1. Protocolo - determinación de nutrientes por métodos colorimetricos.
F. Linares, Ph.D. Introducción
microphytobenthos@
gmail.com
En lo que respecta a mediciones en el campo de la biología, en primera instancia vamos a decir
que existen dos grandes categorías de métodos que podemos utilizar para hacer mediciones de
concentraciones en ecosistemas (acuáticos y/o terrestres): métodos que se basan en principios o
reacciones químicas propiamente (e.g. concentración de oxigeno por el método de Winkler), y
los métodos que utilizan estas reacciones para estimar los procesos biológicos que llevan a cabo
los organismos (e.g. desnitrificación, respiración, fotosíntesis, etc.). El primer tipo de métodos
comprende a todos aquellos métodos analíticos que se encargan de medir concentraciones de
compuestos, moléculas o gases utilizando reacciones químicas (e.g. redox) que se pueden
presentar entre elementos. Lo importante a considerar aquí es que estas reacciones no
necesariamente ocurren de forma natural en los ecosistemas, sino que son reacciones que
químicamente pueden suceder y que utilizamos para hacer mediciones. Por ejemplo, podemos
medir la concentración de nitrógeno en el agua utilizando métodos analíticos. Dicho método
utiliza reactivos para colorar el nitrógeno, el cual posteriormente es analizado con un
espectrofotómetro. Aunque este método es muy común y muy usado a nivel mundial, no
representa un proceso que ocurra de forma natural en un ecosistema.
Ahora, como mencionamos, por otro lado tenemos a los métodos que utilizan estas reacciones
para estimar los procesos biológicos que llevan a cabo los organismos. El principio de estos
métodos básicamente es el de medir la concentración de los nutrientes, moléculas o compuestos
de alguna forma determinada (i.e. métodos analíticos), y utilizar estos datos para hacer
estimaciones de procesos específicos. Retomando el ejemplo anterior, podemos utilizar el
método analítico para calcular la concentración de nitrógeno en el agua, y posteriormente
utilizar estos datos para estimar el reciclaje de nutrientes en el ecosistema en cuestión.
Este concepto de utilizar métodos analíticos para estimar procesos biológicos no se limita
solamente al nitrógeno. Podemos aplicar este concepto básicamente a cualquiera de los macro o
micro-nutrientes que existen. Por ejemplo, podemos encontrar un método analítico que nos
permita medir concentraciones de nitrato (NO3) y amonio (NH4) en el suelo. Con estos valores
podemos estimar el grado de amonificación y nitrificación del suelo en el ecosistema.
Así, podemos decir que existen métodos analíticos que miden directamente la concentración de
estos elementos, y que van a haber métodos que utilizan estos datos para estimar procesos
biológicos. Los primeros miden concentraciones, los segundos estiman concentraciones. Es
importante hacer esta distinción ya que no es lo mismo el medir que el estimar concentraciones
de nutrientes minerales. La medición como su nombre lo implica se refiere a un calculo directo y
real de la concentración utilizando métodos analíticos, mientras que la estimación, también
como su nombre lo implica, se refiere simplemente a la determinación (o estimación) de
concentraciones utilizando relaciones, interpolaciones o extrapolaciones.
Este protocolo especifica tres métodos analíticos que nos permiten calcular la concentración de
NO3, NO2 (i.e. nitrito), NH4 y nitrógeno orgánico disuelto (i.e. DON).
Parte 1: descripción de los metodos.
Determinación de nitrógeno oxidado
El nitrógeno se puede encontrar de forma oxidada formando iones de nitrito (NO2) y nitrato
(NO3). Aunque estos iones son nutrientes minerales, altas concentraciones pueden ser
problemáticas. Por ejemplo, altas concentraciones de NO3 contribuyen a que se presente el
fenómeno de la eutroficación en cuerpos de agua. También, el NO3 en altas concentraciones
puede ser tóxico para los seres humanos, particularmente para los recién nacidos.
