Descargar para leer sin conexión
05-MICROSCOPIA, ORIGENES Y TIPOS DE MICROSCOPIOS.pptx
- 1. Dr. Marcos JavierMaldonado. Profesor Adjunto - FCA - UNJu - Jujuy Lic. Edgardo Gustavo Hinojosa. Jefe de Trabajos Prácticos - UNJu - Jujuy BIOLOGÍA Microscopías óptica y electrónica. Microscopio óptico simple y compuesto. Microscopios especiales de: fondo oscuro, fluorescencia, polarización, contraste de fase, interferencia, confocal. Electrónicos de transmisión y de barrido. Fundamento. Unidades de medida. Análisis de fracciones celulares. Técnicas Histológicas. Métodos de inclusión para Microscopía óptica y Microscopía electrónica. Diferencias entre microscopía óptica y microscopía electrónica para la observación de células y tejidos. UNIDAD V MICROSCOPIA. MÉTODOS DE ESTUDIO DE LA CÉLULA 1
- 2. Dr. Marcos JavierMaldonado. Profesor Adjunto - FCA - UNJu - Jujuy Lic. Alicia Cruz. Jefe de Trabajos Prácticos - UNJu - Jujuy BIOLOGÍA Microscopías óptica y electrónica. Microscopio óptico simple y compuesto. Microscopios especiales de: fondo oscuro, fluorescencia, polarización, contraste de fase, interferencia, confocal. Electrónicos de transmisión y de barrido. Fundamento. Unidades de medida. Análisis de fracciones celulares. Técnicas Histológicas. Métodos de inclusión para Microscopía óptica y Microscopía electrónica. Diferencias entre microscopía óptica y microscopía electrónica para la observación de células y tejidos. UNIDAD VI MICROSCOPIA. MÉTODOS DE ESTUDIO DE LA CÉLULA 2
- 3. 3 Microscopía HISTORIA DE LAMICROSCOPIA Conjunto de métodos empleados en las investigaciones y estudios por medio del microscopio. Estudia el funcionamiento y composición de los microscopios En la antigüedad se usaban espejos curvos y esferas de cristal llenas de agua para aumentar el tamaño de las imágenes Se creía que los seres vivos mas pequeños eran los insectos diminutos
- 4. Ya enel siglo XIV, con la invención de las primeras lentes para corregir la visión, surgió la curiosidad sobre su capacidad de aumentar el tamaño aparente de los objetos. Se dice que Galileo hizo algunas observaciones "microscópicas" invirtiendo su telescopio a partir de lentes montadas en un tubo, pero en cualquier caso está claro que no tuvieron ninguna repercusión: occhiolinoo. La primera referencia segura sobre el microscopio (1621) se debe a Constantijn Huygens, quien relata que Cornelis Drebbel tenía en su taller un instrumento magnificador, que recibió el nombre de microscopium en 1625, en la Accademia dei Lincei, de Roma. 1665 Robert Hooke perfecciona el microscopio y gracias a él se acuña la definición de célula. EL PERIODO DE LOS PRIMEROS MICROSCOPISTAS 4
- 5. 5 En 1665Hooke observo un delgado corte de corcho. El material era poroso, y esos poros formaban cavidades poco profundas que modos de celdas, a la que llamo células. En realidad eran células muertas. Paredes de celulosa de las células que alguna vez fueron células vivas.
- 6. 6 Marcello Malpighifue uno de los microscopistas más grandes de la historia. Primeros estudios con pulmones de rana, observando una compleja red de vasos sanguíneos, demasiado pequeños para ser vistos por separado. Las arterias y las venas se unían mediante una red de vasos: capilares. Las primeras publicaciones importantes aparecen en 1660 y 1665 cuando Malpighi observa los capilares sanguíneos y Hooke publica su obra Micrographia
- 7. 7 Microscopios italianos delsiglo XVII como los usados por Malpighi
- 8. El descubrimientode los microorganismos fue obra del comerciante holandés, Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723), quien en su pasión por pulir y montar lentes casi esféricas sobre placas de oro, plata o cobre, casi llegó a descuidar sus negocios. Fabricó unos 400 microscopios simples, con los que llegó a obtener aumentos de casi 300 veces. En 1675 descubrió que en una gota de agua de estanque pululaba una asombrosa variedad de pequeñas criaturas a las que denominó "animálculos". En 1683 descubre las bacterias, por lo que se considera el "PADRE DE LA MICROBIOLOGÍA". Describió protozoos (Giardia, de sus propias heces), la estructura estriada del músculo, la circulación capilar, placa dental, espermatozoides y glóbulos rojos (fundador de la Histología animal), detallo diversos aspectos estructurales de las semillas y embriones de plantas. 8
- 9. 9 El primitivo microscopiotenía 2 lupas combinadas con las que llegó a alcanzar 260 aumentos, lo cual le permitió visualizar algunos protozoos e infusorios
- 10.
- 11. 11 Mejora la microscopíade inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro lo que permite obtener 2.000 aumentos CARL ZEISS
- 12.
