pGLO tutorial en español

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pGLO tutorial en español

  1. 1. <ul><li>2007 Desarrollo Profesional </li></ul>
  2. 2. Transformación de pGLO ™ y Purificación de la Proteína GFP (Green Fluorescent Protein) Instructores <ul><li>Essy Levy, M.S. </li></ul><ul><li>Coordinadora de Programas de Hughes Scholars </li></ul><ul><li>UCSD, San Diego CA </li></ul><ul><li>Julie Mathern </li></ul><ul><li>BioEducation Product Manager </li></ul><ul><li>Bio-Rad Laboratories, Hercules CA </li></ul><ul><li> </li></ul>
  3. 4. ¿Para que enseñar la transformación genética? <ul><li>Una herramienta poderosa para el aprendizaje </li></ul><ul><li>Parte de los estándares nacionales curriculares </li></ul><ul><li>Varias extensiones de practicas de laboratorio </li></ul><ul><li>Conexiones con el mundo real </li></ul><ul><li>Conexiones con carreras científicas académicas y en la industria </li></ul>
  4. 5. Dogma Central de la Biología Molecular ADN ARN Proteína Característica
  5. 6. Conexiones con el mundo real <ul><li>GFP es un marcador visual </li></ul><ul><li>Estudio de los procesos biológicos </li></ul><ul><li>(ejemplo: la síntesis de las proteínas) </li></ul><ul><li>Localización y regulación de la expresión de un gen </li></ul><ul><li>Movimiento celular </li></ul><ul><li>El destino celular durante el desarrollo </li></ul><ul><li>Formación de los diferentes órganos </li></ul><ul><li>Marcadores genéticos útiles para identificar organismos transgénicos </li></ul>
  6. 7. Kit de Transformación de Bacteria con pGLO ™ <ul><li>Ventaja del uso del kit pGLO de Bio-Rad </li></ul><ul><li>Basado en los estándares curriculares </li></ul><ul><li>Currículo comprensible para las investigaciones basadas en el proceso del cuestionamiento </li></ul><ul><li>Compatible con un periodo de clase de </li></ul><ul><li>50 minutos </li></ul><ul><li>Proporciona una clase entera de 32 estudiantes (4 estudiantes por grupo) </li></ul><ul><li>Costo económico </li></ul><ul><li>Resultados exitosos en las manos de los estudiantes </li></ul><ul><li>Seguro para uso en el aula </li></ul><ul><li>¡Resultados tangibles! </li></ul>
  7. 8. Procedimiento Transformación <ul><li>Day 2 </li></ul>Day 1
  8. 9. Horario para el Taller de GFP <ul><li>Introducción </li></ul><ul><li>Transformación de bacteria con el plásmido de pGLO </li></ul><ul><li>Inducción de la expresión de GFP con arabinosa y la subsecuente purificación de la proteína </li></ul>
  9. 10. Kit de Transformación de Bacteria con pGLO ™
  10. 11. ¿Que es una transformación? <ul><li>Absorción de </li></ul><ul><li>ADN exógeno; </li></ul><ul><li>frecuentemente </li></ul><ul><li>un plásmido </li></ul><ul><li>circular </li></ul>GFP Lactamasa beta Resistencia a la Ampicilina
  11. 12. ¿Que es un plásmido? <ul><li>Un pedazo circular de </li></ul><ul><li>ADN que se replica </li></ul><ul><li>autónomamente </li></ul><ul><li>Evolucionado </li></ul><ul><li>originalmente en </li></ul><ul><li>bacterias </li></ul><ul><li>Puede expresar </li></ul><ul><li>resistencia a un </li></ul><ul><li>antibiótico o puede </li></ul><ul><li>ser modificado para </li></ul><ul><li>expresar una proteína </li></ul><ul><li>de interés </li></ul>
  12. 13. Las diferentes caras de un plásmido Micrografía de transmisión de electrones Gel de agarosa Representación Grafica