Universidad Autónoma Metropolitana - Unidad Xochimilco
División de Ciencias Biológicas y de la Salud - Licenciatura en Biología

2. Ahora bien, en ecosistemas las bacterias descomponen a la materia orgánica para formar, entre
otras cosas, amoniaco (NH3). Después de esto, otro tipo de bacterias utilizan al NH3 para
oxidarlo el NO2 y después en NO3. Las concentraciones de NO2 tienden a ser bajas, ya que el
NO2 es rápidamente oxidado a NO3 por las bacterias. Ahora, lo que hay que recordar aquí es
que la oxidación de NH3 puede causar problemas severos de disponibilidad de oxigeno en el
ecosistema.
Bien, considerando esto podemos entonces darnos cuenta que la determinación de NO3 es
importante cuando se realizan estudios ecológicos. Existen básicamente tres métodos que se
pueden utilizar para determinar la concentración de nitrógeno oxidado (i.e. NO2 y NO3): (1) el
método de la reducción del cadmio (Cd) (para NO2 y NO3); (2) el método espectrofotometrico
(para NO2 y NO3); y (3) el método de electrodos selectivos.
El método del Cd es uno de los métodos mas usados y mas comunes, sobre todo cuando se
quieren hacer muestreos a gran escala. El principio básico del método es el siguiente: se utiliza
Cd para reducir al NO3 a NO2. Este NO2 reacciona con un compuesto para formar un color. Este
color se mide a 543 nm usando un detector. La ventaja que tiene este método es que en la misma
muestra puedes medir tanto el NO3 reducido, como el NO2 que originalmente estaba presente
en la muestra. Sin embargo, sin la reducción realizada por el Cd, solamente se puede medir el
NO2. El rango típico de concentraciones que se pueden medir por este método varia de 0.01 a 1
mg L-1 de NO3.
El método espectrofotometrico es también un método colorimetrico que utiliza distintos
reactivos para darle una coloración al NO2 y al NO3, los cuales pueden ser después medidos
utilizando un espectrofotómetro. En estos métodos es necesario hacer una curva de calibración,
utilizando una solución patrón, la cual nos va a permitir relacionar la absorbancia medida en
nuestra muestra con la concentración del N en la misma. Para el NO3 se utiliza saliciclato sódico
(5%), lo cual forma p-nitrosaliciclato sódico, el cual tiene una coloración amarilla. El limite de
detección de este método es de 0.02 a 10 mg L-1. Para el NO2 se utiliza sulfanilamida en medio
acido para formar un compuesto diazoico. Este compuesto diazoico entonces reacciona con N-
naftil-etilenamida para formar el colorante. Ahora, el NO3 absorbe a 420 nm, mientras que el
NO2 absorbe a 543 nm.
Determinación de amonio
Ademas del N oxidado, también se puede determinar al N que se encuentra en forma de
amonio (NH4). Este también es un método espectrofotometrico que utiliza el color producido
por una reacción para determinar la concentración del NH4. El NH4 en presencia de sulfato
manganoso, con adición de fenato y una solución oxidante da un color azul. Esta coloración
aparece después de un lapso de tiempo (e.g. 30 minutos), y puede ser medida con un
espectrofotómetro a una longitud de onda de 630 nm.
Determinación de nitrógeno orgánico disuelto (DON)
El principio de este método, descrito por Valderrama (1981)1 es que el DON presente en el agua
es oxidado a NO3 por el persulfato de potasio (K2S2O8). Esta oxidación usualmente se lleva a
1Valderrama, J. C. (1981). "The simultaneous analysis of total nitrogen and total
phosphorus in natural waters." Marine Chemistry(10): 109-122.
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3. cabo en una autoclave, aunque este método ha sido modificado por Bronk et al. (2000) 2 para
permitir que la oxidación se lleve a cabo por ebullición. Una vez que las muestras han sido
oxidadas, el NO3 es reducido a NO2 utilizando un reductor de Cd, y entonces se analiza el NO2
como en el método que acabamos de mencionar. Este tipo de análisis se puede hacer utilizando
un auto-analizador.
