más difícil separarlas sólo por su tamaño y por eso se emplea una versión modificada conocida como electroforesis en gel de poliacrilamida. Las proteínas forman bandas de acuerdo con su tamaño; si se corre una muestra con proteínas de tamaño conocido se puede determinar el tamaño de la proteína estudiada por la distancia recorrida en el gel. Las proteínas más grandes quedarán arriba y las más chicas quedan abajo (y las de tamaño medio quedarán entre las demás). Además, el grosor de la banda obtenida dependerá de la cantidad de proteína que se haya sembrado; cuanto mayor sea la cantidad de proteínas, más gruesa será la banda.

8. Southern, Northern y Western Blot La separación en gel por electroforesis es utilizado en múltiples técnicas como primer paso para identificar la presencia de determinadas moléculas dentro de una muestra. Una de ellas fue inventada por Edward M. Southernpara la detección de ADN. Una vez finalizada la corrida en el gel, se realiza la transferencia (o blotting) de las muestras a una membrana para su posterior revelado. Luego se utilizó el mismo sistema para detectar ARN y se lo denominó NorthernBlot (en clara alusión al nombre del científico inventor de la técnica basada en ADN).Los principios generales son los mismos, pero hay diferencias en el procedimiento debidas principalmente a que el ARN se degrada mucho más fácilmente que el ADN; esto hace necesario tomar muchas más precauciones. Estas dos técnicas persiguen fines distintos: el SouthernBlot, se usa, por ejemplo, para estudiar mutaciones en el genoma. El Northern, en cambio, permite detectar qué genes son transcriptos en determinadas condiciones. Si luego queremos detectar proteínas, usaremos otra técnica similar: el Western Blot, que deriva de la electroforesis en gel y separa proteínas mediante la utilización de anticuerpos específicos. Una vez que la muestra con las proteínas que se quiere identificar ha corrido en un gel, se la transfiere a una membrana especial donde las proteínas quedan “ancladas” o adheridas. Después, se incuba esta membrana con el anticuerpo específico contra la proteína blanco, y se revela. Con esta técnica pueden obtenerse datos aproximados del tamaño de la proteína y su concentración en la muestra sembrada.

9. ¿Cómo sacar fotos de genes activados? Microarrays Los ensayos con microarreglos son rápidos de realizar, pero muy engorrosos de analizar. Además, están muy limitados a los genes que ya se conocen. Permiten obtener un pantallazo rápido sobre qué está pasando en la célula en ese momento determinado, en cuanto a qué genes están encendidos y cuáles apagados. Sin embargo, los resultados obtenidos nunca deberían ser concluyentes, sino que tendrían que ser validados mediante otras técnicas (por ejemplo, NorthernBlot).