El microscopio es un instrumento clave para observar objetos diminutos y es fundamental en histología para examinar células y tejidos. Existen varios tipos de microscopios, como el óptico, electrónico y confocal, cada uno con particularidades en sus sistemas de iluminación, ópticos y mecánicos que permiten distintas aplicaciones en la investigación biológica. La técnica histológica implica pasos secuenciales como fijación, deshidratación y tinción, para preparar las muestras adecuadamente para su análisis microscopico.

1. MICROSCOPIA

2. El microscopio (del griego μικρός micrós, 'pequeño', y
σκοπέω scopéo, 'mirar')​
es un instrumento que permite
observar objetos que son demasiado pequeños para ser
vistos a simple vista. el tipo más comun y el primero que se
inventó fue el microscopio óptico. Se trata de un instrumento
esencial para los estudios generales de histologia, puesto
que es el que nos permite observar las diferentes
caracteristicas morfologicas de las celulas y los tejidos. Se
basa en el uso de lentes para aumentar los rayos de luz que
atraviesan una muestra de tejido.

3. HANS Y ZACHARIAS JANSEN (1590)
HISTORIA DEL MICROSCOPIO
FILOSOFO BACON (1561-1630) MICROSCOPIUM
ANASTASIUS KIRCHER (1602-1680)
ANTHONY VAN LEEUWENHOCK (1632-1723)
1665 COMIENZAN LOS DESCUBRIMIENTOS REALIZADOS CON
EL MICROSCOPIO. ROBERT HOOKE
ERNST ABBE JAHR (1872)

4. SISTEMA DE ILUMINACIÓN
FOCO O FUENTE DE LUZ Es un elemento primordial de un microscopio ya que es
necesario para emitir luz que ilumine la muestra. Los
primeros microscopios utilizaban para ello luz natural que
dirigían hacia la muestra mediante espejos.
Posteriormente y gracias a la invención de la bombilla
incandescente se integró directamente una fuente
artificial de luz en los microscopios.
EL CONDENSADOR Ubicado inmediatamente después de la fuente de luz.
Normalmente los rayos de luz emitidos por el foco siguen
trayectorias divergentes. La función del condensador es
cambiar la dirección de estos rayos para que sigan
trayectorias convergentes o, como mínimo, paralelas. Así,
el condensador consigue enfocar la luz desde debajo de
la platina.
EL DIAFRAGMA O IRIS Es una parte del sistema de iluminación montada también
debajo la platina. Esta pieza permite regular el tamaño
del cono de luz que incide sobre la muestra.
Su apertura debe regularse en función del objetivo
utilizado para alcanzar unas condiciones de observación
óptimas.

5. SISTEMA ÓPTICO
OBJETIVO Es el conjunto de lentes que se encuentran más
cerca de la muestra y que producen la primera etapa
de aumento. El objetivo suele tener una distancia
focal muy corta. En los microscopios modernos
distintos objetivos están montados en el revólver.
Este permite seleccionar el objetivo adecuado para el
aumento deseado. El aumento del objetivo junto con
su apertura numérica suele estar estar escrito en su
parte lateral.
OCULAR Es el elemento óptico que proporciona la segunda
etapa de ampliación de imagen. El ocular amplia la
imagen que ha sido previamente aumentada
mediante el objetivo. En general, el aumento
aportado por el ocular es inferior al del objetivo. Es a
través del ocular que el usuario observa la muestra.
En función del número de oculares se puede
distinguir entre microscopios monoculares,
binoculares e incluso trinoculares. La combinación de
objetivo y ocular determina el aumento total del
microscopio.
PRISMA ÓPTICO Algunos microscopios incluyen también prismas en
su interior para corregir la dirección de la luz. Por
ejemplo, esto es imprescindible en el caso de los
microscopios binoculares, donde un prisma divide el
haz de luz proveniente del objetivo para dirigirlo hacia
dos oculares distintos.

