Laboratorios en enfermedades infecciones e inmunologicas.pptx

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Diagnóstico de las enfermedades infecciosas
 Diagnóstico específico: microbiológico
 El diagnóstico de la enfermedad infecciosa parte, en un
principio, de una hipótesis diagnóstica generada por la
valoración de una serie de datos clínicos, epidemiológicos
u otros (físicos, radiológicos). La confirmación del proceso
y la identificación del agente causal conforman el
diagnóstico microbiológico o etiológico de la enfermedad
infecciosa, el cual se lleva a cabo en el laboratorio de
microbiología. En la optimización del diagnóstico es
esencial una adecuada calidad de la muestra clínica a
analizar, constituyendo ésta la principal conexión entre el
clínico y el laboratorio que debe ser en todo momento
fluida.

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 Muestra clínica
 La calidad de la muestra que se envía para su
procesamiento va a condicionar el diagnóstico del
laboratorio. Los aspectos importantes a considerar en este
punto son la toma de la muestra y el transporte.
 Toma de la muestra
 En relación al sitio de la infección hay que distinguir las
zonas estériles de las zonas naturalmente contaminadas
con la flora normal o residente, y en función del modo de
recolección de la muestra ésta puede ser directa e
indirecta.

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 Muestras de sitios estériles
 El sitio de la infección corresponde a líquidos corporales
(líquido cefalorraquídeo [LCR], sangre, abscesos profundos) o
tejidos (pulmón, ganglio) que en condiciones normales son
estériles. La toma de la muestra se puede hacer de forma
directa o indirecta. En el primer caso se realiza a través de
una punción-aspiración o intervención quirúrgica. En estos
casos las muestras sólo tendrán el patógeno, y así los
resultados positivos son siempre diagnósticos, una vez
descartadas las posibles contaminaciones por errores en la
recolección (mala descontaminación de la piel, agentes
ambientales contaminantes). En la toma indirecta, los sitios
donde se localiza la infección (estériles en personas sanas)
deben atravesar sitios colonizados con flora normal, con lo
que la valoración final del resultado debe tener en cuenta este
hecho y el microbiólogo debe conocer tanto los patógenos
potenciales, como la flora contaminante potencial. Son claros
ejemplos la recolección de esputos y orina emitidos de forma
espontánea, que deben de atravesar la zona de la faringe y el
tracto genital externo, respectivamente.

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 Muestras de sitios contaminados con flora normal
 Cuando la infección se localiza en zonas anatómicas
naturalmente contaminadas (faringe, intestino
grueso), los exámenes del laboratorio van
encaminados a seleccionar de forma selectiva
aquellos microorganismos que son causa de
infección en dicha zona y que no son componentes
habituales de la misma. La recolección de la muestra
puede ser directa, con hisopo o torunda estéril (frotis
faríngeo o rectal) o indirecta (heces)

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 Transporte de la muestra
 Deberá de reunir una serie de requisitos importantes, como
son: a) la recogida se hará en un recipiente adecuado y
correctamente etiquetado; b) el transporte se efectuará de
forma rápida al laboratorio, lo antes posible desde su
recolección (primeras 2-3 horas), en caso de no poder llevarse
a cabo un transporte rápido se debe mantener la muestra en
frío (4 °C); c) se utilizarán medios de transporte (líquidos,
semisólidos) para evitar la desecación en las tomas realizadas
con torunda, o para el procesamiento de ciertos
microorganismos (anaerobios).
 Con el fin de aumentar la sensibilidad y especificidad del
diagnóstico, algún tipo de muestras requerirán en el
laboratorio un tratamiento previo a su procesamiento:

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 Observación microscópica
 Se efectúa una tinción de la muestra por el método de Gram,
y se valora la calidad de la misma (grado de contaminación)
en función de la presencia de un mayor o menor número de
células epiteliales de descamación. Es norma habitual para
muestras del tracto respiratorio (esputos) y condiciona su
aceptación o rechazo. También puede ser útil en otro tipo de
muestras, como las muestras de herida obtenidas con hisopo.
 Concentración
 Mediante métodos de centrifugación o filtrado se concentran
aquellas muestras que presentan poca cantidad de
microorganismos (LCR), con el fin de aumentar la
sensibilidad de las técnicas diagnósticas (tinciones, cultivo,
detección de componentes).

