Este documento estudia la interferencia causada por la hemoglobina en diferentes pruebas de laboratorio como el colesterol, bilirrubina total, proteínas totales, glucosa y las enzimas alanina aminotransferasa y colinesterasa. Los resultados muestran que la hemoglobina causa interferencia independiente de la concentración del analito en las pruebas de colesterol, bilirrubina total, proteínas totales y alanina aminotransferasa. La hemoglobina también interfiere con la prueba de glucosa a través de una combinación con la

1. 18 Vol.XV,Nº3,2003
Interferencia de la hemoglobina en pruebas de
laboratorio
O. Fong Lores* , H. Morris Quevedo**, M. Colón Suárez*, C. Berenguer Rivas*
*Centro de Toxicología y Biomedicina, Santiago de Cuba, **Centro de Estudios de Biotecnología Industrial
(CEBI), Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Oriente
Resumen
En la presente investigación, aplicándose el modelo estadístico de Kroll et al., se realizó el estudio
de la interferencia causada por la hemoglobina con diferentes métodos analíticos empleados en la
determinacióndecolesterol,bilirrubinatotal,proteínastotales,glucosayactividadenzimáticadelaalanina
aminotransferasa y colinesterasa. Se demostró que la hemoglobina causa interferencia independiente de
la concentración de analito para colesterol, proteínas totales, bilirrubina total y en la actividad enzimática
de la TGP, interfiere con glucosa por combinación de ambas y no produce interferencia en la actividad
enzimática de la colinesterasa.
Palabras clave: interferencia, hemoglobina, química clínica.
Abstract
In the present research, we applied the statistical model of Kroll et al. for assessing interference of
hemoglobinwiththedeterminationofcholesterol,totalbilirubin,totalproteins,glucoseandtheenzymatic
activity of alanin aminotransferase and cholinesterase. The hemoglobin interferes with determination of
cholesterol, total bilirubin, total proteins and alanin aminotransferase independent on the analyte
concentration, interferes with glucose by a combination of both and do not produce interference with
cholineterase activity.
Key words: interference, hemoglobin, clinical chemistry.
?
n
n
n Introducción
Al laboratorio clínico concurren diferentes
disciplinas médicas y no médicas, que en su conjunto
forman una ciencia, la ciencia de obtener datos
cualitativos y cuantitativos, y el arte de interpretarlos,
para establecer el diagnóstico y guiar el tratamiento.
Deestaforma,ellaboratorioproporcionadatosacerca
de las muestras biológicas, ayuda a la prevención, el
diagnóstico y el tratamiento de las enfermedades
humanas, y de ahí la gran importancia de la Química
Clínica/1/.
En los fluidos biológicos, el material de análisis
presenta una matriz compleja e indefinida; pudiendo
estar presentes muchos compuestos endógenos y/o
exógenos que pueden constituir, sin lugar a duda,
interferencias, las cuales son fundamentalmente
causantes de un diagnóstico clínico errado /2, 3/.
Con relación al tema de las interferencias, en la
pasadadécadafueronrealizados numerososestudios;
sin embargo, dichos estudios solamente indicaban la
magnitud, pero no el tipo. No fue hasta 1987 que
Martin H. Kroll y colaboradores proporcionaron un

2. 19Vol. XV, Nº 3, 2003
modelo de interferencias, que no sólo permitió
determinar la magnitud, sino que dio la posibilidad
de determinar qué tipo de interferencia estaba
afectando el análisis.
Teniendo en cuenta que una interferencia es
independiente de la concentración de analito cuando
el interferente o el producto de la reacción del
interferente con uno de los reactivos, puede
absorber a la longitud de onda de la reacción y
dependiente cuando el interferente puede
reaccionar directamente con el analito o interferir
en la reacción química produciendo cambios en la
concentración de este, existen 3 tipos de
interferencia /4/.
1- Independiente de la concentración de analito.
2- Dependiente de la concentración de analito.
3- El producto de ambas.
Su diseño experimental es una matriz ortogonal
con incrementos en la concentración de analito e
incrementos en la concentración de interferente. Está
basado sobre una regresión múltiple a tres variables
independientes:
(A) concentración del analito
(I) concentración del interferente
(A-I) interacción analito-interferente.
Como resultado de estas regresiones, se obtiene la
siguiente expresión matemática:
F(A,I)= b0
+ b1
A + b2
I + b3
A-I
El coeficiente β0
representa el intercepto de la
regresión múltiple, y usualmente debe estar cercano
a cero. El coeficiente β1
indica si el método es o no
válido para dicho analito, y debe estar cercano a la
unidad. Los coeficientes β2
y β3
representan la
interferencia independiente y dependiente de la
concentración de analito, respectivamente.
n
0
1,95
3,9
5,85
7,8
0
1,83
2,895
4,53
5,43
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
Interferencia
Hb (g/L)
Colesterol (mmol/L)
Fig.1:Representacióndesuperficiedelainterferenciadelahemoglobinaconelmétododedeterminación
decolesterol.