6. SISTEMA MECÁNICO
PIE O BASE Es la pieza que se encuentra en la parte inferior del
microscopio y sobre la cual se montan el resto de
elementos. Acostumbra a ser la parte más pesante para
proporcionar suficiente equilibrio y estabilidad al
microscopio.
BRAZO constituye el esqueleto del microscopio. Es la pieza
intermedia del microscopio que conecta todas sus partes.
Principalmente conecta la superficie donde se coloca la
muestra con el ocular por donde ésta se puede observar.
Tanto las lentes del objetivo como del ocular se
encuentran también conectadas al brazo del microscopio.
PLATINA es la superfície donde se coloca la muestra que se quiere
observar. Su posición vertical con respecto a las lentes
del objetivo se puede regular mediante dos tornillos para
generar una imagen enfocada. La platina tiene un agujero
en el centro a través del cual se ilumina la muestra.
PINZAS tienen la función de mantener fija la preparación una vez
esta se ha colocado sobre la platina.

7. SISTEMA MECÁNICO
TORNILLO
MACROMETRICO
permite ajustar la posición vertical de la muestra
respecto el objetivo de forma rápida. Se utiliza para
obtener un primer enfoque que es ajustado
posteriormente mediante el tornillo micrométrico.
TORNILLO
MICROMÉTRICO
se utiliza para conseguir un enfoque más preciso de
la muestra. Mediante este tornillo se ajusta de forma
lenta y con gran precisión el desplazamiento vertical
de la platina.
REVÓLVER es una pieza giratoria donde se montan los objetivos.
Cada objetivo proporciona un aumento distinto, el
revólver permite seleccionar el más adecuado a cada
aplicación. Habitualmente el revólver permite escoger
entre tres o cuatro objetivos distintos.
TUBO es una pieza estructural unida al brazo del
microscopio que conecta el ocular con los objetivos.
Es un elemento esencial para mantener una correcta
alineación entre los elementos ópticos.

8. CLASIFICACIÓN DEL MICROSCOPIO DE ACUERDO A LA FUENTE DE LUZ
MICROSCOPIO
ÓPTICO DE LUZ
MICROSCOPIO
ELECTRONICO
MICROSCOPIO
DE EFECTO
TÚNEL
MICROSCOPIO
DE FUERZA
ATÓMICA
A su vez se
clasifican en
simples y
compuestos
De Barrido
y de
Transmisión

9. CLASIFICACIÓN DEL MICROSCOPIO ÓPTICO O DE LUZ
CAMPO
CLARO
CAMPO
OSCURO
CONTRASTE
DE FASE
CONFOCAL
DE ARRIDO
LUZ
POLARIZADA
El microscopio óptico o de luz, compuesto de campo claro es el instrumento que
utilizaremos a lo largo de este curso de histología por lo que debemos conocer en
detalle sus partes y el funcionamiento de cada una de ellas.
Simple: 1 lente
Compuestos: 2 o mas lentes

10. TIPOS DE MICROSCOPIO
MICROSCOPIO CAMPO
CLARO
* La luz se enfoca directamente sobre la preparación. Tiene
una visualización óptima contra fondos brillantes. No examina
elementos pequeños como virus.
* Se le denomina campo claro porque la luz que debe llegar
hasta los oculares debe ser totalmente neutra por lo que el
campo debe ser blanco.
* hace su aparición a principios del siglo XVII en Europa,
aunque con exactitud no se sabe quien fue su inventor.
MICROSCOPIO CAMPO
OSCURO
* Crea fondo negro mediante bloqueo de la luz central.
* Modifica la luz que sale del condensador mediante discos
especiales que impiden el paso de rayos centrales.
* La imagen microscopica esta formada solo por rayos
difractados.
* Tiene la misma resolución que el Mic. campo claro, pero
mayor contraste que permite ver partículas más paqueñas.
* El campo microscopico muestra halos brillantes alrededor
de los microorganismos contra un fondo oscuro.
* permite analizar muestras sin procesar, es decir muestras
transparentes y sin pigmentar.
* En la practica clínica se utiliza para la deteción de cristales
en la orina (oxalato o ácido úrico). y para la identificacion de
espiroqueas, en particular Treponemas pallidum (agente
causal de la sifilis)

