aislamiento

1. Aislamiento de cepas de Bacillus thuringiensis de suelos y cadáveres de
insectos.
GUADALUPE PEÑA-CHORA1*
, LAURA LINA-GARCIA2*
, ALICIA FONSECA-
GONZALEZ2
, VÍCTOR HERNÁNDEZ-VELAZQUEZ2*
, ADRIANA G. TREJO-LOYO1*
y
FRANCISCO SOTELO-RIVERA1*
.
1
Centro de Investigaciones Biológicas, Universidad Autónoma del Estado de Morelos. Avenida Universidad, 1001,
Col. Chamilpa, Cuernavaca, Mor. CP 62209. 2
Centro de Investigación en Biotecnología, Universidad Autónoma del
Estado de Morelos. Avenida Universidad, 1001, Col. Chamilpa, Cuernavaca, Mor. CP 62209. * Cuerpo Académico
de Entomología y Fitopatología.
RESUMEN
La bacteria Bacillus thuringiensis es el bioplaguicida que más se utiliza a nivel mundial para el control de
plagas agrícolas y de vectores de enfermedades a humanos. Se puede aislar de suelos, agua, cadáveres de
insectos, entre otros. Para aislar Bt de suelos, las muestras se deben de recolectar de lugares donde no se
haya aplicado para el control de alguna plaga. También se puede realizar una búsqueda dirigida, para lo
cual se colectan cadáveres del insecto que es nuestro objetivo y se procesan las muestras para aislar las
cepas de Bt.
INTRODUCCIÓN.
Bacillus thuringiensis (Bt) es el bioplaguicida que más se utiliza a nivel mundial para el control
de plagas agrícolas, forestales y vectores de enfermedades. Es una bacteria Gram positiva,
aerobia facultativa, que produce una o más inclusiones paraesporales, también llamados cristales,
durante la fase estacionaria, en cantidades que pueden ser hasta del 30% del peso total de la
célula, son liberadas al medio con las esporas cuando la célula se lisa. Las inclusiones contienen
varios tipos de protoxinas llamadas δ-endotoxinas (Koziel et al., 1993; Li, et al., 1996; de Maagd,
2002). Las δ-endotoxinas son los factores más significativos que determinan la toxicidad de esta
bacteria hacia un amplio rango de especies de insectos (de Maagd et al., 2003). La bacteria
puede producir otras proteínas insecticidas durante las diferentes fases de su desarrollo y
compuestos extracelulares como: enterotoxinas, fosfolipasas, hemolisinas, proteinasas, proteínas
insecticidas vegetativas, β-exotoxinas, bacteriocinas, proteínas de superficie, antibióticos que
pueden contribuir a su patogenocidad (Dulmage, 1981; Fedhila et al.,2004; Fast, 1981; Milner,
1994; Schnepf et al., 1998; Aronson y Shai, 2001; Hansen y Salamitou, 2000; Kubota et al.,
2006) y además pueden funcionar como receptor, como en el caso de la proteína Cyt1Aa (Pérez
et al., 2005). Bt se encuentra en todo el mundo y en todos los ecosistemas debido a que su espora

2. es resistente a la deshidratación y altas temperaturas (Damgaard, 2000). B. thuringiensis ha sido
aislada de suelos (Martín y Travers, 1989; Bravo et al., 1998; Uribe et al., 2003; Quesada-
Moraga et al., 2004), cadáveres de insectos, polvos de granos y otros productos almacenados,
hojas de árboles perennifolios y caducifolios (Damgaard, 2000; Smith y Couche, 1991), agua y
otros sustratos (Schnepf et al., 1998). En el presente trabajo se discuten tres técnicas que se han
utilizado para aislar cepas de B. thuringiensis en el Laboratorio de Parasitología Vegetal del
Centro de Investigaciones Biológicas de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Aislamiento de suelos.- Los suelos son una fuente con una gran de cantidad esporas de B.