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 Diagnóstico microbiológico
 Las estrategias para el diagnóstico del laboratorio pueden
variar según los distintos microorganismos y tipos de
infección, distinguiéndose los métodos de diagnóstico
microbiológico directo e indirecto.
 Diagnóstico directo
 Se trata del empleo de técnicas encaminadas a la
demostración del agente infeccioso, o de sus productos,
directamente en la muestra clínica. Para ello se pueden
poner en práctica diversos métodos convencionales o
rápidos

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 Visualización del microorganismo
 La observación al microscopio de las muestras puede hacerse en
fresco o después de una tinción. En el primer caso, podemos valorar
la presencia de levaduras, hongos filamentosos o parásitos. Con
algunas bacterias que no se pueden observar con la iluminación
habitual de campo brillante (Treponema pallidum) se puede
recurrir a la utilización del condensador de campo oscuro. Las
tinciones a veces son definitivas en la identificación bacteriana. La
tinción imprescindible es la de Gram, que permite diferenciar a las
bacterias en grampositivas y gramnegativas en función de la
permeabilidad de la pared celular. Su utilización, combinada con
otros hallazgos clínicos, puede guiar el tratamiento de la infección
antes del resultado de los cultivos. Otra tinción fundamental es la
de Ziehl-Neelsen, que se emplea en la detección de bacterias ácido-
alcohol resistentes (BAAR), como las pertenecientes a los géneros
Mycobacterium o Nocardia. Otro tipo de tinciones que pueden ser
útiles son las de Giemsa o Wright para parásitos, y las que emplean
fluoróforos, como la auramina o naranja de acridina, para la
visualización en el microscopio de fluorescencia.

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 Detección de componentes
 Se utilizan para ello las técnicas inmunológicas, que
aprovechan la especificidad de la unión de los antígenos
con los anticuerpos. En el diagnóstico microbiológico
directo se emplean anticuerpos conocidos para la
detección del antígeno problema, estructural o secretado
(toxinas bacterianas). Según el tipo de soporte del
anticuerpo, las técnicas pueden ser diversas:
aglutinación del látex, enzimainmunoensayo (EIA),
inmunofluoresencia directa (IFD),
inmunocromatografía. La utilización de los anticuerpos
monoclonales ha tenido gran impacto en la calidad de
dichos métodos, debido a su mayor especificidad

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 En general, las técnicas de detección de antígeno son muy
útiles en aquellos casos en los que el cultivo se ve
obstaculizado, ya sea por tratarse de microorganismos
cuyo crecimiento es lento o dificultoso o por el
tratamiento previo con antimicrobianos, y además
permiten una identificación rápida del agente infeccioso.
En este terreno, la inmunocromatografía ha tenido una
gran implantación como técnica de diagnóstico rápido en
la muestra clínica (detección de antígeno de
Streptococcuspyogenes en faringe, o de Legionella
pneumophila o Streptococcuspneumoniae en orina para
el diagnóstico de neumonía).

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 Detección de ácidos nucleicos
 El análisis del ADN o ARN de los microorganismos, además
de ser la base de los nuevos estudios taxonómicos, ha
revolucionado el campo del diagnóstico y la epidemiología de
las enfermedades infecciosas. Como en el caso de las
reacciones antígeno-anticuerpo, son técnicas muy específicas
y su aplicación no sólo se refiere al diagnóstico directo, sino
que se extiende a otros campos de la Microbiología Clínica,
como son la patogenia, el tratamiento o la epidemiología de
las enfermedades infecciosas. Estas aplicaciones se engloban
bajo la denominación de Microbiología Molecular, y sus
objetivos principales son la detección e identificación del
genoma de los microorganismos (bacterias, virus, hongos,
parásitos), la detección de genes de resistencia a
antimicrobianos, u otros de interés patogénico (genes de
virulencia) y el estudio de la clonalidad de las infecciones,
tanto nosocomiales como de la comunidad