- 13. 13 ESQUEMA DEL MICROSCOPIO •Un tubo cilíndrico aloja el sistema ÓPTICO: ocular - objetivo. • Una platina permite observar las preparaciones, que son iluminadas por un espejo cóncavo que concentra la luz sobre el objeto a estudiar
- 14. 14 EL MICROSCOPIO DELUZ= OPTICO Este instrumento magnifica y enfoca los rayos de luz por medio de lentes. La luz puede ser natural o artificial. El microscopio de DISECCIÓN, ESTEREOSCOPIO, SIMPLE o LUPA se usa para estudiar especímenes en 3 dimensiones y a baja magnificación. La fuente de luz está sobre la muestra. El microscopio COMPUESTO se usa para estudiar porciones pequeñas y finas de especímenes en cortes longitudinales o transversales. Tiene diferentes magnificaciones y se pueden apreciar más detalles. La fuente de luz está debajo del espécimen.
- 15. 15 PARÁMETROS ÓPTICOS I. Aumento II.Poder de resolución III. Nº de campo IV. Profundidad de foco V. Contraste I. AUMENTO Imagen AGRANDADA del objeto observado Se calcula multiplicando el aumento del objetivo por el aumento del ocular
- 16. 16 Mayor, con aceitede cedro Capacidad de distinguir 2 puntos adyacentes como distintos y separados = Distancia mínima a la que se pueden discriminar 2 puntos II. PODER DE RESOLUCIÓN Si la distancia que los separa es inferior a la 𝝺 que los ilumina aparecerán a nuestra vista como 2 puntos unidos. De nada sirve entonces aumentar el poder amplificador del microscopio. Lo que lograríamos es aumentar de tamaño aparente esa mancha difusa procedente de la unión de los 2 puntos, pero sin conseguir verlos separados. Si el poder de resolución tiene una distancia mínima menor a la distancia entre 2 puntos, se veran como 2 puntos separados.
- 17. 17 Diámetro de laimagen observada a través del ocular, expresado en mm III. NÚMERO DE CAMPO Diámetro en mm de la apertura fija del diafragma. Varía entre 18 a 26,5mm
- 18. 18 IV. PROFUNDIDAD DEFOCO CAMPO Zona de la imagen que está nítida o bien enfocada, en contraste con otras zonas de menor enfoque Es la DISTANCIA por DELANTE y por DETRÁS del punto enfocado que aparece con NITIDEZ en una foto
- 19. 19 V. CONTRASTE Diferenciade absorción de luz entre el objeto y el medio. Puede aumentarse con tinciones.
- 20. 20 TIPOS DE MICROSCOPIOS Microscopio ÓPTICO Microscopio ELECTRÓNICO Microscopio ópticosimple Microscopio óptico compuesto Lupa M.O. Normal Campo oscuro Contraste de fases Fluorescencia Transmisión Barrido Digital Efecto de túnel o cuántico
- 21. 21 A.- Luz visible -Natural - Artificial Simple, óptico compuesto, de contraste de fase, de interferencia, de polarización, de campo oscuro. SEGÚN FUENTE LUMINOSA B.- Luz invisible De: rayos x, luz UV, ME
- 22. 22 MICROSCOPIO SIMPLE Laampliación es limitada y suele utilizarse para la disección de animales pequeños, o para la disociación de muestras histológicas. Pueden ser monoculares o binoculares. Constituidos por 1 solo sistema de lentes convergentes, produciendo una imagen: AUMENTADA, DERECHA y VIRTUAL situada entre la lente y el foco. LUPAS
- 23. 23 Es elmás utilizado La parte óptica consta de 2 sistemas de lentes llamados, ocular y objetivo. Producen una imagen AUMENTADA, INVERTIDA y VIRTUAL. Usa la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto. Tienen un límite máximo de resolución de 0,2 μm (determinado por la 𝝺 de la fuente de iluminación: luz visible. ÓPTICO COMPUESTO
- 24. 24 Presenta 2sistemas de lentes: objetivo y ocular, montados en extremos opuestos de un tubo cerrado. Disponen de varios objetivos para conseguir mayores aumentos Pueden aumentar la muestra por encima de las 2000 X. El objetivo recoge la luz, que atraviesa el objeto, mientras que el ocular proyecta la imagen sobre la retina. El aumento total se calcula multiplicando la magnificación (aumentos) que produce el objetivo por la que produce el ocular. Las muestras que se examinan deben ser transparentes y se observan con una luz que los atraviesa.
- 25.
- 26.
- 27. 27 MECÁNICA: • Pie • Columna- pilar • Tubo • Revolver • Platina • Tornillo macrométrico • Tornillo micrométrico • Escala graduada ÓPTICA: • Objetivos • Oculares • Aparato de Iluminación PARTES
- 28.
- 29. 29 SEGÚN NUMERO DEOCULARES Con pantalla incorporada Multioculares Tetraoculares Binoculares Monoculares
- 30. 30 MICROSCOPIO DE CAMPOOSCURO Es una modificación del microscopio de campo claro. Usa una luz intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre la muestra. El campo de visión del objetivo se encuentra en la zona hueca del cono de luz y sólo recoge la luz que se refleja en el objeto. Por ello las porciones claras de la muestra aparecen como un fondo oscuro y los objetos minúsculos que se están analizando aparecen como una luz brillante sobre el fondo negro El objeto iluminado dispersa la luz y se hace así visible contra el fondo oscuro que tiene detrás, como las partículas de polvo iluminadas por un rayo de sol que entra en una habitación cerrada Se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin pigmentar (quedan oscuras), invisibles con iluminación normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla, mientras que las superficies y partículas se ven brillantes .
- 31. 31 VENTAJAS • Permite verpartículas dipersas en un medio homogéneo. • Hace posible la observación del movimiento Browniano de las partículas. • Se puede utilizar para la observación de preparaciones sin colorear. • Visualiza los bordes destacados de las muestras.
