Este documento describe la citometría de flujo, una técnica de análisis celular multiparamétrico que permite detectar múltiples características de las células mediante el paso de una suspensión celular individual a través de un rayo láser. Incluye descripciones de los componentes ópticos, electrónicos y de fluidos del citómetro, así como de las señales que puede detectar como tamaño celular, complejidad interna y fluorescencia de marcadores. También resume aplicaciones como la inmunofenotipificación y
2. CITOMETRÍA DE FLUJO
Técnica de análisis celular multiparametrico
Se basa en hacer pasar
una suspensión
celular de forma
alineada y de a una
celular por vez delante
de un rayo laser
focalizado
3. 1) SISTEMA OPTICO
3) ELECTRONICA
E
INTEGRACION
DE LA SEñAL
FUENTE DE ILUMINACION: Lasers
CONJUNTO DE LENTES, ESPEJOS Y FILTROS
DETECTORES
2) FLUIDICA
GARANTIZA FLUJO
LAMINAR
E
HIDROENFOCADO DE LA
MTRA
4) SOFTWARE Y
ANALISIS DE
DATOS
COMPONENTES DE UN CITOMETRO DE FLUJO
4.
5.
6. * FSC (Forward Scatter)
luz dispersada a bajo ángulo (0-10º)
proporcional al tamaño celular
* SSC (Side Scatter)
luz dispersada a ángulo recto
proporcional a la complejidad de la
estructura interna
* Permite detectar señales de
fluorescencia, utilizando Ac
marcados con fluorocromos.
Señales
FluorescenciaDispersión
SEÑALES DETECTADAS
7. SEÑALES DETECTADAS
* SSC (Side Scatter)
luz dispersada a ángulo recto 90
proporcional a la complejidad de la
estructura interna
* FSC (Forward Scatter)
luz dispersada a bajo ángulo (0-10º)
proporcional al tamaño celular
21. Cada punto representa una
célula
Posiciones de los puntos:
intensidades relativas de los
dos parámetros (tamaño y
granularidad) medidos para tal
evento.
DOT PLOT
22.
23. DOT PLOT
+
+--
++-
-
FL-1
FL-2
Doble marcación:
Se utilizan 2 fluorocromos
con diferentes λ de emisión
Ej: FITC (verde)
PE (naranja)
NK en sangre periferica:
CD56lo-CD16hi
NK predominante en
ganglios: CD56hi-CD16lo
27. * Células suspendidas en un medio líquido
– Sangre
– Cultivos celulares
– Tejidos
– Tumores sólidos
– Alimentos (para estudio de contaminación
bacteriana)
* Las muestras sólidas se disgregan por digestión mecánica o
enzimática
MUESTRAS
Debe encontrarse en forma de suspensión monodipersa
28. Citometría de flujo: protocolo de marcación
+ Ac control/es de isotipo*
+ Ac contra Ag a analizar
Incubar, lavar, resuspender
Incubar, lavar, resuspender
* ¿Qué es un “control de isotipo”? Es una inmunoglobulina de la misma
especie y del mismo isotipo que el Ac que se está empleando para el análisis
pero que carece de reactividad contra las células que se están empleando.
De esta manera, la “marcación” con este Ac control de isotipo permite
establecer cuál es el nivel basal “background” de fluorescencia que produce
cualquier Ig en las células a estudiar y descontar esa fluorescencia basal de
la fluorescencia producida por el Ac que se está empleando para el análisis.
Muestra
Muestra
32. FACS (FLUORESCENCE ACTIVATED CELL SORTER)
Separación de poblaciones
se rompe la corriente que contiene las células en pequeñas gotas que se cargan
eléctricamente. Con la aplicación de un campo eléctrico se desvía su
trayectoria y se recogen las células en diversos recipientes.
33. APLICACIONES
Análisis y separación de subpoblaciones celulares
Marcadores de superficie
Proteínas intracelulares
Cuantificación
Inmunotipificación
Experimental
1. Análisis de apoptosis
2. Evaluación de la capacidad endocítica
3. Evaluación de funcionalidad de bombas de eflujo
ATP-dependientes (Pgp)
4. Determinación de citoquinas (CBA)
34. Ventajas
Marcaciones simultaneas
Analiza un alto número de células por segundo (5000
células/segundo)
Cuantifica intensidad antigénica
Mayor sensibilidad y objetividad que IF
Posibilidad de analizar poblaciones minoritarias
Permite almacenar la información
Desventajas
No se obtiene información sobre arquitectura de tejido
Notas del editor
Es una técnica que permite la medición simultánea de múltiples características de partículas en un flujo líquido. (Las células y/o partículas deben estar aisladas y en suspensión):
* Se utilizan anticuerpos conjugados con fluorocromos para la marcación de proteínas específicas de cada célula (análisis de poblaciones celulares)
* Colorantes y sondas específicas para determinación de apoptosis, proliferación, flujo de calcio, despolarización de membrana mitocondrial, ciclo celular, estallido repiratorio, etc
Fundamento: se basa en hacer pasar una suspensión de células alineadas y de una a una por delante de un haz de luz. El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a distintos parámetros que son recogidos por distintos detectores