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 Aplicadas al diagnóstico constituyen técnicas de diagnóstico
rápido, como en el caso de la visualización microscópica o la
detección de antígenos. Las técnicas más utilizadas se basan
en la hibridación con sondas específicas y, sobre todo, en la
amplificación de ácidos nucleicos por la técnica de reacción
en cadena de la polimerasa. La identificación se lleva a cabo
bien por la utilización de reacciones en cadena de la
polimerasa que amplifican regiones específicas del
microorganismo, o por amplificación de regiones genómicas
muy conservadas y posterior secuenciación y comparación
con bases de datos. En este último caso, se emplean
fundamentalmente los genes que codifican el ARN ribosomal,
tanto en bacterias (16S, 23S) como en hongos o parásitos (18S,
28S)33
 El desarrollo posterior de estas técnicas ha originado una
nueva generación de métodos moleculares cuya aplicación en
el diagnóstico, y otros campos de la Microbiología Clínica,
está teniendo cada vez una mayor implantación en los
laboratorios clínicos (reacción en cadena de la polimerasa en
tiempo real, pirosecuenciación, FISH, arrays, MALDI-TOF)

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 Cultivo
 En muchas ocasiones el método más usual para la detección e
identificación del microorganismo presente en la muestra lo
constituye su crecimiento previo en un medio de cultivo. La
mayoría de las bacterias y hongos pueden cultivarse en medios
artificiales, pero los intracelulares estrictos (Chlamydia, Rickettsia)
sólo pueden cultivarse en los medios con células eucarióticas
(cultivos celulares). Éstos también son empleados para el cultivo de
los virus. Los medios de cultivo pueden ser sólidos o líquidos, y en
función de su permisividad para el crecimiento de los
microorganismos se clasifican en no selectivos, o comunes, y
selectivos. Estos últimos se emplean sobre todo para el aislamiento
de patógenos específicos en sitios anatómicos con flora normal
abundante (heces). En los medios de cultivo sólidos cada célula
bacteriana se multiplica hasta formar una colonia visible. En los
medios celulares el crecimiento viral se pone de manifiesto por la
observación microscópica de cambios o alteraciones en las
monocapas celulares. A partir del crecimiento en colonias o en
células, se lleva a cabo la identificación del microorganismo por
distintos métodos: bioquímicos, inmunológicos, moleculares o
automatizados

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 En la actualidad, la mayor parte de los laboratorios de
microbiología cuentan también con sistemas automáticos
o semiautomáticos de cultivo e identificación bacteriana.
Los sistemas automáticos de cultivo aumentan la
sensibilidad y el tiempo de detección, y por ello son
fundamentales en situaciones de importancia clínica,
como son el cultivo de las muestras de sangre
(hemocultivos) y de las muestras para el aislamiento de
M. tuberculosis. Muchos de los sistemas automáticos de
identificación que existen en el mercado (Vitek,
MicroScan, Phoenix) incorporan también las pruebas de
sensibilidad a antimicrobianos, por lo que se muestran
muy útiles en el trabajo asistencial del laboratorio.

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 Antibiograma
 Una de las funciones más importantes del laboratorio de
microbiología es la de determinar la susceptibilidad in vitro
del aislado de un paciente a una batería de antimicrobianos,
con el fin de orientar el tratamiento. Para ello, se pueden
emplear técnicas de difusión, como la de disco-difusión en
placa o el Etest, o técnicas de dilución, ya sean en caldo o en
agar26. Enfrentando una misma concentración del
microorganismo a concentraciones crecientes de
antimicrobiano se obtiene el cálculo de la concentración
mínima inhibitoria (CMI), que es muy importante a la hora de
interpretar los criterios de sensibilidad o resistencia. La CMI
se puede determinar por pruebas de microdilución o difusión
(Etest). Todas estas técnicas requieren de una estandarización
en relación a una serie de aspectos, como son el medio de
cultivo, la temperatura y tiempo de incubación, el inóculo
bacteriano o los criterios de lectura