12. Treponema pallidum
Cristales de oxalato en la orina
piel
CAMPO CLARO
CAMPOOSCURO
neutrofilos

13. MICROSCOPIO CONFOCAL * La óptica del microscopio confocal son complejos y
complementado por métodos electrónicos y de
computación, este instrumento permite enfocar únicamente
un plano determinado del espécimen, eliminando la luz
(fluorescencia) procedente de las regiones que no están en
el plano de enfoque.
* Permite la visualización de una muestra biologica en tres
dimensiones.
* se diferencia de un microscopio normal por la adición de
una apertura de detector que está en conjunción con el
punto focal de la lente: por lo tanto en confocal.
* permite estudiar muestras que por su grosor o por sus
caracteristicas no son transparente.
MICROSCOPIO DE
FLUORESCENCIA
* la fluorescencia, es la propiedad que tiene ciertos
elementos químicos denominados fluoróforos o
fluorocromos de emitir luz visible cuando sobre ellos incide
una radiación intensa.
* En general para el estudio con este método la muestra se
tiñe con una sustancia fluorescente que absorbe la energia
de las ondas cortas de la luz (azul) y emite la luz de
longitudes de ondas más largas (verde).
* Es muy util porque la molécula fluorescente, aun cuando
sea muy pequeña, puede ser observada debido a la luz que
emite. por lo cual permite alcanzar altos niveles de
sencibilidad y resolución microscopica.
Aplicaciones:
* Marcaje de moléculas en células y tejidos para su
caracterización e identificación.
* Estudios de células normales y patológicas.
* Estudios inmunologicos.

14. M. fFLUORESCENCIA M. CONFOCAL

15. celula en mitosis: cromosomas (en verde) y actina (rojo)
M. FLUORESCENCIA
M. CONFOCAL

16. TIPOS DE MICROSCOPIO
MICROSCOPIO DE LUZ
POLARIZADA
* Es un microscopio de campo claro al cual se le
añade dos filtros:
• polarizador: se coloca entre la fuente
luminosa y la muestra.
• Analizador: entre el lente objetivo y el
observador.
* Tambien se denomina microscopiopetrográfico
o metalúrgico por su uso inicial en el estudio de
minerales.
* Esta tecnica puede utilizar tanto la luz
transmitida como la luz incidente( trans-
iluminacion y epi-iluminación respectivamnete).
* Es el más efectivo en el estudio de muestras
ricas en materiales birrefrigentes.
Se fundamenta en el hecho de que las
moléculas o los conjunts de moléculas muy bien
ordenadas pueden rotar el ángulo del plano en el
que vibra la luz polarizada.
* el polarizador es un dispositivo que solo deja
pasar la luz que vibra en un plano determinado
denominado eje de polarización.

18. cristales de ácido úrico
M. LUZ POLARIZADA

19. MICROSCOPIO
ELECTRONICO
Debido a que la longitud de
onda de un haz de electrones
es 2000 veces menor que la de
un haz de luz la resolución
aumenta.
El limite de resolución que
pudiesse alcanzar es de
0.005nm pero en la práctica es
de 0.2nm, 1000 veces mayor
que la resolución del MO de
Campo Claro.
El principio del microscopio eléctronico es el siguiente:
* La fuente de luz es un filamento de tungsteno calentado que
emite electrones (cátodos).
* Los electrones son atraidos hacia el ánod.
* Una diferencia eléctronica entre el cátodo y el ánodo imparte
un voltaje de aceleración de entre 20.000 y 200.000 voltios a
los eléctrones con lo que se genera un haz.
* Este haz de eléctrones atraviesa luego una serie de lentes
electromagneticos que cumplen la misma función que las
lentes de cristal del microscopio óptico.
* Lente condensadora: forma el haz de electrones que inciden
sobre la muestra.
* Luego una vez que atraviesa la muestra el haz de eléctrones
es enfocado y aumentado por el lente objetivo.
* Finalmente es nuevamente aumentado por la lente
proyectora.
* La imagen se observa en una pantalla.
* El material para ME es procesado con las mismas etapas de
la técnica histológicas para la microscopia de luz, pero debido
al mayor poder de resolución del ME es necesario utilizar
fijadores que preserven bien los enlaces de proteina. como
ejemplos de fijadores para la ME estan el Glutaraldehido,
paraformaldehido, tetroxidos de osmio y permaganato de
potasio. estos fijadores además actuan como colorantes
electrodenso.

