Este documento describe el uso de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC/MS) para caracterizar los polihidroxialcanoatos (PHAs) producidos por Pseudomonas aeruginosa AT10. La GC/MS permitió separar y analizar la composición química de los PHAs, identificando ácidos grasos hidroxilados. Se encontró que la bacteria acumula el 40% de su biomasa en forma de PHAs cuando se le limita el nitrato en el medio de cultivo. La técnica combinada de

1. 3Vol. XV, Nº 2, 2003
Aplicación de la Cromatografía de Gases/
Espectrometría de Masas (GC/MS) en la
caracterización química de los polihidroxialcanoatos
de Pseudomonas aeruginosa AT10
A. Ábalos*, M. J. Espuny**, R. C. Bermúdez*, A. Manresa**
* Centro de Estudios de Biotecnología Industrial, Universidad de Oriente, ** Laboratorio de Microbiología,
Facultat de Farmacia, Universidad de Barcelona
Resumen
La elucidación de estructuras químicas en muestras biológicas se dificulta por la presencia de
mezclas de compuestos en las mismas. La utilización combinada de métodos de separación y
determinación de estructuras permite separar y analizar a un mismo tiempo mezclas de compuestos. En
el presente trabajo, se describe la composición monomérica de los polihidroxialcanoatos (PHAs) de
Pseudomonas aeruginosa AT10, aplicando Cromatografía de Gases/Espectrometría de Masas
(GC/MS) conionizaciónporImpactoElectrónico(EI)eIonizaciónQuímica(CI)conmetano.Sedescribe
también la influencia de la relación C/N en la acumulación de PHAs por la bacteria.
Palabras clave: cromatografía de gases, espectrometría de masas, polihidroxialcanoatos,
Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Theelucidationofchemicalstructuresinbiologicalsamplesishinderedbythepresenceofmixtures
of compound in the same ones. The combined use of separation methods and determination of structures
allows to separate and to analyze oneself time mixtures of compounds. In this paper is described the
monoméric composition of the polyhydroxyalcanoates (PHAs) by Pseudomonas aeruginosa AT10
applyingGasChromatography/MassSpectrometry(GC/MS)withionizationforElectronicImpact(EI)
and Chemical Ionization (CI) with methane. It is also described the influence of the C/N relationship in
PHAs accumulation for the bacteria.
Key words: gas chromatography, mass spectrometry, polyhydroxyalcanoates, Pseudomonas
aeruginosa.
Introducción
La utilización de técnicas espectroscópicas (UV,
IR, RMN y Espectrometría de Masas) en la
elucidación estructural de compuestos orgánicos,
requiere que la muestra posea cierto grado de pureza
para que el método sea efectivo, ya que estas técnicas
resultan en general ineficaces, en el caso de mezclas
devarioscomponentes;situaciónmuyfrecuenteenel
análisis de muestras biológicas (Pérez et al., 1987).
La solución de numerosos problemas en Química
está supeditada a la caracterización de compuestos
existentes en una mezcla, y es por ello que la forma
habitual de proceder consiste en separar y purificar
previamente los componentes de la mezcla, para
realizar a continuación su análisis. Entre los métodos
de separación más utilizados, se encuentran los
cromatográficos, cuyo principio común es un fluido
(fase móvil) que circula a través de una fase

2. 4 Vol.XV,Nº2, 2003
estacionaria líquida o sólida (Skoog et al. 2001). De
todas las técnicas cromatográficas, la Cromatografía
de Gases (GC) se ha impuesto como el método de
separación por excelencia en el análisis químico. La
EspectrometríadeMasas(MS),esunodelosmétodos
de análisis más empleados en la determinación
estructuraldecompuestosorgánicos,ysefundamenta
en la fragmentación de los enlaces de una molécula
expuesta a un bombardeo electrónico (Skoog et al
2001).Utilizandocomodetectorunespectrómetrode
masas, acoplado a la salida del cromatógrafo, es
posible obtener la información estructural (espectro
demasas)paracadacomponentedelamezclaoriginal
(previamenteinyectadaenelcromatógrafo),amedidas
que éstos son eluidos en serie de la columna
cromatográfica(HesseyMeier1995).Deestaforma,
las limitaciones inherentes a cada técnica quedan
reducidas considerablemente. Estas limitaciones se
deben a que la cromatografía de gases puede separar
los componentes individuales de una mezcla con un
alto poder resolutivo, pero no puede dar, en sentido
riguroso, más información preliminar sobre su
estructura, ya que cualquier columna cromatográfica
no es en principio un instrumento analítico, sino tan
solo un medio de separación física. Por su parte, la
espectrometría de masas requiere de muestras puras,
ya que, de lo contrario, la interpretación del espectro
de masas es extremadamente complejo. Es por esto
que el acoplamiento de cromatografía de gases con la
espectrometría de masas, donde se combina el gran
poder separador de un cromatógrafo gaseoso con el
potentemétododeidentificacióndeunespectrómetro
de masas, es reconocido en el mundo por sus grandes
posibilidadesdeidentificación,yseutilizaampliamente
en el análisis cuantitativo de mezclas complejas de
compuestos orgánicos, fluidos biológicos, muestras
de alimentos, clínicas, bioquímicas y farmacéuticas,
entre otras (Pérez et al. 1987).