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 Otra forma de determinar en el laboratorio la eficacia de los
antimicrobianos frente a los aislados es evaluar el estado de
resistencia, es decir, buscar los mecanismos de resistencia a ciertos
antimicrobianos, con lo que se evitaría su utilización en el
tratamiento. Así, por ejemplo, la demostración de la producción de
una beta-lactamasa de espectro extendido (BLEE) limitaría en gran
medida la utilización de los betalactámicos. Los mecanismos de
resistencia pueden ponerse de manifiesto por métodos fenotípicos
(detección de la enzima, sinergia de doble disco) o genotípicos. En
estos últimos, se investigan las bases genéticas (mutaciones,
plásmidos) de la expresión de la resistencia, y presentan la ventaja
de que pueden incluso aplicarse directamente en la muestra clínica,
sin necesidad de tener el aislamiento en un medio de cultivo (por
ejemplo, la determinación de la resistencia de M. tuberculosis a
isoniazida o rifampicina)
 Es importante tener en cuenta que en la selección del
antimicrobiano apropiado para el tratamiento de la infección no
bastan por sí mismos los resultados del laboratorio, sino que se
deben de considerar también otros aspectos, como son: la
farmacología del fármaco, el sitio de la infección o el tipo de
patología

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Diagnóstico indirecto o serológico
 Consiste en poner en evidencia una respuesta inmune del huésped
frente a la infección por un microorganismo (bacterias, virus,
hongos o parásitos). En la práctica se trata de detectar los
anticuerpos específicos dirigidos frente a los antígenos del
microorganismo infectante. Normalmente se buscan en el suero del
paciente, pero también se pueden utilizar otros líquidos orgánicos
(LCR, saliva). Se emplean para ello técnicas inmunológicas que
utilizan un antígeno conocido para la detección del anticuerpo
problema, es decir, una inversión del sistema diagnóstico de
detección directa. Los métodos incluyen técnicas semejantes a las
descritas en la detección de antígeno: aglutinación, EIA,
inmunocromatografía, inmunofluorescencia indirecta (IFI),
inmunoelectroforesis (western blot).. En la actualidad, muchas de
estas pruebas diagnósticas están altamente automatizadas y
emplean la quimioluminiscencia como señal en las reacciones
inmunológicas.

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 Otro tipo de técnicas, como la fijación de complemento o la
neutralización, son cada vez menos empleadas en los laboratorios
clínicos. El tipo de anticuerpo o Ig que se detecte puede indicar una
infección reciente (IgM, IgA, IgG de baja afinidad) o pasada (IgG de
alta afinidad). Generalmente de tres a seis semanas después de
producirse la infección se produce el máximo nivel de anticuerpos
(IgM+IgA+IgG), y el aumento de la concentración de éstos entre dos
muestras separadas en el tiempo (2-4 semanas) también es
indicativo de infección reciente. Las pruebas serológicas pueden ser
aplicadas a las muestras en forma de perfil serológico, con el fin de
estudiar, de forma simultánea, varios agentes patógenos que
pueden ser los causantes del mismo cuadro clínico28. Como
ejemplo podemos citar el perfil de neumonía atípica para estudiar la
presencia de anticuerpos frente a los patógenos más importantes
implicados en este proceso (Legionella pneumophila,
Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Coxiella
burnetii). Además del diagnóstico de las infecciones, los estudios
serológicos también tienen su aplicación para conocer el estado
inmune de un individuo frente a un agente infeccioso
(embarazadas, estudios previos a una vacunación), o en estudios
epidemiológicos en que se quiere conocer el estado inmune de la
población (seroprevalencia de la enfermedad, justificación de una
campaña de vacunación).

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 Las pruebas inmunológicas usan uno de los siguientes:
 Antígeno para detectar anticuerpos contra un patógeno
en una muestra del paciente
 Anticuerpo para detectar un antígeno del patógeno en
una muestra del paciente
 El procesamiento de las muestras varía, pero si es
necesario retrasar el análisis, deben refrigerarse o
congelarse para impedir la proliferación de
contaminantes bacterianos

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 En las pruebas de aglutinación (p. ej., aglutinación con látex,
coagregación), una partícula (cuenta de látex, bacteria) se acopla con un
reactivo antigénico o un anticuerpo. La partícula compleja formada se
mezcla con la muestra (como LCR o suero); si el anticuerpo o el antígeno
buscados están presentes en la muestra, producirán el entrecruzamiento de
las partículas, lo que se observa como una aglutinación.
 Si los resultados son positivos, se realizan diluciones seriadas de la
muestra y se prueban nuevamente. La aglutinación de las soluciones más
diluidas indica que existen mayores concentraciones del anticuerpo o del
antígeno en estudio. El título se informa como la recíproca de la solución
más diluida que produce aglutinación; p. ej., un título de 32 indica que la
aglutinación se observa hasta la dilución 1/32 de la concentración inicial.
 Generalmente, las pruebas de aglutinación son rápidas pero menos
sensibles que muchos otros métodos. También permiten determinar los
serotipos de algunas bacterias.
Pruebas de aglutinación

