1. El Western blot es una técnica analítica que usa anticuerpos para detectar una proteína específica en un extracto crudo. 2. Primero, las proteínas son separadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y luego transferidas a una membrana de nitrocelulosa. 3. Luego, los anticuerpos se unen a la proteína de interés en la membrana para identificarla.

1. Western blot
MA. ELISA CARRIÓN B.
VIVIANA LLIGUICOTA
NANCY RIERA
VANESSA LLERENA
ISRAEL RIVERA
KARLATENESACA
JOSÉ DAVID TERÁN.

2. - técnica analítica
- usada para detectar una
proteína específica en un
extracto crudo
- mediante el uso de
anticuerpos.
Los anticuerpos son proteínas producidas por el sistema inmune
(INMUNOGLOBULINAS capaces de detectar proteínas
ajenas(ANTÍGENOS) y unirse específicamente a ellas
Western blot

3. - COMIENZA CON UNA CORRIDA ELECTROFORÉTICA
- EN GEL DE POLIACRILAMIDA
- PARA SEPARAR LAS PROTEÍNAS DE LA MUESTRA
- LAS PROTEÍNAS YA SEPARADAS
- SONTRANSFERIDAS A UNA MEMBRANA DE NITROCELULOSA
- LAS UNE CON FIRMEZA

4. - UNAVEZQUE LAS PROTEÍNASFUERONSEPARADAS EL GEL
- SERECUBRECON UNAHOJA DENITROCELULOSA
- SE CUBRECON UNACAPA GRUESADE TOALLASDEPAPEL
- SE COMPRIME CON UNAPLACAPESADA.
EL LÍQUIDOENEL GEL SE TRANSFIEREA TRAVÉSDE LANITROCELULOSA.
otra posibilidad:
- EMPLEAR LA ELECTROTRANSFERENCIAAPLICARUNACORRIENTEELÉCTRICA
- Y LA UTILIZACIÓNDEUNTAMPÓN DE TRANSFERENCIAPARA LLEVARLAS PROTEÍNAS
DESDE EL GEL A LA MEMBRANA.

5. - SE APILAN EN FORMA DE SÁNDWICH
LOS SIGUIENTES ELEMENTOS:
- ESPONJA,
- PAPELES EMPAPADOS CON BUFFERDE TRANSFERENCIA,
- GEL,
- MEMBRANA,
- PAPELES EMPAPADOS CON BUFFER YESPONJA,
Y LUEGO SE LE APLICA UNA CORRIENTE
ELÉCTRICA A TODO EL MONTAJE PARA QUE
LAS PROTEÍNAS CORRAN AL POLO
POSITIVO Y SE ATRAPEN EN LA MEMBRANA.

6. LOGRADA LA TRANSFERENCIA
DE LA BANDA DE PROTEÍNAS A
LA MEMBRANA DE
NITROCELULOSA
POR ALGUNO DE LOS DOS
TIPOS DE TRANSFERENCIA
TINCIÓN CON ALGÚN
COLORANTE COMO EL
PANCEAU S QUE ES FÁCIL DE
REMOVER.
LOS SITIOS DE ADSORCIÓN DE
LA NITROCELULOSA NO
OCUPADOS POR PROTEÍNAS
SE BLOQUEAN CON UNA
PROTEÍNA NO ESPECÍFICA
COMO LACASEÍNA
PREVENIR LA ADSORCIÓN NO
ESPECÍFICA DE LOS
ANTICUERPOS QUE LUEGO SE
INCORPORAN.

8. Proteína
s
Transferida
s
Desd
e la
Ge
l
Al
Membrana
Duració
n
30
minutos

9. Procedimiento
apilando
papel de
filtro
En una esponja
plana
Con Butte de
transferencia
el gel, la
membrana en
contacto
directo con
el gel.
más papel de
filtro y
finalmente
una esponja
plana

10. 8-10 V/cm
(de
separación
entre
electrodos
)
Velocidad
de
transferenc
ia inversa
al tamaño
de la
proteína
Refrigerar
y
recircular
el buffer
Luego de la
transferenci
a se puede
Analizarla
o
conservarl
a en frio
(2-8 )

11. geles
sometidos
a una
corriente
elevada
sistema
más
extendido
es el
'Semi-Dry
blotting'
que se
coloca una
pila
formada por
papel, gel,
la membrana
y más
papel, con
buffer.
entre dos
electrodos
planos
entre los
Rapidez
Transferen
cia en
pocos
minutos
VENTAJAS
Variantes de la electroforesis

12. TIPO
SSegún el tipo de detección de las proteínas.
Directo Indirec

13. Directo
El anticuerpo primario
se une al antígeno de la membrana
reacciona con el sustrato
originando una señal detectable
el anticuerpo primariodebe ir marcado con
una enzima

14. Indirec
to
El anticuerpo
primario sin
marcar
reacciona
con el
antígeno.
anticuerpo
secundario
marcado
se une al
primario
reacciona
con el
sustrato.

15. MEMBRANAS EN LA UTILIZACION DE WETR BLOG
• ventajas sobre el emplearlas dentro
del gel
pueden incubarse
fácilmente con
anticuerpos para la
detección de
proteínas específicas
Son más rápidas de
teñir y desteñir
Se detectan
cantidades menores
de proteínas se
concentran en la
superficie
Las membranas más
fáciles de manipular
que el gel

16. Una membrana que se
emplea es la
NITROCELULOSA
cuando se requieren
soportes más robustos
Reutilizar NYLON
bloquean con mas
dificultad.
Las membranas de
PVDF
gran capacidad de unión
a proteínas y gran
resistencia mecánica 
más utilizada.
las membranas son
hidrofóbicas
requieren un
tratamiento previo con
metanol
antes de sumergirlas
en soluciones
acuosas

17. 1. INMOVILIZACIÓN DE PROTEÍNAS SOBRE LA MEMBRANA, GENERALMENTE
MEDIANTE ELECTRO-TRANSFERENCIA.