20. MICROSCOPIO ELECTRONICO DE
BARRIDO (SEM)
Es un instrumento muy versátil, permite la
observación y caracterización superficial de
materiales orgánicos e inorgánicos, dando
información morfológica y de composición
química rápida, eficiente y simultáneamente del
material analizado. Su versatilidad está dada en
su alta resolución (de 20 a 50 Å) y apariencia
tridimensional de las imágenes, producto de su
gran profundidad de foco.
el haz de electrones no atraviasa la muestra sino
que explora su superficie.
MICROSCOPIO ELECTRONICO DE
TRANSMISIÓN (TEM)
Permite el estudio a nivel ultraestructural de
material biológico (células y tejidos tanto
animales como vegetales). La utilización
adicional de técnicas inmunocitoquímicas, aporta
además información funcional sobre el material
sujeto a estudio.

21. HYMENOPTERA FORMICIDAE
M. E DE BARRIDO M. E DE TRANSMISIÓN

22. La imagen en un microscopio se forma por la transmisión de los rayos
provenientes de una fuente luminosa a través del objeto. Los rayos luminosos
atraviesan el diafragma, que a manera de iris, delimita el diámetro del haz
lumínico que penetra por el condensador. Este último, está formado por un
sistema de lentes convergentes que concentra y proyecta el haz lumínico sobre
el objeto a examinar, a través de la abertura de la platina. El objetivo recoge la
luz que atravesó el objeto examinado y proyecta una imagen real, invertida y
aumentada que se forma dentro del tubo y que es recogida por el ocular que es
la segunda lente, la cual forma una imagen virtual, invertida y aumentada del
objeto examinado.
FORMACIÓN DE IMAGEN EN EL MICROSCOPIO

24. •Siempre después de cada uso se debe apagar la luz, bajar la
platina al máximo y dejar colocado el objetivo más pequeño.
•Mientras no esté en uso, el microscopio debe cubrirse con
una funda plástica para evitar que la suciedad y el polvo se
acumule en él.
•Si se encuentra polvo en alguna zona de difícil acceso, se
debe retirar con una pera de plástico, pincel o accesorio
similar, nunca podemos soplar nosotros mismos.
•Debe colocarse en una mesa que tenga buena estabilidad, y
si es necesario transportarlo: se sujetará con una mano por el
brazo y apoyar la base en la otra mano.
•No forzar los tornillos.
MANTENIMIENTO DEL MICROSCOPIO

25. HISTOTECNIA

26. La técnica histológica es la serie de pasos
ordenados que permiten preparar al tejido para su
observación a través del microscopio. El tejido se
prepara para su observación de acuerdo con el
tipo de microscopio que será utilizado
TECNICA HISTOLOGICA
PASOS DE LAS TECNICAS HISTOLOGICAS
OBTENCION DE LA MUESTRA
• Biopsia. La muestra se obtiene de un individuo vivo.
• Necropsia. La muestra se obtiene de un cadáver.
• Biopsia incisional. Se obtiene una sección de la
lesión.
• Biopsia excisional. Es extraída la lesión completa.