- 32. 32 Utilizada paradetectar sustancias marcadas con FLUOROCROMOS con los que se tiñen las muestras a observar. Absorben una luz de una determinada (UV o luz monocromática azul) que excita los fluorocromos y luego emiten otra luz de una mayor (de un determinado color, verde, rojo, amarillo). Poseen un filtro especial, que permite el paso de la luz emitida por el fluorocromo. MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA: Rayo incidente partículas fluorescentes saltan Luz verde 𝝺 𝝺
- 33.
- 34. 34 Usa laluz UV, que es una radiación cuya 𝝺 va de 200 a 400 nm y en consecuencia permite un mayor poder de resolución que la luz visible (400-700 nm). La luz ultravioleta es INVISIBLE para el ojo humano, no puede ser captada por la retina y además es muy nociva; es por ello que la imagen no se observa directamente, debe visualizarse mediante fluorescencia, fotografía o un sensor digital. Todos los elementos ópticos del microscopio, láminas porta y cubre- objetos están hechos de CUARZO o FLUORITA; NO pueden ser de vidrio puesto que este material no transmite la luz UV. MICROSCOPIO DE LUZ ULTRAVIOLETA
- 35. 35 Se emplea enestudios biológicos, en ciencia forense para el análisis de ADN.
- 36. 36 MICROSCOPIO DE LUZPOLARIZADA Es un microscopio de campo claro al cual se le adicionan filtros que modifican la luz. La luz proveniente de una fuente de iluminación estándar, vibra y se propaga en todas las direcciones, pero al pasar por un filtro polarizador, las ondas y su campo eléctrico oscilan todos en un mismo plano El polarizador es un dispositivo que deja solo pasar la luz que vibra en un plano determinado que se denomina “eje de polarización”
- 37. 37 Identifica sustancias cristalinaso fibrosas intracelulares (citoesqueleto) y extracelulares (sustancia amiloide, asbesto, colágeno, cristales de uratos y otras de origen exógeno). Identificar y considerar cuantitativamente los componentes minerales APLICACIONES
- 38. 38 MICROSCOPIO DE CONTRASTEDE FASE Frits Zernike El principio es semejante al de campo oscuro; se ilumina la muestra con un cono hueco de luz pero mucho más estrecho. Se emplea un filtro en forma de anillo que disminuye la intensidad de la luz y al mismo tiempo provoca un retraso o desfase en la longitud de onda de la luz. Este método induce variaciones sutiles en el índice de refracción (determinado por el espesor) de los especímenes translúcidos permitiendo visualizar una riqueza de detalles muy finos en la estructura, los cuales pasarían desapercibidos con una iluminación de campo claro Aumenta el contraste de manera notoria entre las partes claras y oscuras de las células transparentes Los componentes celulares heterogéneos absorben la luz de diferente manera y causan pequeñas variaciones de fase en las radiaciones luminosas, es decir, las retrasan ligeramente al disminuir la velocidad a la cual viajan y el retraso varía según el tipo de estructura
- 39.
- 40. 40 Observación decélulas y tejidos vivos. En estudios de diversas disciplinas como por ejemplo fisiología, parasitología, farmacología (procesos celulares, identificación y cuantificación de microorganismos y parásitos en fluidos y tejidos, efecto de medicamentos y otras sustancias en las células y sus procesos de motilidad, ciclosis, digestión, entre otros). Estudio de alimentos y medicinas. Análisis de materiales industriales (metales, cristales, fibras sintéticas, plásticos, pigmentos, emulsiones y suspensiones minerales). Estudios geológicos (minerales). Micrografías de una neurona en campo claro (izquierda) con detalles casi invisibles y con iluminación de contraste de fases oscuro o positivo (derecha) en el que los detalles son más evidentes en un fondo claro APLICACIONES
- 41. 41 •Utiliza dos rayosde luz polarizada y las imágenes combinadas aparecen como si la célula estuviera proyectando sombras hacia un lado. •Fue diseñado para observar relieves de especímenes muy difíciles de manejar. •DIC se usa cuando el espécimen es muy grueso para usar contraste de fases Nomarski, microscopía diferencial de contraste de interferencia (DIC) Aplicaciones • Estudio de células vivas, no coloreadas. • En el estudio de especímenes un tanto gruesos que no permiten el uso de contraste de fases. • En tratamientos de fertilización in-vitro.