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 Esta prueba mide la cantidad de anticuerpos consumidores de
complemento (o que lo fijan) de una muestra de suero o LCR.
Se usa para el diagnóstico de algunas infecciones virales o
micóticas, especialmente para la coccidioidomicosis.
 La muestra se incuba con cantidades conocidas de
complemento y del antígeno que es el blanco del anticuerpo en
estudio. El grado de fijación del complemento indica la
cantidad relativa de anticuerpos en la muestra.
 La prueba permite medir los títulos de anticuerpos IgM e IgG, o
puede modificarse para detectar determinados antígenos. Es
precisa, pero tiene aplicaciones limitadas, es laboriosa y
requiere muchos controles.
Fijación del complemento

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 Estas pruebas utilizan anticuerpos unidos a enzimas para
detectar antígenos, y para detectar y cuantificar anticuerpos.
Entre ellas, se encuentran el enzimoinmunoanálisis (EIA) y el
enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA).
 Como la sensibilidad de la mayoría de los inmunoensayos es
elevada, suele utilizárselos con fines de rastreo o cribado.
Pueden determinarse los títulos mediante la dilución seriada de
las muestras, como en los ensayos de aglutinación.
 Las sensibilidades de estas pruebas, aunque suelen ser bastante
elevadas, pueden variar de acuerdo con la edad del paciente, el
serotipo del microorganismo o el estadio clínico de la
enfermedad.
Enzimoinmunoensayos

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 Estas pruebas miden la cantidad de antígeno o de anticuerpo en
los líquidos corporales a partir del grado de precipitación
visible de complejos de antígeno-anticuerpo dentro de un gel
de agarosa o en solución. Hay muchos tipos de pruebas de
precipitación (p. ej., doble difusión de Ouchterlony,
contrainmunoelectroforesis), pero sus aplicaciones son
limitadas.
 En general, una muestra de sangre se mezcla con un antígeno
de prueba para detectar los anticuerpos del paciente, en general
cuando se sospecha una infección micótica o una meningitis
piógena. Para obtener un resultado positivo, se requiere una
gran cantidad de anticuerpo o de antígeno, y por ello la
sensibilidad es baja.
Pruebas de precipitación

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 Esta prueba detecta anticuerpos contra el microorganismo en una muestra del paciente (que
puede ser suero u otro líquido corporal) mediante su reacción con antígenos blanco (p. ej.,
componentes virales) que se hallan inmovilizados en una membrana mediante
electrotransferencia.
 La inmunotransferencia de Western suele tener una buena sensibilidad, aunque menor a la de las
pruebas de cribado como el ELISA, y generalmente su especificidad es elevada. Por ello, suele
utilizársela para confirmar un resultado positivo obtenido con una prueba de cribado.
 Las modificaciones técnicas del procedimiento de Western blot son
 El inmunoensayo lineal (LIA)
 Ensayo de inmunotransferencia recombinante (RIBA), que utiliza antígenos sintéticos o
recombinantes
 Los ensayos de inmunocromatografía, que pueden evaluar rápidamente las muestras para
detectar los antígenos microbianos específicos o los anticuerpos del paciente
 De los tres, el ensayo inmunocromatográfico es el más fácil de hacer, y el que se utiliza con mayor
frecuencia, p. ej., para detectar los microorganismos productores de shigatoxina, el antígeno
capsular de Cryptococcus neoformans y el virus de la influenza.