Lospolihidroxialcanoatos(PHAs)sonunafamilia
poliésteres de ácidos (R)-3-hidroxialcanoicos
esterificados a través del grupo hidroxilo (OH) de la
cadena del hidroxiácido (figura 1). Esterificaciones
en las posiciones 2, 4, 5 y 6 (Williams et al., 1999) y
sustitucionesconhalógenos(WitholtyKessler,1999)
tambiénhansidodescritas.Lacadenadelhidroxiácido
puede ser lineal (saturada o insaturada) o ramificada.
Los PHAs se localizan en el citoplasma celular,
asociados con membranas intracitoplasmáticas, en
formadegránulosoinclusioneslipídicasde0,2-0,5µm
de diámetro (figura 2), muy refringentes al haz de
electronesenMicroscopíaElectrónicadeTransmisión
(ETM). La superficie in vivo de los gránulos es una
regióndinámicadeinterfasedondesonlocalizadaslas
proteínasqueintervienenenlasíntesis(PHA-sintasa),
degradación (PHA-depolimeraza intracelular) y
estabilizaciónyformacióndelasinclusiones(fasinas)
(Sudesh y Abe, 2000).
En el presente trabajo se describe la composición
química de los PHAs de Pseudomonas aeruginosa
AT10, en condiciones de limitación del medio de
cultivo por nitrato, utilizando GC/MS con ionización
por Impacto Electrónico (EI) e Ionización Química
con metano (CI).
C
OOH
C
O
O
C
O
OH
O
Fig.1 Estructuraquímicadelosácidos(R)-3-hidroxialcanoicos.

3. 5Vol. XV, Nº 2, 2003
Material y métodos
Microorganismo y medio de cultivo
Se utilizó la cepa bacteriana, productora de
ramnolípidos, Pseudomonas aeruginosa AT10
(CECT 11769), aislada de suelos contaminados con
residuos de oleosos del proceso de refinado de aceite
desojaenlaPlantaRefinadoradeAceitesComestibles
ERASOL, Santiago de Cuba (Ábalos et al., 2000).
La composición del medio de cultivo es
(g L-1
):NaNO3
, 4,64; K2
HPO4
/KH2
PO4
(relación
2:1), 1;FeSO4
. 7H2
O; 0,0074; CaCl2
, 0,01; KCl,
0,10; MgSO4 ·
7H2
O, 0,50; extracto de levaduract,
0,10 y se suplementa con 0,05 mL L-1
de una
solución de elementos traza de composición
(g.L-1
): H3
BO3
, 0,26; CuSO4 ·
5H2
O, 0,50;
MnSO4
.H2
O, 0,50; MoNa2
O4
.2H2
O, 0,06;
ZnSO4
.7H2
O, 0,70. Como fuente de carbono, se
utilizaron 50 g L-1
residuo de ácidos grasos libres
(RAGL) del refinado de aceite de soja.
Los experimentos fueron realizados en matraces
Erlemenyer con muescas de 250 mL de capacidad,
los cuales contenían 50 mL del medio previemente
esterilizado durante 20 min a 120 °C y 1 atm. Los
cultivos fueron incubados 96 h en agitador orbital a
150 rpm y 30 °C.