- 42. 42 • Obtiene imágenestridimensionales de la célula. • Se basa en un principio similar al de un microscopio de fluorescencia, pero se utilizan dos diafragmas confocales (uno antes de la muestra y otro después) capaces de enfocar la iluminación en un único punto de la muestra. • Se utiliza un láser como fuente luminosa, que va barriendo la muestra por todo su volumen, plano a plano, creando muchas imágenes bidimensionales que un ordenador interpreta, generando finalmente una imagen tridimensional. • Para observar preparaciones con este microscopio es necesario teñirlas con sustancias fluorescentes o marcarlas con sustancias conjugadas con fluorocromos, como los anticuerpos • Ilumina el espécimen punto por punto y elimina la luz proveniente de los planos no enfocados. MICROSCOPIO CONFOCAL: O MICROSCOPIO LÁSER DE BARRIDO
- 43. 43 • La luzcoherente del rayo laser es dirigida por espejos hacia el espécimen (el cual ha sido previamente tratado mediante marcadores fluorescentes) iluminándolo punto por punto y de manera seriada; • la fluorescencia resultante es medida también punto por punto. • Para obtener la información completa, el rayo laser debe ser desplazado por todo el espécimen (en los planos x, y, z) y este proceso es lo que se conoce como escaneo o barrido. • Para reconstruir las imágenes a partir de los datos obtenidos, se emplean programas de computación adecuados
- 44. 44 En comparación alos otros tipos de microscopios, el microscopio confocal proporciona un método altamente sofisticado y mejorado para obtener imágenes. En investigaciones en el campo de la biología celular y biomedicina es muy útil para medir procesos dinámicos, realizar videos para capturar secuencias en muy corto tiempo en células vivas y otras aplicaciones: • Procesos celulares: Para medir actividades enzimáticas, reacciones de oxidación, pH intracelular, fagocitosis, apoptosis, comunicaciones intercelulares. • Electrofisiología. • Estudios de ADN y ARN. • Morfología de organoides citoplasmáticos. • Cirugía y otros métodos clínicos. • Otras aplicaciones en el campo de la física, la química y en tecnología alimentaria. Aplicaciones
- 45. 45 Utilizado paraestudios ultraestructurales, tanto de muestras biológicas como de materiales. Permite resolver con mayor capacidad que cualquier otro sistema óptico, 2 puntos que se encuentran muy cercanos uno del otro. El microscopio electrónico de Transmisión (T.E.M.) consiguió aumentos de 100.000 X. En 1942 se desarrolla el microscopio electrónico de barrido (SEM) El 1er microscopio electrónico de transmisión fue desarrollado en Alemania entre 1931 y 1933 por Max Knoll y Ernst Ruska MICROSCOPIO ELECTRÓNICO
- 46. 46 ESTRUCTURA DE LACOLUMNA DE UN MICROSCOPIO CAÑÓN DE ELECTRONES: emite los ē que ATRAVIESAN o CHOCAN la muestra (dependiendo del tipo de ME), creando una imagen aumentada. LENTES MAGNÉTICAS: crea campos que dirigen y enfocan el haz de ē, ya que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios ópticos no funcionan con los ē. SISTEMA DE VACÍO: parte importante del microscopio electrónico debido a que los ē pueden ser desviados por las moléculas del aire, se debe hacer un vacío casi total en el interior de un microscopio de estas características para conseguir el flujo ininterrumpido de ē.
- 47. 47 MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DETRANSMISIÓN (TEM)
- 48. 48 MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DETRANSMISIÓN (TEM)
- 49. 49 TEM esun instrumento que aprovecha los fenómenos físico-atómicos que se producen cuando un haz de ē suficientemente acelerado colisiona con una muestra delgada convenientemente preparada. Cuando los ē colisionan con la muestra, en función de su grosor y del tipo de átomos que la forman, parte de ellos son dispersados selectivamente, algunos ē la atraviesan directamente y otros son totalmente desviados. Todos son conducidos y modulados por unas lentes para formar una imagen final sobre un dispositivo de carga acoplada (CCD) que puede tener miles de aumentos La información que se obtiene es una imagen con distintas intensidades de gris que se corresponden al grado de dispersión de los ē incidentes. Lo característico de este microscopio es el uso de una muestra ULTRAFINA y que la imagen se obtenga de los ē que atraviesan la muestra. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta 1.000.000 X.
- 50. 50 APLICACIONES Estudio delas células a nivel molecular. Observar la estructura de los virus. En anatomía patológica, para diagnosticar partiendo de la ultraestructura celular. Estudio de metales y minerales jugando un papel muy importante en la industria de la metalurgia.
- 51. 51 SISTEMAS ADICIONALES DEUN MET SISTEMA DE OBSERVACION Y REGISTRO DE IMAGENES SISTEMA DE LA FUENTE DE PODER
- 52. 52 Consiste enhacer incidir un barrido de haz de ē sobre la muestra. La muestra (salvo que ya sea conductora) está generalmente recubierta con una capa muy fina de oro o carbón, lo que le otorga propiedades conductoras. Permite la observación y caracterización superficial de materiales inorgánicos y orgánicos, entregando información morfológica del material analizado. A partir de él se producen distintos tipos de señal que se generan desde la muestra y se utilizan para examinar muchas de sus características. MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO
- 53. 53 DETECTOR DE ELECTRONESSECUNDARIOS: es el que ofrece la típica imagen en blanco y negro de la topografía de la superficie examinada. DETECTOR DE ELECTRONES RETRODISPERSADOS: también ofrece una imagen de superficie aunque de menor resolución. Su ventaja consiste en que es sensible a las variaciones en el número atómico de los elementos presentes en la superficie. Si tenemos una superficie totalmente lisa observaremos distintos tonos de gris en función de que existan varias fases con distintos elementos. DETECTOR DE RAYOS X: es el que recibe los rayos X procedentes de cada uno de los puntos de la superficie sobre los que pasa el haz de ē. Como la energía de cada rayo X es característica de cada elemento, podemos obtener información ANALÍTICA CUALITATIVA y CUANTITATIVA de áreas del tamaño que deseemos de la superficie. Al alcanzar el haz de ē la superficie de la muestra se generan partículas que son detectadas por:
- 54. 54 El ojohumano puede ver hasta 0,1 mm. El microscopio óptico, hasta 0,0002 mm. El MEB hasta ≈ 40 nm (1 nm= 10-6 mm). El ME al utilizar ē con alta energía, permite pasar de observaciones con una magnificación promedio de 2.000 X a 300.000 X. El ME posibilita también obtener una mayor profundidad de campo, lo que permite conseguir un efecto más real en 3D. En el mundo de lo más pequeño no existe el color con la 𝝺 electrónica y, por lo tanto, las imágenes aparecen en blanco y negro. COMPARACIÓN
- 55. 55 TECNICA LIMITES RESOLUCION Ojohumano Retina 2.000.000 Å (0,2 mm) MO Difracción de la luz 2.000 Å (0,0002 mm) MEB Difracción de los ē 20 Å (0,000002 mm) MET Difracción de los ē 10 Å (0,000001 mm) M Ionización de Campo Tamaño atómico 3 Å (0,0000003 mm)
- 56.
