1. Lina María Ruiz Hincapié
Director: Nicolas Guiliani
Co-Director: Carlos Jerez
Facultad de Ciencias

2. Acidithiobacillus ferrooxidans
 Bacteria Gram-negativa
 Acidófila
 Quimiolitoautotrófica
 Importante en la
biominería
EPS/ Fe3+
Sulfuro metálico

3. Formación de Biopelículas en A. Ferrooxidans
Cantidad y composición
química del EPS
Adaptado
Fuente energética
T. Gehrke et al. Appl Env Microbiol (1998)
T. Rohwerder et al. Appl Microbiol Biotechnol (2003)

4. Formación de Biopelículas en A. Ferrooxidans

5. Estados durante el desarrollo de biopelículas
 Unión
 Producción de EPS
 Formación de microcolonias
 Maduración de la arquitectura
 Dispersión de las bacterias de la biopelícula

6. Quorum Sensing (QS)
 QS  formación de la
biopelícula de varias especies.
 Unión
 Producción de
exopolisácarido
 Formación de microcolonias
 Maduración
 Dispersión de las bacterias de
la biopelicula
Baja densidad celular
Alta densidad celular

7. Vía de señalización del mensajero secundario
diguanilato cíclico (c-di-GMP)
DGC
GGDEF
l-di-GMP
PDE-A
EAL
PDE-B
PDE
HD-GYP
EfectoresPilZ
Sitio I
DGC
EAL
degenerado FLeQ cNMP
GEMM
 
c-di-GMP
 
Biopelícula Motilidad
Blancos
2 GTP 2 GMP

8. Interconexión del QS y el c-di-GMP
Ueda y col., 2009
Camilli y Bassler, 2006

9. ¿Qué se conocía sobre los mecanismos
moleculares que intervienen en la
regulación de la formación de
biopelículas en A. ferrooxidans?

10. Sistema funcional de QS AI-1 en A. ferrooxidans
afeI afeR
Caja
30pb orf3
C. Farah et al. Appl Env Microbiol (2005)

11. ORFs Probable actividad enzimática
GGDEF/EAL DGC/ PDE
EAL PDE
PilZ type IV pilus assembly
ORFs codificando para proteínas implicadas en la vía
del c-di-GMP en A. ferrooxidans

12. Hipótesis
La formación de biopelículas en Acidithiobacillus ferrooxidans podría ser regulada por el
sistema QS de tipo AI-1 y por la transducción de señales mediante el mensajero
secundario c-di-GMP.

13. Objetivo General
 Estudiar el posible papel del sistema de QS de tipo AI-1 y la vía
c-di-GMP en la regulación del desarrollo de la biopelícula en
A. ferrooxidans.
Objetivos Específicos
 Caracterizar mediante análisis bioinformáticos los componentes
moleculares de la vía c-di-GMP.
 Evaluar la funcionalidad de algunas de las putativas diguanilato ciclasas
(DGCs) y/o fosfodiesterasas (PDEs).
 Analizar los niveles del mensajero secundario c-di-GMP en células
conformando biopelículas sobre perlas de azufre versus células
planctónicas.
 Analizar el efecto de AHL y análogos de AHL en la formación de biopelícula
sobre pirita.

14. Metodología c-di-GMP
Identificación y
caracterización
in silico de los
componentes
moleculares de
la vía c-di-GMP
Herramientas
bioinformáticas
Análisis de la
transcripción de
los ORFs
involucrados en
la vía del
c-di-GMP
Extracción de RNA
RT-PCR
PCR en tiempo real
(qPCR)
Caracterización
de la presencia
del c-di-GMP y
actividad PDE
específica
Extracto proteinico
Extracto nucleotidico
Detección del
c-di-GMP (MS/MS)
Cuantificación del
c-di-GMP (LC-MS)
Estudios
funcionales en
E. coli de las
proteínas con
dominios
GGDEF/EAL
Clonamiento
molecular
SDS-PAGE y
Western blot
Unión de Rojo de
Congo
Detección del
c-di-GMP (MS/MS)
Actividad PDE
específica
Análisis del
papel de la vía
c-di-GMP en la
regulación de la
formación de
biopelícula
Extractos de
nucleótidos desde
células
conformando
biopelículas
Cuantificación del
c-di-GMP (LC-MS)