27. FIJACIÓN
La importancia de este paso radica en que es el momento en el que se
detienen los procesos vitales de las células del tejido obtenido, se
evitan los procesos autolíticos y se estabilizan las biomoléculas de la
muestra; además, provee un poco de dureza a ésta. Con la fijación se
obtiene un elemento clave: se conservan las proteínas de la célula.
AGENTES MAS USADOS (MICROSCOPIA CAMPO CLARO):
Formaldehido al 5% y formol al 10%.
Las muestras se deshidratan con alcohol en
concentraciones crecientes. El agua abandona de
manera paulatina los tejidos y, al final de este paso, el
agua ha sido reemplazada con alcohol.
Lavado de la muestra
Se lava el tejido para quitar el exceso de fijador
(químico). El exceso de fijador podría afectar los
cortes histológicos y por ello se debe lavar con agua
destilada.
DESHIDRATACIÓN

29. ACLARAMIENTO O DIAFANIZACION
El alcohol debe ser reemplazado con un agente aclarante
(xileno, tolueno o benceno), debido a que la parafina no es
miscible en alcohol, pero sí lo es en los solventes orgánicos
como los agentes aclarantes.
INFILTRACION E INCLUSION
Son dos pasos simultáneos en los que se
emplea parafina líquida. La infiltración ocurre
cuando la parafina penetra al interior de las
células y de las estructuras tisulares; la
inclusión alude al momento en que el tejido es
embebido en la parafina, para formar un
bloque.
Una vez que la parafina se ha solidificado y tiene la
consistencia adecuada, entonces el tejido está listo para
cortarse. Las rebanadas de tejido que se deben obtener para
que la muestra permita el paso de la luz del sistema óptico del
microscopio deben tener en promedio un espesor de 5-10
micrómetros. Los cortes se obtienen con el micrótomo, que es
el instrumento que permite obtener estas rebanadas tan
delgadas
CORTE O MICROTOMIA

30. DESPARAFINACIÓN
Los cortes deben ser desparafinizados, ya que los
colorantes no son miscibles en la parafina y sería imposible
teñirlos, por lo que es preciso realizar el proceso inverso: se
emplean agentes aclarantes para que reemplacen a la
parafina. Tales agentes confieren también transparencia al
corte.
Ahora en el corte los espacios están
ocupados por agentes aclarantes, los
cuales deben ser reemplazados por
alcohol y al final con agua. En este
proceso el corte se somete a la
rehidratación mediante la inmersión en
alcohol en concentración decreciente.
REHIDRATACION

31. TINCION
Los cortes pueden ser coloreados con tinciones
monocrómicas, bicrómicas o tricrómicas.
Azul de toluidina. Con esta tinción se observa la
muestra en diferentes tonos de azul.
Azul del metileno.
TINCION MONOCROMICA
TINCION BICROMICA
Hematoxilina-eosina. Es la más utilizada —por ello recibe
también el nombre de “tinción convencional”— y ayuda a
identificar los componentes ácidos (basófilos) y los básicos
(acidófilos) de las muestras. Se emplean dos colorantes
(hematoxilina y eosina) por lo que también se le conoce
como H-E o H y E.
Componente Ejemplos Colorante
que captan
Color que
exhiben
Término
Ácido DNA,RNA Hematoxilina Azul-morado Basófilo
Básico Proteínas Eosina Rosa-naranja
Eosinófilo o
acidófilo
COMPONENTES TISULARES Y COLORES QUE MUESTRAN
CON LA TINCION HEMATOXILINA Y EOSINA

32. TINCION
Los cortes pueden ser coloreados con tinciones
monocrómicas, bicrómicas o tricrómicas.
Masson, Gallego y Gomori. En las tinciones tricrómicas se
emplean tres colorantes. Las tinciones tricrómicas utilizadas
con mayor frecuencia son: Masson, Gallego y Gomori, las
cuales ayudan a diferenciar entre tejidos básicos
(epitelial, conjuntivo y muscular)
TINCION TRICRÓMICA
Tinción Músculo
Tejido
conjuntivo
(colágena)
Núcleo
Masson Rojo Azul rey Negro
Gallego Amarillo Verde Rojo
Gomori Rojo
Verde
brillante Negro
TINCIONES TRICRÓMICAS Y LOS COLORES QUE EXHIBEN LOS
COMPONENTES TISULARES.