3. 20 Vol.XV,Nº3,2003
El valor de cada uno de estos coeficientes está
relacionado con la magnitud de la interferencia y su
signo con la dirección, ya sea positiva o negativa.
Si no existe interferencia (I= 0), los dos últimos
términos de la expresión quedarían anulados,
obteniéndose la ecuación de una línea recta para la
concentración de analito.
Además, se obtienen los errores estándares para
cada uno de los coeficientes, los valores de la prueba
t, que se calcula como el valor absoluto del coeficiente
β/error estándar, la probabilidad, que se calcula por
una tabla t-distribución estándar y no es más que la
n
probabilidad de que el coeficiente no sea
significativamente diferente de cero. Para una
probabilidad menor de 0,05 se considera que la
diferencia es significativamente distinta de cero /5/
.
En el presente trabajo, aplicando este modelo,
nos propusimos investigar la hemoglobina como
posible interferente en las determinaciones de
bilirrubinatotal,colesterol,glucosa,proteínastotales,
colinesterasa y alanin aminotransferasa, así como
clasificar el tipo de interferencia causada y la
magnitud de los casos donde exista la misma.
Variable Coeficiente
Valor del
coeficiente
Error
Standard
t (21) Nivel p
Intercepto β0 0,0531
Colesterol β1 1,0503 0,1087 9,6609 3,5322 · 10-9
Hemoglobina β2 2,2533 0,0799 28,1727 3,6194 · 10-18
Colesterol · Hemoglobina β3 0,0124 0,0227 0,5489 0,5888
TABLA1.ANÁLISISDELOSCOEFICIENTESDEREGRESIÓNMÚLTIPLESRESULTANTESDELA
INTERFERENCIADELAHEMOGLOBINACON COLESTEROL.(R2
=0,9931)
n
Métodos experimentales
Materiales
Las determinaciones analíticas se realizaron con
juegos de reactivos suministrados por QUIMEFA,
utilizando un espectrofotómetro ERMA. El material
biológico empleado fue suero humano liofilizado
Precinorm U, y como interferente patrón de
hemoglobina, ambos de la firma comercial ROCHE.
Diseño experimental
Se estudió la interferencia de la hemoglobina en
seis métodos analíticos diferentes: bilirrubina total,
determinada por el método de Jendrassik Grof;
colesterol determinado por el método enzimático
ColesterolOxidasa;glucosadeterminadaporelmétodo
de enzimático Glucosa Oxidasa; proteínas totales
determinadas por el método de Biuret, y las enzimas
colinesterasa determinada por el método de De La
Huerga y alanin aminotransferasa determinada por el
método de Frankel y Reitman /6/. Para cada método,
se prepararon series de sueros controles de cinco
concentraciones diferentes de analitos, y en el caso de
las enzimas tres actividades enzimáticas:
Bilirrubinatotal:0;0,14;0,28;0,42y0,55mg/100mL
Colesterol: 0; 1,8; 2,9; 4,5 y 5,4 mmol/L
Glucosa: 0; 4,6; 5,8; 7,6 y 10,4 mmol/L
Proteínas totales: 0; 4,8; 11,3; 15,0 y 20,0 g/L
Colinesterasa: 0; 1,7 y 2,7 U/L
Alanin aminotransferasa: 0; 1,6 y 3,3 U/L