- 57.
- 58.
- 59.
- 60. 60 Glóbulo rojo Glóbuloblanco
- 61. 61 Desde laindustria petroquímica o la metalurgia hasta la medicina forense. Sus análisis proporcionan datos como textura, tamaño y forma de la muestra. •Geología •Estudio de materiales •Metalurgia •Odontología •Paleontología y Arqueología •Control de Calidad •Fibras •Peritajes •Medicina Forense •Botánica, Biomedicina y Medicina •Peritaciones Caligráficas •Electrónica APLICACIONES
- 62. 62 ESTRUCTURAS DE LACOLUMNAS DE LOS MICROSCOPIOS MO MET MEB
- 63. 63 DIFERENCIAS ME Pantalla Muestra Chorro deē Chorro de ē Muestra Muestra Monitor TRANSMISION BARRIDO
- 64. 64 ÓPTICO ELECTRÓNICO FUENTE DE ILUMINACIÓNLuz (natural/artificial) Haz de ē LENTES Cristal Electromganéticas OBSERVACIÓN DE LA MUESTRA Ocular (directa) Pantalla (indirecta) TUBO SIN vacío Al vacío RESOLUCIÓN 0,1 µm 0,001 µm MAGNIFICACIÓN 2.000 X 1.000.000 X MUESTRA Viva o muerta Muerta y deshidratada COSTO Desde $ 180.000 Desde $ 30.000.000 DIFERENCIAS MO y ME
- 65.
- 66.
- 67.
- 68. 68 A finde estudiar y comprender los tejidos, contamos con 2 poderosas herramientas que nos permiten observar la microestructura celular y tisular: la microscopía y la TÉCNICA HISTOLÓGICA. Serie de pasos ordenados a los que se somete un tejido biológico, a fin de que sea posible su estudio por medio del microscopio, posibilitando la observación de estructuras no visibles al ojo humano. TÉCNICAS HISTOLÓGICAS El tejido se prepara para su observación de acuerdo con el tipo de microscopio que será utilizado.
- 69. 69 Obtención delmaterial histológico para estudiar Fijación (formol) Lavados Deshidratación Aclaramiento Infiltración Inclusión (parafina) Microtomía Tinción Observación PASOS DE LA TÉCNICA HISTOLÓGICA
- 70. 70 Los tejidos sepueden obtener de diferentes formas: OBTENCIÓN DEL MATERIAL HISTOLÓGICO BIOPSIA: extracción de una muestra total o parcial de tejido para ser examinada al microscopio. Estrictamente, este paso no está considerado dentro de la técnica histológica; sin embargo, cualquier muestra a procesar primero debe obtenerse NECROPSIA: La muestra se obtiene de un cadáver. BIOPSIA INCISIONAL: Se obtiene una sección de la lesión. BIOPSIA EXCISIONAL: Es extraída la lesión completa.
- 71. 71 El tejidose coloca en una sustancia fijadora, generalmente líquida, para evitar los cambios postmortem y para lograr conservar la forma original del tejido. Unos de los fijadores más usado es el formol al 10% (formaldehido) FIJACIÓN Las técnicas histológicas postvitales son aquellas en las que las células mueren durante el proceso, pero las características morfológicas y moleculares que poseían en estado vivo se conservan lo mejor posible, lo que depende del tipo de técnica.
- 72. 72 Se debelavar el tejido para quitar el exceso de fijador (químico) ya que al momento de la infiltración, incluso en la microtomía, podría afectar los cortes histológicos, y por ello se debe lavar con agua destilada. La deshidratación se hace empleando diferentes soluciones de alcohol de concentración creciente. LAVADOS En este paso se sustituye el alcohol por un disolvente de parafina. El más usado es el xilol (xileno) ya que como la muestra está deshidratada, el xilol entrará hasta lo más profundo del tejido. También el tejido pierde color y adquiere un tono acaramelado. ACLARAMIENTO La muestra se coloca en parafina líquida. El tejido está completamente lleno de xilol y debido a ósmosis sale el xilol y entra la parafina. La deshidratación, aclaramiento e infiltración pueden ser realizadas manualmente pero hoy se realizan de modo automático. INFILTRACIÓN
- 73. 73 Le proporcionaal tejido un soporte sólido que posibilite realizar un corte muy fino, por lo que es de suma importancia que el medio utilizado para la inclusión penetre al interior del tejido. Se forman bloques de parafina dentro de los cuales están las muestras a estudiar. También hay máquinas especializadas para la inclusión en parafina de tejidos. Después de su inclusión y posterior secado, estos se deben poner a enfriar en un congelador para su posterior corte. INCLUSIÓN Es el proceso de realizar cortes histológicos muy delgados (0,5 a 10 µm). Los cortes se echan al baño de flotación y se pescan con un portaobjetos, se marcan con la fecha, el tipo de tejido y la tinción con que se van a procesar. Una vez realizado el corte se da un baño de agua destilada, para que la parafina se estire. Un buen corte histológico debe tener un grosor aproximado de 3-5 µm para que sea fácilmente atravesado por la luz y atraviese los poros celulares. MICROTOMÍA
- 74.