thuringiensis, para el aislado de cepas se puede tomar de 0.5 a 1kg de suelo, en el laboratorio se
mezcla la muestra y se toma un gramo de suelo, el cual se coloca en un tubo Eppendorf de 1.5ml
estéril, se le agrega un mililitro de agua destilada estéril, se le da un choque térmico a 60°C
durante 60 minutos, para eliminar hongos y bacterias no formadoras de esporas. Posteriormente
con un asa se estría en medio Luria-Bertani (LB) para obtener colonias únicas, la caja de Petri se
incuba a 30°C durante 24h, las colonias se crecen en forma individual en una caja de Petri, hasta
tener más del 90% de esporulación. Cada cepa se observa en un microscopio compuesto para
detectar la presencia de cristales. Las cepas que produzcan cristales se guardan en glicerol al
60%.
De insectos vivos.- En este caso se colecta el mayor número posible de insectos, la ventaja con
esta técnica es que la búsqueda es dirigida, es decir sólo se colecta la especie de nuestro interés.
En campo los insectos se pueden colocar en un tubo Eppendorf de 1.5ml estéril, en laboratorio se
le agregan 500 microlitros de LB líquido, con una punta estéril se macera el organismo y se
incuba durante 72h a 30°C, se puede tomar una azada y estriar en medio LB sólido, sin embargo
pueden crecer otro tipo de bacterias u hongos, por lo que se recomienda dar un choque térmico a
60°C por 60 minutos para eliminar los microorganismos contaminantes.
De cadáveres de insectos.- Los cadáveres se colectan en campo y se depositan en tubos
Eppendorf de un volumen de 1.5ml, o se capturan los insectos y se colocan en una jaula con
alimento, cada 24h se recogen los organismos muertos y se guardan en un tubo Eppendorf, en

3. laboratorio se agregan 500 microlitros de medio LB líquido, con una punta estéril se maceran los
cadáveres, se incuba durante 72 horas y se estría para obtener colonias únicas o se da el choque
térmico y posteriormente se siembra para obtener colonias únicas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
Se evaluaron 241 cepas de B. thuringiensis aisladas de suelos contra larvas neonatas de
Epilachna varivestis (Coleoptera: Coccinellidae) a dosis de 100 y 1000ng/cm2
de follaje y
ninguna produjo un 100% de mortalidad a la dosis de 1000ng, sin embargo se colecto el cadáver
de una larva de E. varivestis y se aislaron cuatro cepas de Bt, las cuales produjeron un 100% de
mortalidad con la dosis de 100ng/cm2
de follaje. Se han aislado 838 cepas de Bt de 1298
cadáveres de insectos procesados que se han colectado en campo, lo cual nos indica que el 64.5%
de las muestras estaban infestadas con Bt, sin embargo esto no quiere decir que sea la que causo
la muerte del organismo. Además en una búsqueda dirigida de B. thuringiensis de cadáveres de
larvas de Diatraea magnifactella, se han procesado 651 muestras, obteniendo un total de 67
cepas de Bt, sin embargo no se han realizado bioensayos para determinar las cepas que sean
virulentas a D. magnifactella. Cualquiera de las tres técnicas son útiles para aislar cepas de Bt, sin
embargo consideramos que es más eficiente aislarlas directamente de cadáveres de la especie
blanco, ya que existe una mayor probabilidad de que la cepa sea virulenta.
LITERATURA CITADA
Aronson, A. I., Y. Shai. 2001. Why Bacillus thuringiensis insecticidal toxins are so effective: unique
features of their mode of action. FEMS Microbiological Letters. 195: 1-8.
Bravo, A., S. Sarabia, L. López, H. Ontiveros, C. Abarca, A. Ortiz. M. Ortiz, L. Lina, F. J. Villalobos, G.
Peña, M. E. Nuñez-Valdez, M. Soberón, R. Quintero. 1998. Characterization of cry genes in a
Mexican Bacillus thuringiensis strain collection. Applied and Environmental Microbiology. 64:
4965-4972.
Crickmore, N., D. R. Zeigler, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, A. Bravo, D. H. Dean. 2009.
Bacillus thuringiensis toxin nomenclaure.
http://www.biols.susx.ac.uk./Home/NeilCrickmore/Bt/index.html
Damgaard, P. H. 2000. Natural occurrence and dispersal of Bacillus thuringiensis in the environment . Pp.