Ahora, en este método comúnmente se utiliza una solución buffer de imidazol, la cual elimina la
interferencia con metales. La longitud de onda a la cual se analiza la muestra es de 520 nm.
Hay un riesgo de contaminación con el aire y el nitrógeno presente. Por esto, se recomienda
guardar todas las muestras y las soluciones en frascos o tubos con rosca. También, y de forma
general para los métodos colorimetricos que utilizan el espectrofotometro, existe un riesgo de
contaminación que se puede dar si las botellas contienen aminas aromáticas, cobre, yodo o
substancias humicas. Adicionalmente, si la muestra esta turbia, la absorbancia medida va a ser
mayor, lo cual significa que en dado caso hay que centrifugar la muestra antes de hacer el
análisis. Los iones de cloro, especialmente en el agua de mar, también pueden interrumpir el
análisis de DON cuando su concentración excede los 10 µmol L-1. En dado caso se deben
preparar soluciones patrón utilizando agua de mar artificial que tenga la misma salinidad que la
muestra.
Ahora, la solución oxidante que se utiliza en el método de la determinación de DON se prepara
de la siguiente forma: en 1 Lt de agua des-ionizada se disuelven 50 g de persulfato de potasio, 30
g de acido bórico y 14 g de hidróxido de sodio. También se pueden preparar soluciones estándar
de calibración, al disolver 0.45 g de glicina en 100 mL de agua des-ionizada, o 0.24 mL de urea
en 100 mL de agua des-ionizada.
La metodología es la siguiente, en tubos de cristal de colectan 10 mL de muestra de agua, a estos
se les añaden 1.44 mL de la solución oxidante (i.e. 0.14 µL por cada 1 mL de muestra. Se cierran
los tubos de cristal y se meten a la autoclave por 45 minutos, o se ponen a ebullir durante 1 hr.
En cualquiera de los casos, la tasa de recuperación excede el 95%. Después de esto, se dejan
enfriar los tubos y después se pueden analizar utilizando el método espectrofotometrico que
describimos anteriormente.
Parte 2: procedimientos analíticos.
Determinación de NO3 - método del salicilato sódico
Reactivos:
1. Solución de salicilato sódico al 5% (preparada cada 24 h).
2. Acido sulfúrico concentrado.
3. Solución de NaOH (400 g) y tartrato doble de sodio y potasio (60 g) en 1 L de agua destilada.
4. Solución patrón primaria de KNO3 (0.722 g secados a 105 °C) en 1 L de agua destilada.
5. Solución patrón secundaria diluyendo 50 mL de la solución patrón 1 en 1 L de agua destilada.
Curva de calibración:
1. Se utilizan ocho tubos de cristal para la curva de calibración.
2. El primer tubo es el blanco, el cual no contiene la solución patrón.
3. En los siguientes tubos se hacen una serie de diluciones según la tabla 1.
2 Bronk, D. A., M. W. Lomas, P. M. Glibert, K. J. Schukert and M. P. Sandersson (2000).
"Total dissolved nitrogen analysis: comparisons between the persulfate, UV and high
temperature oxidation methods." Mar. Chem. 69: 163-178.
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4. Reactivo Blanco I II III IV V VI VII
Sol. patron secundaria 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
H2O destilada 10 9.5 9 8.5 8 7.5 7 6.5
Sol. salicilato sódico 1 1 1 1 1 1 1 1
Procedimiento:
1. Se ponen 50 mL de la muestra en un matraz de 250 mL.
2. Se añade 1 mL de la solución de salicilato sódico.
3. Se pone el matraz en un horno y se deja evaporar la muestra a 105 °C (esto tarda varias horas).
4. Se añade 1 mL de acido sulfúrico concentrado.
5. Se esperan 10 minutos, agitando el matraz un poco con cuidado.
6. Una vez que el matraz este frío, se añaden 50 mL de agua destilada.
7. Se añaden 7 mL de la solución de NaOH y tartrato doble de sodio y potasio.
8. Se esperan 10 minutos (se debe presentar una coloración amarilla).
9. Se realiza la medición a 420 nm.
Determinación de NO2 - método de la reacción de Griess
Reactivos:
1. Solución de sulfanilamida. Diluir 50 mL de HCl concentrado en 300 mL de agua desionizada. Disolver
5 g de sulfanilamida en esta solución. Aforar a 500 mL.