16. Caracterizar mediante análisis bioinformáticos los
componentes moleculares de la vía c-di-GMP.

17. Gen Probable actividad enzimática Dominios
(e-value)
AFE_0053 DGC/ PDE (841 aa) GGDEF (1e-42)
EAL (2e-44)
AFE_1360 DGC/ PDE (709 aa) GGDEF (4e-39)
EAL (3e-62)
AFE_1373 DGC/ PDE (665 aa) GGDEF (5e-33)
EAL (6e-72)
AFE_1379 DGC/ PDE (1057 aa) GGDEF (1e-37)
EAL (1e-44)
AFE_1852 PDE(228 aa) EAL (2e-23)
AFE_1172 type IV pilus assembly protein PilZ (118 aa) PilZ (1.2e-10
AFE_1374 type IV pilus assembly protein PilZ (185 aa) PilZ (4.6e-06)
AFE_2122 Phosphohydrolase (862 aa) HDc (8.6e-08)
AFE_2309 Phosphohydrolase(399 aa) HDc (1.9e-11)
AFE_2473 Phosphohydrolase(734 aa) HDc (1.8e-09)
ORFs codificando para proteínas implicadas en la vía
del c-di-GMP en A. ferrooxidans

18. Arquitectura de proteínas implicadas en la vía
c-di-GMP en A. ferrooxidans
EAL
GGDEF EAL
GGDEF EAL
GGDEF EAL
GGDEF EAL
PAS
GAFAFE_0053
AFE_1360
AFE_1373
AFE_1379
AFE_1852
GAF PAS PAS GAF
PAS PAC
PAC
PAC

19. Análisis comparativo de las secuencias de las
probables proteínas DGCs y PDEs de
A. ferrooxidans
Dos
YahA
VCA0785
VieA
AFE0053
AFE1379
AFE1360
AFE1373
Dgc2
Dgc3
Dgc1
AFE1852
YhjH
PdeA1
PdeA3
PdeA2
Dos
Dgc2
Dgc3
Dgc1
PleD
AFE0053
AFE1379
AFE1360
AFE1373
VCA0785
Sitio I Sitio A
PdeA1
PdeA3
PdeA2
Dos
YahA
VCA0785
VieA
AFE0053
AFE1379
AFE1360
AFE1373
Dgc2
Dgc3
Dgc1
AFE1852
YhjH

20. Evaluar la funcionalidad de algunas de las putativas
diguanilato ciclasas (DGCs) y/o fosfodiesterasas
(PDEs).

21. Análisis transcripcional de los ORFs que codifican
para proteínas involucradas en la vía c-di-GMP de
A. ferrooxidans ATCC 23270
RT_PCR qRT_PCR
GGDEF/EAL
PilZ

22. Análisis mediante espectrometría de masas del
c-di-GMP sintetizado químicamente
MS, m/z 689 (rojo) corresponde a una masa nominal de 690 g/mol ([M-H]-)
MS/MS de la señal m/z 689,
señales más intensas m/z 344 y m/z 538

23. Análisis de la presencia del mensajero secundario
celular c-di-GMP en células de A. ferrooxidans.

24. Análisis de los niveles del c-di-GMP durante la
curva de crecimiento de A. ferrooxidans crecido
en tiosulfato mediante HPLC acoplado a
espectrometría de masas

25. Determinación de la presencia de una actividad
fosfodiesterasa específica para el c-di-GMP en
extractos proteicos totales de A. ferrooxidans
ATCC23270.
Extractos proteicos
totales
(1 mg)
Liberación de pNP
Absorbancia (410 nm)
Fe exp 0.214 ± 0.016
Fe est 0.201 ± 0.016
Tio exp 0.449 ± 0.032
Tio est 0.765 ± 0.013
5 mM bis-pNPP
Tio: tiosulfato, Fe: hierro
exp: exponencial, est: estacionaria

26. SDS-PAGE de los extractos totales de proteínas de la cepa
E. coli que sobreexpresan las probables proteínas con
dominios GGDEF/EAL de A. ferrooxidans.
220
160
120
100
90
80
70
60
50
AFE0053
0h 2h 4h 6h 0h 2h 4h 6h 0h 2h 4h 6h
AFE1360 AFE1373MW
(kDa)CTR -
► ► ►
► ► ►
►
E. coli BL21(DE3) E. coli TOP10
pET-21b
IPTG
pBADTOPO

27. Caracterización fenotípica de la expresión de los genes de
A. ferrooxidans que codifican para probables proteínas
con dominios GGDEF/EAL en la cepa de E. coli BL21 (DE3)
crecida sobre placas.