18. 2. Bloqueoo saturaciónde todos los
lugares de unión de proteínasde la
membrana no ocupadospara evitarla
uniónnoespecíficade anticuerpos.
- Riesgo de backround
- Proteínas no específicas

19. 3. Incubacióndel 'blot' con anticuerposprimarioscontra la/s proteína/sde
interés.
- Unión
- Respuesta inmune
- Incubación en disolución
- 30 min a una noche entera

20. 4. INCUBACIÓN DEL ¨BLOT¨ CON ANTICUERPOS SECUNDARIOS, O REACTIVOS QUE
ACTÚAN DE LIGANDO PARAEL ANTICUERPO PRIMARIO UNIDO A ENZIMAS U OTROS
MARCADORES.

21. 5. SISTEMADE REVELADO DELAS BANDAS DE PROTEÍNAS MARCADAS CON EL
COMPLEJO DE ANTICUERPOS.

22. ELECCIÓN DELSISTEMA DERELEVADO

23. 6. LAVADO DEMEMBRANA

24. Western Blot
Se usa principalmente
para determinar la
presencia o ausencia de
una proteína concreta
en una muestra, los
niveles y tamaño de
este.
Enfermedades
inflamatorias
Aplicació
n
Prueba del
VIH
Enfermedades
infecto
contagiosas
Enfermedades de
citoquinas en
modelos
experimentales
Factores de
crecimiento
Proteínas de
secreción
Técnicas
relacionadas
Detección en el
propio gel
(“UnBlot® In-Gel
Detection”)
Far-Western
Blot Detection
Permite la detección
de proteínas que no
se transfieren con
eficiencia desde el
gel a la membrana
• Evita las perdidas de
proteínas durante el
proprio paso de
transferencia
Su utilización es para la
búsqueda de
interacciones entre
proteínas.
Utiliza una proteína
marcada en lugar de un
anticuerpo como sonda
en la membrana

25. Western Blot
Ventaja
s
Desventaja
s
Sensibilidad:
• Detecta un mínimo de
0,1ng de proteína de una
muestra
Alto costo:
• Costo individual de
anticuerpos
marcados, analistas y
equipos de laboratorio
Especificidad:
• Detección del tamaño de la
proteína
• Especificidad antígeno –
anticuerpo
• Detector selectivo de una
proteína
Cuestiones Técnicas:
• Requiere de
precisión
• Un pequeño error
del reactivo es
desastroso

26. Procedimiento
• Electroforesis en gel de
poliacrilamida para separar las
proteínas de la muestra
Se realizará un SDS-PAGE en un
gel 7%.
Ejemplo Western
Blot

27. 10 muestras
conteniendo 1 µl
de diluciones 1/2
de suero de ratón,
partiendo desde
una dilución 1/10.

28. Retirar el gel
entre los vidrios
con cuidado
y realizar un lavado
con TBS.

29. En un tupper colocar el transfer buffer 1 x frío con
metanol
colocar el cassette
esponjas
el papel de filtro.

30. Activar la membrana
con metanol
incubar 15 segundos
5 lavados con
agua destilada.
Colocar en el
tupper preparado

31. Armar el cassette
Controlar que no queden
burbujas entre los
elementos colocados ,el
aire impide la
transferencia.
Cerrar el cassette y
colocarlo en la cuba
con más transfer buffer
y el refrigerante.

32. .
Correr a 37 mA
durante 30
minutos en
agitación.
Teñir las
membranas con
rojo ponceau
por 30 segundos
Lavar el
colorante con
H2Od hasta ver
las bandas
Dejar en solución de
bloqueo (5% de leche
en polvo) 30 min a
temperatura
ambiente.

33. Realizar 2 lavados de 30 segundos con TBS.
Incubar las membranas con 5 ml del
anticuerpo marcado con biotina
,durante 45 minutos a 37°C en
agitación.
Realizar 3 lavados de 3 minutos con TBS-
T.
Incubar las membranas con
streptoavidina-peroxidasa durante 20
minutos a 37°C con agitación.

34. SOLUCIÓN1: SOLUCIÓN2 :
100µL DELUMINOL 6,1µL DEH2O2
44µL DE ÁCIDOP-CUMÁRICO 1ML DETRIS-HCL1MPH 8.5
1 ML DE TRIS-HCL 1M PH 8.5
LLEVARA VOLUMENFINAL10ML COM H2O
Para revelar mediante
quimioluminiscencia(luz)
se prepara dos
soluciones en tubos
diferentes correctamente
rotulados.

35. En obscuridad:
Unir ambas soluciones y
colocar la membrana
asegurando que el líquido
cubra perfectamente toda la
membrana.
Incubar durante 3 minutos.
Retirar la membrana y
colocarla dentro del
cassette.
Colocar la placa
fotográfica y revelar.

36. La calle 1 corresponde al control
positivo
RESULTAD
O:
Se observa que para la
proteína indicada con la
flecha, el resultado fue
positivo
por lo tanto es proteína está
presente en la célula HeLa.

37. CONCLUSIONES
WesternBlot es una
técnica analíticausada
para detectar una
proteína específica enun
extracto crudo,
mediante el uso de
anticuerpos
Las proteínas ya
separadas son
transferidasa una
membranade
nitrocelulosa
El procedimiento
comienza con
electroforética en gel de
poliacrilamida para
separar las proteínas de
la muestra,en nuestro
ejemplo el resultadofue
positivo