  13. 14. Plásmido pGLO <ul><li>Lactamasa Beta </li></ul><ul><li>-Resistencia a la </li></ul><ul><li> ampicilina </li></ul><ul><li>La proteína GFP (Green Fluorescent Protein) </li></ul><ul><ul><li>Aequorea victoria gen de medusa </li></ul></ul><ul><li>araC: Regulador </li></ul><ul><li>Regula la trascripción de GFP </li></ul>
  14. 15. Transformación con pGLO Lactamasa Beta (resistencia a ampicilina) Plásmidos de pGLO Cromosoma Bacteriano (ADN) Pared celular GFP
  15. 16. ADN Bacteriano Plásmido de ADN Célula de Bacteria ADN Geonómico
  16. 17. Regulación de Trascripción <ul><li>Operón de lactosa </li></ul><ul><li>Operón de Arabinosa </li></ul><ul><li>Plásmidos de pGLO </li></ul>
  17. 18. Regulación de Trascripción B A D araC B A D araC ARN Polimerasa Efector (Arabinosa) araC B A D Operón ara ARN Polimerasa Z Y A Z Y A LacI Efector (Lactosa) Z Y A LacI Operón lac
  18. 19. Regulación de la expresión del gen ARN Polimerasa araC Operón GFP Gen de GFP araC Gen de GFP araC Gen de GFP Efector (Arabinosa) B A D araC B A D araC ARN Polimerasa Efector (Arabinosa) araC B A D Operón ara
  19. 20. Métodos de Transformación <ul><li>Electroporación </li></ul><ul><ul><li>Un choque eléctrico resulta en que la célula sea permeable al plásmido ADN </li></ul></ul><ul><li>Cloruro de Calcio y Choque Térmico </li></ul><ul><ul><li>Las células químicamente competentes absorben el ADN después del choque térmico </li></ul></ul>
  20. 21. Proceso de Transformacion <ul><li>Suspender las colonias en la Solución de Transformación </li></ul><ul><li>Añadir el plásmido pGLO ADN </li></ul><ul><li>Incubar los tubos en hielo ice </li></ul><ul><li>Choque térmico a 42°C y colocar en hielo </li></ul><ul><li>Incubar con caldo nutriente LB </li></ul><ul><li>Extienda la suspensión por la superficie de las placas </li></ul>
  21. 22. ¿Porque es importante cada paso de la transformación? <ul><li>La solución de transformación = CaCI 2 </li></ul><ul><li>La carga positiva </li></ul><ul><li>del los iones de </li></ul><ul><li>Ca +2 neutralizan </li></ul><ul><li>la carga negativa </li></ul><ul><li>de los fosfatos del </li></ul><ul><li>ADN </li></ul>Ca ++ Ca ++ O CH 2 O P O O O Base CH 2 O P O O O Base OH Azúcar Azúcar O Ca ++
  22. 23. ¿Porque es importante cada paso de la transformación? 2. Incubación en hielo -disminuye la fluidez de la membrana celular 3. Choque térmico -incrementa la permeabilidad de la membrana celular 4. La recuperación con LB permite la expresión de lactamasa beta Lactamasa Beta (resistencia a ampicilina) Pared Celular GFP
  23. 24. ¿Que es el caldo nutriente de LB? <ul><li>Caldo L uria- B ertani (LB) </li></ul><ul><li>Un medio que contiene los nutrientes para el crecimiento bacteriano y la expresión de los genes de interés </li></ul><ul><ul><li>carbohidratos </li></ul></ul><ul><ul><li>aminoácidos </li></ul></ul><ul><ul><li>nucleótidos </li></ul></ul><ul><ul><li>Sales </li></ul></ul><ul><ul><li>Vitaminas </li></ul></ul>
  24. 25. ¿Crecer? ¿Brillar? <ul><li>Siga el protocolo </li></ul><ul><li>¿En que placas crecerán colonias? </li></ul><ul><li>¿Que colonias brillarán? </li></ul>LB/Amp LB/Amp/Ara LB
  25. 26. Medida de Volumen

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