28. Caracterización de la incorporación de Rojo de Congo en
E. coli que expresan los genes que codifican para
probables proteínas con dominios GGDEF/EAL de
A. ferrooxidans.
■ sin IPTG
□ con IPTG
■ inducido con Arabinosa
E. coli TOP10
pET-21b
pBADTOPO
E. coli BL21(DE3)

29. Análisis de la presencia del c-di-GMP en extractos
nucleotídicos de la cepa E. coli sobreexpresando
proteínas con dominios GGDEF y EAL de A. ferrooxidans.
Presencia del c-di-GMP
BLANCO n.d.
PleD::pET-42b/ BL21 + I +*
pET21b / BL21 + I n.d.
AFE0053::pET21b / BL21 + I +
AFE1360::pET21b / BL21 + I +
AFE1373::pET21b / BL21 + I +
pBADTOPO / TOP10 + A n.d.
AFE1379::pBADTOPO/ TOP10 + A +
n.d., no detectado; , presente; *, cantidad relativa 10 veces mayor
I, IPTG; A, arabinosa

30. Analizar los niveles del mensajero secundario c-di-GMP
en células conformando biopelículas sobre perlas de
azufre versus células planctónicas.

31. Análisis mediante HPLC acoplada a espectrometría de
masas de los niveles del c-di-GMP en células de
A. ferrooxidans conformando biopelícula sobre
diferentes fuentes energéticas.
Fuente Energética
ng c-di-GMP/
mg proteína
Azufrea 382.9
Concentrado de Cobrea 168.6
Piritaa 49.9
Tiosulfatob 24.0
Sulfato de hierrob 2.2
a Células adheridas a sustratos sólidos
b Células planctónicas en sustratos solubles
Azufre

32. •Se identificaron y caracterizaron in silico los componentes moleculares de la
vía c-di-GMP.
•Los ORFs involucrados en la vía del c-di-GMP en A. ferrooxidans se
transcriben.
•El mensajero secundario c-di-GMP está presente en la bacteria extremófila
A. ferrooxidans.
•Se caracterizó la presencia de una actividad fosfodiesterasa específica para el
c-di-GMP en A. ferrooxidans.
•Estudios funcionales de las proteínas con dominios GGDEF/EAL
sobreexpresadas en E. coli, indico que son DGCs.
•La vía c-di-GMP está involucrada en la regulación de la formación de
biopelícula en A. ferrooxidans .

33. C-di-GMP C-di-GMP
Ac. PDEgAc. PDEg
Ac. DGCg Ac. DGCg



Fase estacionariaFase exponencial
Tiosulfato

34. C-di-GMP C-di-GMP
Ac. PDEgAc. PDEg
Ac. DGCg Ac. DGCg

Hierro Tiosulfato


Fase exponencial

35. C-di-GMP C-di-GMP
Ac. DGCg Ac. DGCg

Planctónicas Biopelícula
Azufre

Ac. PDEg Ac. PDEg

36.  Analizar el efecto de AHL y análogos de AHL en la
formación de biopelícula sobre pirita.

37. Metodología QS
Análisis del efecto de AHLs y análogos de AHLs en la formación de biopelícula
por A. ferrooxidans ATCC 23270 sobre pirita
Ensayo de unión a pirita
Análisis de la biopelícula (AFM, EFM)

39. Análisis del efecto de una mezcla AHL sobre la
unión de Acidithiobacillus ferrooxidans a pirita.
 Mezcla de AHL
3-OH-C10-AHL
3-OH-C12-AHL
3-OH-C14-AHL
3-OH-C16-AHL
3-oxo-C10-AHL
3-oxo-C12-AHL
3-oxo-C14-AHL
3-oxo-C16-AHL
Mezcla de AHL [3.3 M] disminuye la unión de Acidithiobacillus ferrooxidans a la pirita
en un 42 % (■ 30.4 ± 7.6), CTR ( 52.2 ± 10.1).

40. Análisis del efecto de análogos de AHL sobre la
unión de Acidithiobacillus ferrooxidans a pirita.
4-phenyl-3-oxo-HSL (●)
CTR ()
Análogos de AHL Adherencia (%)
Control sin análogos de AHL
39.4 ± 10.1
3-sulfonilamida-C8-HSL
47.1 ± 11
4-bromo-3-(bromometileno)-
furanona
49.9 ± 3.5
p-bromo-3-fenil-HSL
55.4 ± 9.7
SO2

41. Análisis del efecto de una mezcla de AHLs en el
desarrollo de biopelícula en A. ferrooxidans
mediante microscopía de epifluorescencia.
5 µm
Adherencia Microcolonia Monocapa

42. •En células crecidas en azufre versus las crecidas en sulfato de hierro
durante la fase estacionaria, se induce la expresión del gen afeI que
codifica para la sintasa de AHLs correlacionándose con una mayor
presencia de C12-AHL y C14-AHL (Farah y col., 2005)..
•A su vez, éstas moléculas adicionadas exógenamente a células de
A. ferrooxidans aumentan la formación de biopelícula en azufre
(González, 2010; Tesis de Doctorado Sigde Mamani).
•Por otro lado, una mezcla de AHLs, disminuyó la adherencia de
A. ferrooxidans a los granos de pirita y la formación de biopelícula (esta
tesis).
•Todo esto nos ha permitido concluir que el sistema de QS de tipo AI-1
regula la formación de biopelícula en A. ferrooxidans ATCC23270.