- 75. 75 Las células,por sí mismas, no poseen coloración debido a que la composición de los tejidos, salvo contadas ocasiones, no tienen contraste ni colores que permitan diferenciar sus estructuras de una manera clara mediante la observación directa con los microscopios. Por ello hay que resaltar sus estructuras para poder estudiarlas en detalle. Para poder observar la morfología tisular deben TEÑIRSE. Existen muchos tipos de tinciones para diferenciar las distintas estructuras o sustancias en los tejidos. La tinción más usada o también llamada "de rutina" es la de hematoxilina y eosina (H&E). La hematoxilina tiñe las sustancias ácidas como el núcleo (ADN). La eosina amarillenta tiñe las estructuras básicas como el citoplasma y demás orgánulos eosinofílicos de la célula. TINCIÓN Masson PAS Perls Plata metenamina Warthin-Starry Ziehl-Neelsen Van Gieson Azul alcian Sudán III Rojo Congo
- 76. 76 Algunos noconsideran la observación como un paso de la técnica histológica sino el objetivo final de la misma. Se observa el preparado al microscopio y se busca lo que se necesite ver. La técnica histológica es muy empleada en laboratorios y hospitales ya que permite hacer diagnósticos de distintas enfermedades, como para saber si un tumor es maligno o benigno, etc. OBSERVACIÓN
- 77.
- 78. 78 Punción y aspiracióncon aguja fina (PAAF). Tejidos líquidos como la sangre se obtienen por este método. Tipos de biopsias De acuerdo con el tipo de tejido que sea necesario obtener Punción y aspiración con aguja gruesa (PAAG). Se saca un cilindro de tejido de órganos profundos y poco accesibles: médula ósea roja, riñón, pulmón, hígado. próstata. Citología exfoliativa. Las células que se pueden desprender de los epitelios (como las de endocérvix y exocérvix), de cavidad oral o de alguna lesión, se obtienen a partir de un raspado o cepillado.
Notas del editor
- #4 1609 Galileo Galilei desarrolla un microscopio, este se componía únicamente de una lente convexa y una cóncava 1619Cornelius Drebbeldesarrolla el microscopio compuesto de dos lentes convexas
- #7 Los tubos o túbulos de Malpighi son un sistema excretor y osmoregulador presente en insectos, miriápodos, arácnidos y tardígrados.
- #8 En el siglo XVII un Comerciante Holandés, Anton Van Leeuwenhoek (1632-1723) describió por primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos, utilizando microscopios simples de fabricación propia.
- #9 Alrededor del año 1670, Antonie van Leeuwenhoek, un fabricante aficionado de lentes holandés, fabricó un microscopio nuevo que rápidamente se convirtió en el más importante hasta el momento. Su descubrimiento fue comunicado a la Real Sociedad y con los años van Leeuwenhoek fabricó cientos de ellos, de los cuales hoy en día aún se conservan nueve.
- #23 El microscopio óptico estándar utiliza un sistemas de dos lentes alineadas. El objeto a observar, se sitúa entre el objetivo y la superficie de la lente, lo que determina la formación de una imagen virtual; cuanto mayor sea el poder dióptrico de la lente y esta se encuentre más alejada del punto próximo de visión, alcanzará una imagen nítida sobre el objeto.
- #28 Condensador: lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación. Diafragma: regula la cantidad de luz que llega al condensador. Foco: dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
- #31 El movimiento browniano es el movimiento aleatorio que se observa en las partículas que se hallan en un medio fluido, como resultado de choques contra las moléculas de dicho fluido
- #32 Fluorescencia: Propiedad que tienen algunas sustancias de reflejar luz con mayor longitud de onda que la recibida, cuando están expuestas a ciertos rayos del espectro. La fluorescencia es un tipo particular de luminiscencia, que caracteriza a las sustancias que son capaces de absorber energía en forma de radiaciones electromagnéticas y luego emitir parte de esa energía en forma de radiación electromagnética de longitud de onda diferente.1 El espejo dicroico es un filtro diseñado para reflejar una porción determinada del espectro visible, mientras que deja pasar el resto Fluorocromos: Molécula capaz de absorber fotones y emitir fotones de menor energía (mayor longitud de onda). Fluoróforos: Parte del fluorocromo responsable de la emisión de fluorescencia Fluorocromo: Marcador colorante fluorescente empleado en investigación para crear contraste en zonas determinadas de los especímenes. Fluoróforo: Parte de una molécula (fluorocromo, proteína) que le imparte la propiedad de fluorescencia. Esquema básico de la iluminación en el microscopio de fluorescencia. La luz blanca emitida por la fuente de luz es filtrada dejando pasar por ejemplo, solo la luz azul. El espejo dicroico refleja la luz de cierta longitud de onda (en este caso azul) pero deja pasar otras. Filtra la luz azul que excita al fluorocromo (fluoresceína) pero por el contrario, deja pasar la luz verde emitida Este fenómemo se produce cuando un electrón de un átomo absorbe toda la energía de una determinada longitud de onda de la luz, saltando a orbitales de un mayor nivel energético (estado excitado). Es una situación inestable durante la cual se emite la mayor parte de la energía que se ha absorbido (con mayor longitud de onda) y vuelve a desplazarse a su orbital.