23-40. In: Entomopathogenic bacteria: from laboratory to field application. J. F. Charles, A.
Delécluse, C. Nielsen-Le Roux (Eds.).
de Maagd, R. A. 2002. Environmental impact of insect-resistant plants expressing a Bt toxin. II Non-target
effects (Update) and Bt resistance in target insects. Note 218. Plant Research International B. V.,
Wageningen, The Netherlandas. 62 pp.

4. de Maagd, R. A., A. Bravo, C. Berry, N. Crickmore, H. E. Schnepf. 2003. Structure, diversity and
evolution of protein toxins from spore-forming entomopathogenic bacteria. Annual Review of
Genetics. 37: 409-433.
Dulmage, H. T. 1981. Insecticidal activity of isolates of Bacillus thuringiensis and their potential for pest
control. Pp. 193-222. In: Microbial control of pests and plant diseases 1970-1980. H. D. Burges
(Ed.). Academic Press.
Estruch, J. J., G. W. Warren, M. A. Mullins, G. J. Nye, J. A. Craig y M. G. Koziel. 1996. Vip3A, a novel
Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against
lepidopteran insects. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 93: 5389-5394.
Fast, P.G. 1981. The crystal toxin of Bacillus thuringiensis. En: Microbial control of pests and plant
diseases 1970-1980. H. D. Burges (Ed.). Academic Press. 223-248 pp.
Fedhila, S., E. Guillemet, P. Nel, D. Lereclus. 2004. Characterization of two Bacillus thuringiensis genes
identified by in vivo screening of virulence factors. Applied and Environmental Microbiology. 70
(8): 4784-4791.
Hansen, B. M., S. Salamitou, 2000. Virulence of Bacillus thuringiensis. Pp. 41-63.
In: Entomopathogenic bacteria: from laboratory to field application. J. F. Charles, A. Delécluse y C.
Nielsen-Le Roux (Eds.).
Koziel, M. G., N. B. Carozzi, T. C. Currier, G. W. Warren, S. V. Evola. 1993. The insecticidal crystals
proteins of Bacillus thuringiensis: past, present and future uses. Biotechnology and Genetic
Engineering Reviews. II: 173-228.
Kubota, Y., A. Ohgushi, A. Uemori, E. Mizuki y M. Ohba. 2006. Identification of two haemolysins in
larvicidal activity of Bacillus thuringiensis against the bean bug, Riptortus clavatus. Journal of
Applied Entomology. 130 (3): 183-189.
Li, J., P. A. Koni, D. J. Ellar. 1996. Structura of the mosquitocidal δ-endotoxin CytB from Bacillus
thuringiensis sp. kyushuensis and implications for membrane pore formation. Journal of Molecular
Biology. 257: 129-152.
Milner., R. J. 1994. History of Bacillus thuringiensis. Agriculture, Ecosystems and Environment. 49: 9-13.
Schnepf, E., N. Crickmore, J. van Rie, D. Lereclus, J. Baum, J. Feitelson, D. R. Zeigler, D. H. Dean. 1998.
Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. MicrobIology Molecular Biological
Reviews. 62 (3): 775-806
Martin, P. A. W., R. S. Travers. 1989. Worldwide abundance and distribution of Bacillus thuringiensis
isolates. Applied and Environmental Microbiology. 55 (10): 2437-2442.
Quesada-Moraga, E., E. García-Tovar, P. Valverde-García, C. Santiago-Álvarez. 2004. Isolation,
geographical diversity and insecticidal activity of Bacillus thuringiensis from soils in Spain.
Microbiological Research. 159: 59-71.
Smith, R. A., G. Couche. 1991. The phylloplane as a source of Bacillus thuringiensis variants. Applied
and Environmental Microbiology. 57(1): 311-315.
Uribe, W., W. Martinez, J. Cerón. 2003. Distribution and diversity of cry genes in native strains of
Bacillus thuringiensis obtained from different ecosystems from Colombia. Journal of Invertebrate
Pathology. 82: 119-127.