2. Solución de N–naftil etilenodiamina. Disolver 0.5 g de diclorhidrato de N–(1–naftil)–etilenodiamina en
500 mL de agua desionizada. Conservar en un lugar frío y lejos de la luz.
3. Solución patrón primaria. Secar a 110 °C durante dos horas 0.345 g de nitrito de sodio anhídro
(NaNO2). Disolver en 1 L de agua desionizada. Añadir 1 mL de cloroformo. Guardar en un frasco de
color ámbar. Conservar en frío y en la oscuridad. 1 mL de esta solución contiene 5 µmol de NO2 l-1.
4. Solución patrón secundaria. Diluir 100 veces la solución patrón primaria. 1 mL contiene 0.05 µmol de
NO2 l-1.
Curva de calibración:
1. Se utilizan 5 matraces de cristal para la curva de calibración.
2. El primer tubo es el blanco, el cual no contiene la solución patrón.
3. En los siguientes tubos se hacen una serie de diluciones según la tabla 1.
Reactivo Blanco I II III IV V VI VII
Sol. patron secundaria 0 1 2 5 10
H2O desionizada 500 499 498 495 490
Conc. (µmol l-1) 0 0.1 0.2 0.5 1
Procedimiento:
1. Se ponen 50 mL de la muestra en un matraz de 250 mL.
2. Se añade 1 mL de la solución de sulfanilamida y se mezcla con cuidado.
3. Se esperan 8 minutos.
4. Se añade 1 mL de la solución de N–naftil etilenodiamina y se mezcla con cuidado.
5. Se esperan 10 minutos como mínimo, o 2 h como máximo.
6. Se debe presentar una coloración rosa.
7. Se realiza la medición a 543 nm.
Determinación de NH4 - método de el sulfato manganoso
Reactivos:
1. Solución oxidante. Se utiliza blanqueador casero que contenga 5% de cloro y en perfectas
condiciones. Se mezclan 20 mL del blanqueador con 80 mL de agua desionizada. Se ajusta el pH a
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5. 6.5–7.0 con una solución de 1 parte de de HCl por tres partes de agua destilada (1:3). Esta solución
dura 4 días.
2. Solución de fenato. En 100 mL de agua desionizada se disuelven 2.5 g de NaOH y 10.0 g de fenol.
Esta solución dura 4 días y debe ser mantenida en un refrigerador.
3. Solución de sulfato manganoso. Se disuelven 50 mg de MnSO4.2H2O en 100 mL de agua
desionizada.
4. Solución patrón primaria. En 500 mL de agua desionizada se disuelven 1.9079 g de NH4Cl. Esta
solución contiene 1000 mg de NH4 l-1. Esta solución puede ser guardada.
5. Solución patrón secundaria. Se toman 5 mL de la solución patrón primaria y se afora a 500 mL con
agua desionizada. Esta solución contiene 10 mg de NH4 l-1. Esta solución se tiene que preparar diario.
6. Solución patrón terciaria. Se toman 15 mL de la solución patrón secundaria y se afora a 500 mL con
agua desionizada. Esta solución contiene 0.30 mg de NH4 l-1. Esta solución se tiene que preparar
diario.
Procedimiento:
1. Se ponen 10 mL de la muestra en un matraz de 50 mL.
2. Agitar con una barra magnética.
3. Agregar 1 gota de la solución de sulfato manganoso, 0.5 mL de la solución oxidante y 0.6 mL de la
solución de fenato.
4. Poner el matraz en la oscuridad y esperar 30 minutos.
5. Se debe de presentar una coloración azul.
6. Se realiza la medición a 630 nm.
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