- #33 Micrografias de células en división, tomadas con un microscopio de fluorescencia. Se emplearon tres fluorocromos: DAPI (emite luz azul) para marcar cromosomas, GFP (proteína verde fluorescente intracelular que emite luz verde) y rodamina (luz roja) para marcar microtúbulos. Cada fluorocromo amerita el uso de filtros específicos, dependiendo de la longitud de onda necesaria para su excitación, señalada arriba y a la izquierda en cada imagen y expresada en nm.
- #34 Un cuarzo SiO2 es una estructura de cristal formada por sílice y oxígeno. Este mineral es el principal componente en la formación de muchas rocas. Se encuentran precisamente en el interior de cuevas y montañas en muchas formas y variedades distintas. La fluorita es un mineral del grupo III según la clasificación de Strunz, formado por la combinación de los elementos calcio y flúor, de fórmula CaF₂. Su estructura cristalina pertenece al sistema cúbico, grupo espacial Fm3m y se presenta con hábito cúbico, octaédrico y rombododecaédrico.
- #35 permite determinar la distribución de una solo especie de molécula, su cantidad y ubicación en el interior de la célula. Se pueden realizar estudios de colocalización e interacción, así como observar las concentraciones de iones y procesos inta y extracelulares como la endocitosis y exocitosis
- #36 La polarización electromagnética es una propiedad de las ondas que pueden oscilar con más de una orientación. Esto se refiere normalmente a las llamadas ondas transversales, en particular se suele hablar de las ondas electromagnéticas, aunque también se puede dar en ondas mecánicas transversales. Por otra parte, las ondas de sonido en un gas o líquido son ondas exclusivamente longitudinales en la que la oscilación va siempre en la dirección de la onda; por lo que no se habla de polarización en este tipo de ondas. Un filtro polarizador o polarizador es un material que transmite de forma selectiva una determinada dirección de oscilación del campo eléctrico de una onda electromagnética como la luz, bloqueando el resto de "planos de polarización".1 Por lo general se trata de una película polimérica a base de yodo estirada y emparedada entre dos vidrios
- #37 El asbesto, también llamado amianto, es el nombre de un grupo de minerales metamórficos fibrosos. Están compuestos de silicatos de cadena doble
- #39 A Esquema que representa parte del principio de la iluminación en contraste de fases. A representa una onda luminosa. En A’ al atravesar el objeto transparente C, la onda se retrasa con respecto a la onda A (que no ha pasado por el objeto). En consecuencia, la onda A’ está desfasada con respecto a la onda A. El ojo humano y las placas fotográficas no son sensibles a estas diferencias de fase. La onda A’’ al pasar por un medio absorbente E reduce su amplitud (la distancia entre la cresta y el valle de la onda) y al contrario de las diferencias de fase, las diferencias de amplitud si son visibles. En R se combinan ondas de igual fase y amplitud las cuales se suman y producen aumento del brillo de la imagen. En S las ondas combinadas están desfasadas y producen incremento del contraste de las sombras y zonas oscuras de la imagen. Otras combinaciones producen el contraste de los tonos de gris. B Esquema que muestra una célula sin coloración en la cual la parte con más espesor corresponde a la zona del núcleo C, el citoplasma a la zona delgada periférica B y el portaobjeto o solución acuosa circundante A. Existen diferentes índices de refracción entre A, B y C los cuales son invisibles al ojo humano. Las ondas que atraviesan una zona más espesa se retrasan y cambian de fase en relación a las ondas que atraviesan una región más delgada. El contraste de fases hace visible esas diferencias al traducirlas en cambios de intensidad (brillo).
- #42 Esquema que muestra de manera simplificada el principio del microscopio confocal y el trayecto de la luz. El rayo laser (luz azul) es filtrado por un agujero y un espejo dicroico; luego es enfocado mediante un lente objetivo sobre el espécimen y estimula la fluorescencia presente en el mismo (luz verde). La fluorescencia es recolectada por el objetivo y dirigida al espejo dicroico que la refleja y dirige hacia un detector. Un segundo filtro con agujero se coloca frente al detector y sólo deja pasar la luz proveniente del plano de enfoque (línea continua). La fluorescencia fuera de foco de las zonas que están por encima y por debajo del plano de enfoque (en líneas discontinuas) no pasa por el agujero y por lo tanto no formará parte de la imagen.
- #43 Micrografías comparativas entre las técnicas de fluorescencia con iluminación convencional o de campo amplio (serie superior, a, c, e) y la iluminación en microscopía confocal (serie inferior b, d, f). Nótese en la serie superior la cantidad de señal (fluorescencia) que está fuera de foco y la contrastante nitidez de las imágenes de la serie inferior en las cuales sólo se obtiene exclusivamente la información del plano de enfoque. Las muestras de la izquierda (hipotálamo de ratón) y centro (músculo liso de rata) fueron marcadas con diversos fluorocromos (dobles y triples marcajes). Las imágenes de la derecha corresponden a un grano de polen de girasol el cual es autofluorescente
- #49 Un dispositivo de carga acoplada (en inglés charge-coupled device, conocido también como CCD) es un circuito integrado que contiene un número determinado de condensadores enlazados o acoplados.