Extracción de las inclusiones lipídicas
LosPHAsseobtuvieronporextraccióncontinuaen
Soxhlet con triclorometano (CHCl3
) durante 24 h a 85-
90 °C (Cromwick et al., 1996) a partir de la biomasa
celularde10mLdecultivoliofilizado.Elcontennidode
PHAs extraído se determinó como porcentaje respecto
alabiomasaliofilizadaanalizada:%PHAs=(biomasa
extraida/biomasaliofilizada)·100.
Análisis de las inclusiones lipídicas por IR
Se utilizó un espectrógrafo de infrarrojos PERKIN
ELMER FITR 1600. La introducción de la muestra se
realizósobrepastillasdeNaClcomosoporte.Elespectro
se registró en la región comprendida entre 4 000-667
cm-1
.
Fig.2Gránulosdepolihidroxialcanoatos(flechasnegras)acumuladosporPseudomonasaeruginosaAT10.
Conflechasblancasseseñalanlosgránulosdepolifosfato.

4. 6 Vol.XV,Nº2, 2003
Caracterización de las inclusiones lipídicas
por GC/MS
La caracterización de química de las inclusiones
lipídicassellevóacaboutilizandouncromatógrafode
gases (Hewlett Packard 5890 serie II) acoplado a un
detector de masas (Hewlett Packard 5989 A). Las
técnicas de ionización empleadas fueron Ionización
Química (CI) e Impacto Electrónico (EI). Previo al
análisis por GC/MS se procedió a metilar y sililar la
muestraconelobjetivodeprotegerlosgruposcarboxilo
e hidroxilo presentes. La derivatización a ésteres
metílicos se realizó con diazometano como agente
metilante, mientras que la sililación de los ésteres
metílicossellevóacabocontrimetilclorosilanocomo
agente sililante (Kates, 1972).
Las condiciones analíticas de trabajo fueron las
siguientes: columna HP-5MS 30 m · 0,25 mm · 0,25
µm recubierta con 5 % de fenil-metilsiloxano;
temperatura inyector: 250 °C; temperatura detector:
290 °C; temperatura inicial columna: 35 °C (2 min);
gradiente de temperatura: 8 °C/ min; temperatura
final 310 °C (10 min). Para la integración de los picos
se utilizó el software Masslab, y la cuantificación se
realizó sobre la base de las proporciones relativas de
losésteresmetílicossililados.
Resultados y discusión
La acumulación de PHAs es una respuesta
fisiológicaalalimitacióndelmedioporalgúnnutriente
necesario en la división celular en presencia de un
exceso de fuente de carbono. (Choi y Lee, 1999;
Steinbüchel y Valentin, 1995). En condiciones de
limitacióndelmediopornitratoyfosfatoPseudomonas
aeruginosa AT10, además de acumular la máxima
cantidad de ramnolípidos en el medio (Ábalos et al.,
2001), acumula intracelularmente el 40 % de la
biomasa celular en forma de PHAs.
La detección por IR de dos bandas intensas con
número de onda ν= 1 739 cm-1
, correspondiente a la
vibración de tensión de enlace C = O de la función
química éster (-COO-) y ν= 2 854 · 2 cm-1
,
correspondiente a la vibración de tensión del grupo
metileno (CH2
) sugirió la presencia de gránulos de
poli-β-hidroxialcanoatos (PHAs) en el citoplasma.
La banda correspondiente a la vibración del enlace
C-O de la función química éster fue detectada a
ν= 1 166 cm-1
.
Composición química de los PHAs de
Pseudomonas aeruginosa AT10
Ladeterminacióndelacomposiciónquímicadelos
gránulos de PHAs se determinó por GC/MS por
Ionización Química (CI) con metano e Impacto
Electrónico (IE). La CI (ionización producida por un
gas reactivo) produce escasas fragmentaciones,
pudiéndosevisualizareliónpseudomolecular[M+1]+;
mientras que la ionización por EI (el agente ionizante
es un haz de electrones) permite obtener
fragmentaciones iónicas, además del ión
pseudomolecular, que describen una estructura
molecular.Enlosanálisisdeestructurasmoleculares,
estos métodos son utilizados de forma combinada
(Hesse y Meier, 1995). Se ha descrito también el
empleo combinado de CG/MS y RMN 1
H uni y
bidimensional para la elucidación estructural de los
PHAs (Huijberts et al., 1992).