4. 21Vol. XV, Nº 3, 2003
Para cada miembro de cada serie, se adicionaron
cantidades diferentes de hemoglobina para
concentraciones finales de 0; 1,6; 3,3; 4,9 y 6,5 g/
L de interferente. Es decir, para cada método
analítico se prepararon 25 muestras diferentes,
logrando conformar una matriz de cinco
concentraciones de analito y cinco concentraciones
de hemoglobina.
En el caso de las enzimas, se adicionaron tres
concentraciones de hemoglobina (0; 1,6 y 3,3 g/L)
conformando una matriz de 3 · 3. A continuación se
determinó la concentración del analito en cada
muestra y se procedió al análisis estadístico.
Análisisestadístico
En cada caso, se determinó el valor de los
coeficientes β0
, β1
, β2
y β3
, el error estándar y el t-
valor mediante el programa Statistica 4.3 y Microsoft
Excel XP para Windows. La magnitud de la
interferencia se determinó mediante las siguientes
fórmulas /5/.
1. Interferencia independiente de analito:
I= β2
· Concentración de Interferente
2. Interferencia dependiente de analito:
I= β3
· Concentración de Interferente ·
Concentración de analito.
3. Interferencia por combinación de ambas:
I= β2
· Concentración de Interferente + [β3
·
Concentración de Interferente · Concentración de
analito]
Variable Coeficiente
Valor del
coeficiente
Error
standard
t (21) Nivel p
Intercepto β0 -0,0277
Bilirrubina total β1 1,0364 0,0367 11,9433 7,2395 . 10-5
Hemoglobina β2 0,4795 0,0144 33,1702 4,881 . 10-7
Bilirrubina . Hemoglobina β3 -0,0465 0,0344 -1,3505 0,2347
TABLA2.ANÁLISISDELOSCOEFICIENTESDEREGRESIÓNMÚLTIPLERESULTANTESDELA
INTERFERENCIADELAHEMOGLOBINACONBILIRRUBINATOTAL(R2
=0,9985)
Variable Coeficiente
Valor del
coeficiente
Error
standard
t (21) Nivel p
Intercepto β0 -0,4922
Proteínas totales β1 0,9901 0,1829 5,4406 2,1339 . 10-5
Hemoglobina β2 8,0631 0,4778 18,8666 1,0808 . 10-14
Proteínas . Hemoglobina β3 0,0435 0,0379 1,1466 0,2644
TABLA3.ANÁLISISDELOSCOEFICIENTESDEREGRESIÓNMÚLTIPLE,RESULTANTESDELA
INTERFERENCIADELAHEMOGLOBINACONPROTEÍNASTOTALES(R2
=0,9846)

5. 22 Vol.XV,Nº3,2003
Resultados y discusión
Al evaluar la interferencia de la hemoglobina en
el ensayo de determinación de bilirrubina total,
colesterol, glucosa, proteínas totales, colinesterasa
y piruvato aminotransferasa, mediante el modelo
propuesto por Kroll (tabla 1) se obtuvo que en los
parámetros bilirrubina total, colesterol, proteínas
totales y alanin aminotransferasa los coeficientes
β1
y β2
resultaron ser significativamente diferentes
de cero (p<0,05), esto nos indica una interferencia
independiente de analito.
Variable Coeficiente
Valor del
coeficiente
Error
standard
t (21) Nivel p
Intercepto β0 0,1462
Glucosa β1 0,9602 0,0747 12,8387 2,0741 . 10-11
Hemoglobina β2 1,5692 0,1043 15,0360 1,0272 . 10-12
Glucosa . Hemoglobina β3 -0,0418 0,0156 -2,6628 0,0145
TABLA4.ANÁLISISDELOSCOEFICIENTESDEREGRESIÓNMÚLTIPLE,RESULTANTESDELA
INTERFERENCIAPORHEMOGLOBINACONGLUCOSA(R2
=0,9784)
El valor positivo de los coeficientes β2
nos
indica, en cada caso, que estas interferencias
actúan elevando el valor real de concentración del
analito. El valor de β1
en cada caso es cercano a
la unidad, por lo que puede decirse que este método
es válido para la evaluación de estas técnicas
analíticas. En cada uno de estos casos, la
interferencia está dada por la absorción de la
hemoglobina en el mismo rango de longitudes de
onda utilizados en la lectura de los métodos
colorimétricos empleados /7-9/.
0
1,95
3,9
5,85
7,8
0
4,6
5,8
7,6
10,4
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
Interferencia
Hb (g/L)
Glucosa (mmol/L)
Fig.2:Representacióndesuperficiedelainterferenciadelahemoglobinaconelmétododedeterminación
deglucosa.
n

