El documento resume las principales características de las células madre, incluyendo su definición, tipos (embrionarias, fetales y adultas), potencial de diferenciación, y aplicaciones potenciales en medicina regenerativa y terapia celular para tratar enfermedades con pérdida de función celular. También describe brevemente los métodos para la derivación, cultivo y caracterización de células madre embrionarias humanas.

1. CÈL·LULES MARE I MEDICINA REGENERATIVA Begoña Aran Banc de Línies Cel·lulars Centre de Medicina Regenerativa de Barcelona

2. CÉLULAS MADRE  Se trata de células indiferenciadas que se han localizado en la masa celular interna del blastocisto , en algunos tejidos fetales, en el cordón umbilical y la placenta y en varios tejidos adultos.  Son células pluripotentes (o en algunos casos totipotentes) que dan lugar a células y tejidos especializados.  Su utilidad estriba en la utilización para tratamientos de patologías con pérdida de función celular

3. células madre adultas son células indiferenciadas que se hallan en tejidos adultos diferenciados y que son capaces de renovarse a sí mismas y diferenciarse en todos los tipos celulares del tejido del que provienen. algunas pueden ser pluripotentes. se encuentran en hígado, médula osea, pancreas, piel, cerebro, sangre…

4. células madre adultas su frecuencia es baja, son difíciles de identificar y purificar, su proliferación es limitada y son difíciles de mantener en un estado indiferenciado.

5. células madre fetales se trata de tipos celulares primitivos que se hallan en el feto y que pueden desarrollarse en células madre neuronales, células madre hematopoyéticas (cordón umbilical y placenta), progenitores de islotes pancreáticos .

6. células madre embrionarias son las que derivan de la masa celular interna (MCI) de un blastocisto (día +5/6 de desarrollo,  150 células). Las células de la MCI dan lugar a las 3 líneas del embrión: ectodermo, mesodermo y endodermo . MCI

7. In vitro In vivo

9. HISTORIA  1878 Intentos de Fecundación in Vitro ovocitos de mamífero  1959 1º éxito de Fecundación in Vitro (FIV) (conejo) en USA  1968 1º intento de FIV en humanos  1978 1º nacimiento de FIV en humanos (Edwards y Steptoe-Louise Brown)  1984 Nacimiento España (Victoria Anna)

10. CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

11. Células madre embrionarias: autorenovación y pluripotencialidad Autorenovación Diferenciación Division asimétrica

12. Modelo de enfermedades y desarrollo de fármacos Terapia celular Estudio del desarrollo y organogénesis

13. ENFERMEDADES CON PÉRDIDA DE FUNCIÓN CELULAR POTENCIALMENTE TRATABLES MEDIANTE TERAPIA BASADA EN CM  Alteraciones neurodegenerativas  Accidentes vasculares  Lesiones medulares  Fallo cardíaco  Diabetes mellitus

15. Consentimiento informado de las parejas Aprobación del Comité Ético Aprobación de la Comisión de Seguimiento y Control de la Donación de Células y Tejidos Humanos del Instituto de Salud Carlos III (Madrid) Centro de Medicina Regenerativa de Barcelona CMR[B] Centros de Reproducción Asistida Proyecto: Derivación de CME en condiciones libres de xenobiòticos y caracterización in vivo de su pluripotencialidad

16. Eliminación de la zona pellucida - 5mg/ml pronasa - Ac. Tyrode’s Eliminación del trofectodermo mediante inmunocirugía (anticuerpos) Monocapa de fibroblastos humanos (HFF-1) irradiados (CCD1112SkATCC) , en placas cubiertas de gelatina (0.1%) Feeders cells Descongelación embriones Cultivo hasta blastocisto D+5/6 Derivación células madre embrionarias

17. Siembra y cultivo del blastocisto o MCI sobre monocapa de fibroblastos humanos (HFF-1) irradiados, en placas cubiertas de gelatina (0.1%) Derivación células madre embrionarias CULTIVO KO-DME Medium supplementado con: 2 mmol/l Glutamax 0,05 mmol/l 2-mercaptoethanol 8 ng/ml basic fibroblast growth factor (FGF) 1% non-essential amino acids 20% KO-Serum Replacement 0,5% penicillin-streptomycin 37ºC y 5%CO2

18. Derivación ES [2] p0 d4 (10x) p0 d7 (20x) p0 d9 (20x) p1 d2 (4x) p1 d6 (4x ) p0 d12 (10x)

20. CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS CULTIVO Bajo condiciones adecuadas de cultivo (cultivo sobre fibroblastos de ratón - humanos, Matrigel, Fibronectina), las CME mantienen su estado indiferenciado indefinidamente .

21. CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS DERIVACIÓN Y CULTIVO Es imprescindible para poder utilizar las líneas celulares establecidas que los cultivos se lleven a cabo con métodos libres de soporte animal (anticuerpos y complemento inmunocirugia, feeders, suero, etc)

22. Fosfatasa alcalina cariotipo Microsatélites & HLA Actividad Telomerasa Immunocitoquimica para marcadores de diferenciación In vitro Formación de cuerpos embrioideos Inmunohistoquímica para marcadores de diferenciación In vivo (formación teratomas) Caracterización Inmunocitoquimica para marcadores de pluripotencialidad

23. cariotipo

26. CARACTERIZACIÓN : Diferenciación in vitro Embryoid bodies 3 líneas germinales: Ectodermo: neuronas Endodermo: miocardiocitos Mesodermo: tejido glandular

27. CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vitro Ectodermo: beta-tubulina

28. CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vitro Endodermo: Alfa-feto proteina

29. CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vitro Mesodermo: alfa-actinina

30. CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo Teratomas Ratones SCID de 8 semanas 1millón células intramuscular subcutáneo en algunos órganos 2 meses

31. CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo Mesodermo (Cartilago) Endodermo (epitelio respiratorio) Endodermo (epitelio respiratorio) Mesodermo (Cartilago)

32. CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo

33. DIFERENCIACIÓN Quedan por establecer los factores genéticos y/o ambientales que controlan el desarrollo de las CME y su importancia durante los distintos estadíos de diferenciación

34. Diferenciación de las CME ADIPOCITOS ASTROCITOS CARDIOMIOCITOS CONDROCITOS CÉL. HEMATOPOYÉTICAS CÉL. DENDRÍTICAS CÉL. ENDOTELIALES KERATINOCITOS HEPATOCITOS PRECURSORES LINFOCITOS MASTOCITOS NEURONAS OLIGODENDROCITOS OSTEOBLASTOS ISLOTES PANCREÁTICOS MÚSCULO LISO MÚSCULO ESTRIADO TROFECTODERMO *gametos (ratón)

35. PROBLEMAS TÉCNICOS Diferenciación, desdiferenciación y transdiferenciación: control del crecimiento, migración, destino y diferenciación celular para asegurar procesos estables Desarrollo tisular inadecuado Aparición de tumores Aislamiento y purificación Rechazo inmunológico Funcionalidad y viabilidad Condiciones de cultivo (GMP)

36. TERAPIA CON CME Y RECHAZO INMUNOLÓGICO Como evitarlo? Uso de fármacos inmunosupresores Uso de células HLA compatibles: bancos de CM Inducción de inmunotolerancia: administración previa de material embrionario o hematológico del donante CM procedentes de embriones clonados mediante transferencia nuclear

37.  CLONACIÓN POR TRANSFERENCIA DE NÚCLEO Producción de un individuo genéticamente idéntico por transferencia del núcleo de una célula somática a un ovocito del cual se ha eliminado el núcleo

38.  Nacimiento del primer mamífero superior a partir de una célula de un individuo adulto  Oveja, macaco, cerdo, vaca, gato, ratón, conejo, mula, ciervo, caballo, cabra, perro TRANSFERENCIA NUCLEAR Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells I. Wilmut, A. E. Schnieke * , J. McWhir, A. J. Kind * & K. H. S. Campbell Roslin Institute (Edinburgh), Roslin, Midlothian EH25 9PS, UK * PPL Therapeutics, Roslin, Midlothian EH25 9PP, UK Dolly y su madre portadora Nature 385 , 810 - 813 (27 February 1997)

39. CLONACIÓN TRANSFERENCIA DE NUCLEAR (SCNT) embrión Transferencia a oveja portadora Dolly célula de glándula mamária Transferencia a ovocito enucleado

40. Transferencia nuclear Pluripotentes Paciente-compatibles (mitocondria?) No aún en humanos Problemas éticos Ovocito MII Enucleación Transferencia nuclear y activación Blastocisto Derivacion CME Byrne et al., 2007

42. Transferencia nuclear para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la enfermedad

43. Transferencia nuclear para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la enfermedad

44. Transferencia nuclear para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la enfermedad

45. Transferencia nuclear para el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de la enfermedad

46. Reprogramación de células somáticas (IPS) Paciente-compatible No problemas éticos Disponible en humanos Pluripotentes ? Integración medianter vector (virus) Segura? Activación oncogenes, transmisión línea germinal?) Fibroblastos Células ES-like Takahashi et al., 2007 Nakagawa et al., 2007 Park et al., 2007 Integración genes (virus)

47. KIPS: Generación a partir de keratinocitos Aasen, 2008 Nat Biotech. Keratinocitos Dia 0 Pequeña colonia ES-like 10 días post-infección Típica colonia iPS 20 días post-infección Colonias iPS AP positivas

48. BANCOS DE IPS Daley Q. et al. Cell 2008 Las iPS paciente-específicas podrían representar modelos experimentales para estudiar distintas enfermedades, ensayar tratamientos y posibles terapias génicas. Se han generado ya 11 líneas distintas de iPS procedentes de pacientes con enfermedades graves: enfermedades neurodegenerativas, metabólicas, cardiovasculares, diabetes.

50. Moltes gràcies per la vostra atenció [email_address]