Los espectros obtenidos por EI permitieron la
identificación de los ácidos grasos hidroxilados y
fijar, a su vez, la posición del hidroxilo en la cadena
a partir de los picos correspondientes de los iones
de m/z 73 (ruptura del enlace O-trimetilsililo); m/z
89 debido a la ruptura del enlace C-O y m/z 175,
que corresponde a la escisión de la cadena en el Cα
al grupo hidroxilo en posición β dentro de la cadena
del ácido graso. En los espectros, también se
visualizó el pico [M-15]+, cuya asignación
correspondió al ión molecular de los metilésteres
sililados una vez escindido el grupo metilo. En los
espectros obtenidos por CI, se visualizó un pico
muy intenso que correspondió al ión
pseudomolecular del metiléster sililado (tabla 1).
Sedetectarontambiénlospicos[M+29]+y[M+41]+
originados por la unión de los aductos del metano, C2
H5
+
y C3
H5
+
, respectivamente, a la molécula (tabla
1). En las condiciones de trabajo utilizadas no fue
posible fijar la posición de las instauraciones en la
cadena.
Delestudiocombinadodelosespectrosobtenidos
por EI y CI fueron identificados seis monómeros
de ácidos β- hidroxilados, de fórmula general
3-hidroxi-Cn
H2n-1
O2
para los tres monómeros
saturados (C8:0
, C10:0
y C12:0
) detectados y 3-hidroxi-
Cn
H2n-3
O2
ó 3-hidroxi-Cn
H2n-5
O2
para los monómeros
mono (C12:1
y C14:1
) y di-insaturados (C14:2
),
respectivamente.

5. 7Vol. XV, Nº 2, 2003
El monómero mayoritario en el polímero fue el
3-hidroxidecanoato(C10:0
),conun41%deabundancia
seguido del 3-hidroxioctanoato (C8:0
) con 18 %
(tabla 1). Estos monómeros son los que con más
frecuencia aparecen en la composición de las
moléculas de PHAs, sintetizados por diferentes
especies de Pseudomonas cultivadas sobre ácidos
grasos, alcoholes, aceites vegetales y glucosa
(Anderson y Dawes, 1990; Whitolt y Kessler, 1999).
En cepas de Pseudomonas aeruginosa productoras
deramnolípidos,elmonómero3-hidroxidecanoatoes
el grupo hidrofóbico característico de estos
tensoactivos (Déziel et al., 1999 ; Mata-Sandoval et
al., 1999). Se ha planteado que el 3-hidroxialcanoato
es intermediario común en la biosíntesis de PHAs y
ramnolípidos (Rehm et al., 1998). Los monómeros
minoritarios en el polímero de Pseudomonas
aeruginosa AT10 fueron: el 3-hidroxidodecanoato
(C12:0
) y 3-hidroxidodecenoato (C12:1
) con 10 % cada
uno y los 3-hidroxiácidos de 14 átomos de carbono
mono y diinsaturados, con 9 % cada uno (tabla I).
La composición química de los PHAs depende
del sustrato utilizado, del enzima PHA-sintasa y de
la ruta metabólica involucrada (Lemos et al., 1998;
Sudesh y Abe, 2000). Pseudomonas aeruginosa
AT10 al crecer sobre oleina (C18:1
) como fuente de
carbono, acumula únicamente los monómeros
saturados de 8 y 10 átomos de carbono (datos no
mostrados); por el contrario, con el residuo del
refinado de soja, cuya composición contiene una
mezcla de ácidos grasos entre C12
- C18
(Ábalos et al.,
2000), la cepa acumula además de los monómeros
C10:0
y C8:0
, C12:0
, C12:1
, C14:1
y C14:2
(tabla 1). Cuando
se cultivó esta cepa sobre glucosa, el crecimiento fue
muy pobre y no se detectaron PHAs. Pseudomonas
resinovorans, por ejemplo, al crecer sobre ácido
octanoico como única fuente de carbono, acumuló el
8 % de PHAs. La composición del polímero fue
C6
:C8
:C10
15:75:9 % y trazas de C4
(Ramsay et al.,
1992). Otra cepa,Pseudomonas olevorans,cultivada
sobre un residual oleoso que contiene una mezcla de
alcanos, ácidos grasos saturados e insaturados y
ácidos 3-hidroxialcanoicos, acumula el 62 % de su
biomasasecacomoPHAs.Elpolímeroestáconstituido
por 3-hidroxialcanoatos saturados C6
:C8
:C10
:C12:0
,
donde el 3-hidroxialcanoato es el monómero
mayoritario (Füchtenbusch et al. 2000).