- #52 rayos X (o rayos Roentgen) Radiación electromagnética que atraviesa cuerpos opacos a la luz ordinaria, con mayor o menor facilidad, según sea la materia de que estos están formados, produciendo detrás de ellos y en superficies convenientemente preparadas, imágenes o impresiones, que se utilizan entre otros fines para la exploración médica. Los rayos X son una radiación electromagnética de la misma naturaleza que las ondas de radio, las ondas de microondas, los rayos infrarrojos, la luz visible, los rayos ultravioleta y los rayos gamma. La diferencia fundamental con los rayos gamma es su origen: los rayos gamma son radiaciones de origen nuclear que se producen por la desexcitación de un nucleón de un nivel excitado a otro de menor energía y en la desintegración de isótopos radiactivos, mientras que los rayos X surgen de fenómenos extranucleares, a nivel de la órbita electrónica, fundamentalmente producidos por desaceleración de electrones. La energía de los rayos X en general se encuentra entre la radiación ultravioleta y los rayos gamma producidos naturalmente. Los rayos X son una radiación ionizante porque al interactuar con la materia produce la ionización de los átomos de la misma, es decir, origina partículas con carga (iones).
- #53 Por ello se conoce esta técnica como Microanálisis por EDS. Detector de rayos X (WDS): similar al anterior, pero en vez de recibir y procesar la energía de todos los rayos X a la vez, únicamente se mide la señal que genera un solo elemento. Esto hace que esta técnica, aunque más lenta, sea mucho más sensible y precisa que la de EDS. Realmente son complementarias, pues el EDS ofrece una buena información de todos los elementos presentes en la superficie de la muestra y el WDS es capaz de resolver los picos de elementos cuyas energías de emisión estén muy cercanas, así como detectar concentraciones mucho más pequeñas de cualquier elemento y, sobre todo, de los ligeros. Detector de electrones retrodispersados difractados (BSED): en este caso sólo se reciben aquellos electrones difractados por la superficie de la muestra que cumplen la ley de Bragg en el punto que son generados, es decir, se trata de una señal que nos aporta información de la estructura cristalina de la muestra. Si conocemos previamente la o las fases cristalinas presentes en nuestra muestra, el sistema es capaz de procesar la señal que recibe en forma de “líneas de Kikuchi” y ofrecer una variada información cristalográfica: orientación de granos, orientaciones relativas entre ellos, textura, identificación de fases, evaluación de tensión, fronteras de grano, tamaño de grano…
- #55 El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar como mínimo a esa distancia.
- #64 Resolución: Capacidad de disstinguir 2 ibjetos que estan muy cerca
- #69 Fijación Consiste en interrumpir los procesos de autolisis y putrefacción que aparecen tras la muerte celular, tratando de conservar la arquitectura y composición tisular lo más próxima posible a como se encontraba en el organismo vivo dando una imagen estática del tejido. Por ello, para evitar estos procesos, el tejido debe ser colocado inmediatamente en el líquido fijador tras su extracción. Asimismo aumenta la consistencia del tejido lo que facilita el corte, mejora la captación de los colorantes (efecto mordiente) y tiene acción antiséptica. Hay diferentes agentes fijadores pero el más comúnmente utilizado para el procesado histológico es el formaldehído al 4 % (también conocido como formol), que es un tipo de fijador químico que funciona por inmersión de la muestra en la solución fijadora. La velocidad de fijación de la muestra va a depender del tamaño de la muestra y del tipo de tejido. Inclusión: Consiste en dar dureza homogénea al tejido para poder ser cortado posteriormente a una medida de micras mediante el microtomo y poder ser observado en el microscopio. Esta dureza se consigue mediante la inclusión en un medio sólido, como la parafina, que es una sustancia cérea que a temperatura ambiente es sólida. Corte histológico – Microtomía La microtomía es la técnica mediante la cual se consiguen cortes con medida de micras utilizando un microtomo. Una vez realizado el corte se coloca en el baño de flotación (35 – 45 °C) y se coge con el portaobjetos. El tiempo de la realización de los cortes va a depender del número de bloques que haya.
- #73 Parafina: Sustancia sólida, blanca, translúcida, inodora y que funde fácilmente, que se obtiene de la destilación del petróleo o de materias bituminosas naturales y se emplea para fabricar velas y para otros usos
- #74 Un microtomo (del griego mikros, que significa "pequeño", y tomo, que significa "parte" o "división") es un instrumento de corte que permite obtener rebanadas muy finas de material, conocidas como secciones. Los microtomos son un instrumento importante de la microscopía porque permiten la preparación de muestras para su observación en el microscopio óptico o en el electrónico de transmisión. Los microtomos utilizan cuchillas de acero, vidrio o diamante, dependiendo del tipo de muestra que se esté cortado en lonjas y del grosor deseado de las secciones del corte. Las cuchillas de acero se utilizan para preparar secciones de tejidos blandos animales o vegetales para estudios en el contexto de la histología o de la industria como corcho, madera balsa y otros como arcillas húmedas, gelatinas densas, poliestireno expandido para microscopía de luz. Las cuchillas de vidrio se utilizan para preparar secciones para microscopía de luz y para cortar secciones muy delgadas para microscopía electrónica. Existe una máquina especial para cortar las cuchillas de vidrio y estas tengan el tamaño, grosor y filo para poder realizar los cortes ya que son muy delicados. Las cuchillas de diamante (de grado industrial) son utilizadas para cortar materiales duros como el hueso, los dientes y materia vegetal como, maderas duras, etc, tanto para microscopía de luz como para microscopía electrónica.