43. Conclusiones
 Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270 posee una vía
funcional de señalización mediante el mensajero secundario
diguanilato cíclico (c-di-GMP). Esta vía está involucrada en la
respuesta al sustrato energético y en la regulación del
desarrollo de biopelícula de A. ferrooxidans.
 El sistema de QS de tipo AI-1 de A. ferrooxidans ATCC 23270,
está involucrado en la regulación del desarrollo de la
biopelícula de A. ferrooxidans sobre pirita.

44. Perspectivas
 Proteínas bifuncionales  actividad DGC y PDE  proteínas con los
dominios GGDEF/EAL de A. ferrooxidans ATCC 23270 podrían presentar
actividad PDE.
 Indagar si existen algunas condiciones experimentales que favorezcan que
AFE0053, AFE1360, AFE1373 y AFE1379 actúen como PDEs.
 Cuantificar el mRNA de los genes que codifican para proteínas con los
dominios GGDEF/EAL mediante qPCR o experimento de microarreglos de
DNA comparando las diferentes fases del crecimiento bacteriano, con
diferentes sustratos energéticos y en células planctónicas versus células
conformando biopelículas .
 Correlacionar el número de copias de mRNA de los genes que codifican
para proteínas con dominios GGDEF/EAL con la medición de los niveles de
proteína.

45. Perspectivas
Interconexión del sistema de QS y la vía
c-di-GMP en A. ferrooxidans
 S○  fase estacionaria  C12-AHL y C14-AHL  inducir la
formación de biopelícula.
 Biopelícula sobre S○   c-di-GMP
 ¿Tienen C12-AHL y C14-AHL la capacidad de inducir actividad DGC
o inhibir actividad PDE?
 ¿Tiene la mezcla de AHLs la capacidad de inhibir actividad DGC o
activar actividad PDE?
 Para tratar de contestar estas preguntas, nuestro laboratorio
planifica realizar ensayos de qPCR y microarreglos de DNA.

46. Publicaciones
 González A., Bellenberg S., Mamani S., Ruiz L., Echeverría A., Soulère L., Doutheau A.,
Demergasso C., Sand W., Queneau Y., Vera M., Guiliani N. 2013. AHL signaling molecules
with a large acyl chain enhance biofilm formation on sulfur and metal sulfides by the
bioleaching bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans. Appl Microbiol Biotechnol.
97(8):3729-3737.
 Ruiz L.M., Castro M., Barriga A., Jerez C.A., Guiliani N. 2012. The extremophile
Acidithiobacillus ferrooxidans possesses a c-di-GMP signalling pathway that could play a
significant role during bioleaching of minerals. Lett Appl Microbiol. 54(2):133-139.
 Castro M., Ruiz L.M., Barriga A., Jerez C. A., Holmes D., and Guiliani N. 2009. C-di-GMP
pathway in biomining bacteria. Journal of Advanced Materials Research. 71-73:223-
226.
 Ruiz L.M., Valenzuela S., Castro M., González A., Frezza M., Soulère L., Rohwerder T.,
Queneau Y., Doutheau A., Sand W., Jerez C. and Guiliani N. 2008. AHL comunication is a
widespread phenomenon in Acidithiobacillus ferrooxidans species and seems to be
involved in mineral-adhesion efficiency. Hydrometallurgy. 94:133-137.

47. Publicaciones
 Ruiz L.M., Sand W., Jerez C. A. J. and Guiliani N. 2007. C-di-GMP pathway in
Acidithiobacillus ferrooxidans: analysis of putative diguanylate cyclases (DGCs)
and phosphodiesterases (PDEs) bifunctional proteins. Journal of Advanced
Materials Research. 20-21:551-555.
 Ruiz L. M., Gonzalez A., Frezza M., Soulere L., Queneau Y., Doutheau A.,
Rohwerder T., Sand W., Jerez C. A., and Guiliani N. 2007. Is the quorum
sensing type AI-1 system of Acidithiobacillus ferrooxidans involved in its
attachment to mineral surfaces? Journal of Advanced Materials Research.
20-21:345-349.