Influencia de la relación C/N en la
acumulación de PHAs por Pseudomonas
aeruginosa AT10
Se ha observado, que la relación C/N influye
significativamenteenlaacumulacióndePHAs(Tianet
al., 2000). Al cultivarse P. aeruginosa AT10 en un
medio limitado por nitrato, relación C/N 10.8, la
0
10
20
30
40
50
2 5 a 7 10 a 11
Relación C/N
%
Fig.3.InfluenciadelarelaciónC/NenlaacumulacióndePHAsporPseudomonasaeruginosaAT10.

6. 8 Vol.XV,Nº2, 2003
t (min) Ir (%) m/Z Asignación Monómero (MM)
73
1
[M+H]
+
- Si(CH3)3
89
1
[M+H]
+
- (CH3)3Si-O
175
1
[M+H]+ - CH2COOCH3
231
1
[M+H]
+
- CH3
247
2
[M+H]
+
277
2
[M+H]
+
+ C2H5
+
15,6 18
289
2
[M+H]
+
+ C3H5
+
3- hidroxi C8H15O2 (160)
73
1
[M+H]
+
- Si(CH3)3
89
1
[M+H]
+
- (CH3)3Si-O
175
1
[M+H]+ - CH2COOCH3
259
1
[M+H]
+
- CH3
275
2
[M+H]
+
305
2
[M+H]
+
+ C2H5
+
18,7 41
3172
[M+H]+
+ C3H5
+
3- hidroxi C10H19O2 (188)
73
1
[M+H]
+
- Si(CH3)3
89
1
[M+H]
+
- (CH3)3Si-O
175
1
[M+H]+ - CH2COOCH3
285
1
[M+H]
+
- CH3
301
2
[M+H]
+
331
2
[M+H]
+
+ C2H5
+
21,3 10
343
2
[M+H]
+
+ C3H5
+
3- hidroxi C12H21O2 (214)
73
1
[M+H]
+
- Si(CH3)3
89
1
[M+H]
+
- (CH3)3Si-O
175
1
[M+H]+ - CH2COOCH3
287
1
[M+H]
+
- CH3
303
2
[M+H]
+
333
2
[M+H]
+
+ C2H5
+
21,6 10
345
2
[M+H]
+
+ C3H5
+
3- hidroxi C12H23O2 (216)
73
1
[M+H]
+
- Si(CH3)3
891
[M+H]+
- (CH3)3Si-O
175
1
[M+H]+ - CH2COOCH3
313
1
[M+H]
+
- CH3
329
2
[M+H]
+
359
2
[M+H]
+
+ C2H5
+
23,8 9
371
2
[M+H]
+
+ C3H5
+
3- hidroxi C14H25O2 (242)
73
1
[M+H]
+
- Si(CH3)3
89
1
[M+H]
+
- (CH3)3Si-O
175
1
[M+H]+ - CH2COOCH3
311
1
[M+H]
+
- CH3
327
2
[M+H]
+
357
2
[M+H]
+
+ C2H5
+
23,9 9
369
2
[M+H]
+
+ C3H5
+
3- hidroxi C14H23O2 (240)
TABLA1:COMPOSICIÓNQUÍMICADELOSPHAsDEPSEUDOMONASAERUGINOSAAT10.1
PICOS
VISUALIZADOSPOREI.2
PICOSVISUALIZADOSPORCI

7. 9Vol. XV, Nº 2, 2003
acumulación de PHAs alcanzó el 40 % de la biomasa.
Sin embargo, al disminuir la relación C/N a la mitad, la
acumulación de PHAs disminuyó proporcionalmente
(figura 3). Una situación similar fue descrita para
Pseudomonas mendocina 0806, cepa que acumula el
37 % de la biomasa en forma de PHAs con relación
C/Nde10yácidooleicocomoúnicafuentedecarbono
(Tian et al., 2000).
Conclusiones
1. La Pseudomonas aeruginosa AT10 produce PHAs con una composición monomérica de
C8
:C10
:C12:0
:C12:1
:C14:1
:C14:2
.
2. La máxima acumulación de PHAs se alcanza en la relación C/N de 10.8.
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