6. 23Vol. XV, Nº 3, 2003
Variable Coeficiente
Valor del
coeficiente
Error
standard
t (21) Nivel p
Intercepto β0 0,6630
TGP β1 0,7826 0,3442 2,2736 0,0421
Hemoglobina β2 5,4421 0,4844 11,2340 9,7599 . 10-5
TGP . Hemoglobina β3 0,0323 0,1367 0,2362 0,8225
TABLA5.ANÁLISISDELOSCOEFICIENTESDEREGRESIÓNMÚLTIPLE,RESULTANTESDELA
INTERFERENCIAPORHEMOGLOBINACONALAT(R2
=0,9376)
Al analizar la representación gráfica del
comportamiento de la interferencia analizada para
cada uno de estos casos, se puede observar que la
respuesta dada por la hemoglobina, quedó en forma
de una superficie plana y un frente trapezoidal,
indicando la relación entre la concentración
interferente y la magnitud de la interferencia. Esta
superficie plana es la que indica que la interferencia
es independiente de la concentración del analito,
mientras que la inclinación hacia la izquierda indicó
que la misma fue, para cada caso, positiva.
0
1,95
3,9
5,85
7,8
0
0,14
0,28
0,42
0,55
-10
-5
0
5
10
15
Interferencia
Hb (g/L)
Bilirrubina
(mg/100 mL)
Figura3.Representacióndesuperficiedelainterferenciadelahemoglobinaconelmétododedeterminaciónde
bilirrubina.
En el caso de la glucosa, el análisis estadístico
demostróquelostrescoeficientesβ1
,β2
yβ3
resultaron
ser significativamente diferente de cero (p<0,05), lo
cual nos indica que el modelo es válido para la
determinación de interferencia, presentando ésta un
comportamiento mixto, dependiente e independiente
de la concentración de glucosa; los coeficientes β2
y
β3
tienen direcciones opuestas, siendo la interferencia
dependiente de analito mucho menor y con signo
negativo, y la interferencia independiente de analito
mucho más significativa, con signo positivo /10/.

7. 24 Vol.XV,Nº3,2003
En este caso en particular, no sólo se produce una
interferencia por absorción de la hemoglobina en el
mismo rango de longitudes de onda que el complejo
coloreado; sino, además, por la interacción de ésta
con algún reactivo o intermediario formado en la
reacción enzimática: glucosa oxidasa-peroxidasa
/11/.
Se ha descrito, que el peróxido de hidrógeno
(H2
O2
) es capaz de unirse a las hemoproteínas,
0
1,95
3,9
5,85
7,8
0
4,814
11,296
15
20
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
Interferencia
Hb (g/L)
Proteínas (g/L)
Fig.4:Representacióndesuperficiedelainterferenciadelahemoglobinaconelmétododedeterminación
deproteínas.
formando el grupo hemo oxiferril (Fe4+
= O),
estabilizándose esta unión por interacciones con
radicales de aminoácidos de las cadenas de globina,
a través de enlaces por puente de hidrógeno. Por
esta razón, es posible que en la medida en que se
produce el H2
O2
en la primera reacción, una parte
sea captado por moléculas de hemoglobina libre,
disminuyendo en cierta medida, la formación del
cromóforo /12/.
0
1,95
3,9
0
3,86
4,77
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
Interferencia
Hb (g/L)
TGP (UI)
Fig.5:Representacióndesuperficiedelainterferenciadelahemoglobinaconelmétododedeterminaciónde
alaninaminotransferasa.

8. 25Vol. XV, Nº 3, 2003
En la representación gráfica del comportamiento de la interferencia de la hemoglobina en la
determinación de glucosa, puede observarse que la variación en la forma de la superficie se le atribuye
a la diferencia en la dirección de cada tipo de interferencia. La superficie curva es debido a la
dependencia glucosa-hemoglobina, y el frente trapezoidal es característico de la independencia glucosa-
hemoglobina.
Por su parte, el análisis estadístico del estudio de la actividad colinesterasa demostró, que no existía
interferencia con el método analítico empleado.
Variable Coeficiente
Valor del
coeficiente
Error
standard
t (21) Nivel p
Intercepto β0 0,0987
Colinesterasa β1 0,9478 0,0880 10,7639 0,0001
Hemoglobina β2 0,1703 0,0644 2,6439 0,0457
Colinest. . hemoglobina β3 -0,0811 0,0349 -2,3211 0,0679
TABLA6.ANÁLISISDELOSCOEFICIENTESDEREGRESIÓNMÚLTIPLE,RESULTANTESDELA
INTERFERENCIAPORHEMOGLOBINACONCOLINESTERASA(R2
=0,9765)
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