Prueba de inmunotransferencia de Western

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 El análisis de inmunoglobulina mide el nivel de ciertas
inmunoglobulinas, o anticuerpos, en la sangre. Los
anticuerpos son proteínas producidas por el sistema
inmunológico para atacar a los antígenos, como las
bacterias, los virus y los alérgenos.
 El cuerpo genera diferentes inmunoglobulinas para
combatir cada antígeno. Por ejemplo, el anticuerpo de la
varicela no es el mismo que el anticuerpo de la
mononucleosis. A veces, el cuerpo puede equivocarse y
generar anticuerpos que atacan a su propio tejido,
afectando a los órganos sanos ya que los identifica como
cuerpos extraños. Esto es lo que se conoce como
"enfermedad autoinmune"
Analisis de sangre
Inmunoglobulinas IgG,IgA,IgM

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 Los cinco tipos de anticuerpos son los siguientes:
 Inmunoglobulina A (IgA), presente en grandes concentraciones en
las membranas mucosas, particularmente en las paredes internas de
las vías respiratorias y el tracto gastrointestinal, como también en la
saliva y las lágrimas.
 Inmunoglobulina G (IgG), el tipo de anticuerpo más abundante en
los líquidos corporales. Brinda protección contra las bacterias y las
infecciones virales.
 Inmunoglobulina M (IgM), se encuentra principalmente en la
sangre y en el líquido linfático. Es el primer anticuerpo que el
cuerpo genera para combatir una infección.
 Inmunoglobulina E (IgE), se la asocia principalmente con las
reacciones alérgicas (lo que ocurre cuando el sistema inmunológico
reacciona de manera exagerada a los antígenos del medio ambiente,
como el polen o el polvillo de los animales). Se encuentra en los
pulmones, la piel y las membranas mucosas.
 Inmunoglobulina D (IgD), existe en pequeñas cantidades en la
sangre y es el anticuerpo del que menos conocimiento se tiene.

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 Por lo general tanto la IgA como la IgG y la IgM se
miden simultáneamente. Al evaluarse juntas, le
brindan al médico información importante sobre el
funcionamiento del sistema inmunológico,
especialmente en lo relacionado con las infecciones y
las enfermedades autoinmunes.

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 Por qué se realiza
 Una vez que un anticuerpo es producido contra un antígeno
específico, la próxima vez que antígeno entra el cuerpo, el sistema
inmunológico "recuerda" que su respuesta y produce más de los
mismos anticuerpos. En así, verificando para la presencia de
inmunoglobulinas específicas en la sangre puede ser útil en
diagnosticar o excluir las infecciones o ciertas otras enfermedades.
 Los médicos también utilizan este análisis de inmunoglobulina para
ayudarlos a hacer un diagnóstico de las inmunodeficiencias (cuando
el sistema inmunológico no funciona correctamente). Es posible que
una persona haya nacido con una inmunodeficiencia o que la haya
adquirido como consecuencia de una infección, desnutrición,
quemaduras o por los efectos de medicamentos. Los médicos
sospecharán que un niño sufre de una inmunodeficiencia si éste
contrae infecciones frecuentes y poco usuales.
 Los niveles de inmunoglobulina también se utilizan como parte de
una evaluación de las afecciones autoinmunes, como la artritis
reumatoidea, el lupus y la enfermedad celíaca.

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 El cultivo es el crecimiento microbiano en un medio nutritivo
sólido o líquido; el aumento del número de microorganismos
facilita su identificación. El cultivo también facilita la
realización de pruebas de sensibilidad a antimicrobianos.
 La comunicación con el laboratorio tiene una importancia
esencial. Aunque la mayoría de las muestras se cultivan en
medios generales (como agar con sangre o chocolate), algunos
patógenos requieren la inclusión de nutrientes o inhibidores
específicos u otras condiciones especiales (ver Medios selectivos
para el aislamiento de bacterias comunes); si se sospecha la
presencia de uno de estos patógenos o si el paciente ha estado
recibiendo antibióticos, el laboratorio debe estar sobre aviso.
También se informa el origen de la muestra para que el
laboratorio pueda diferenciar los patógenos de la flora normal
específica de esa localización.
CULTIVO

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Género Bacteroides Agar sangre lacada con kanamicina-vancomicina
Bacteroides fragilis Bilis-esculina (con gentamicina y bilis) para Bacteroides
Bordetella pertussis Agar de Bordet-Gengou con meticilina o cefalexina
Agar de Regan-Lowe con cefalexina
Agar carbón con sangre de caballo
Burkholderia cepacia Agar para Pseudomonas cepacia
Campylobacter jejuni o C. coli Agares selectivos para Campylobacter (p. ej., agar con
cefoperazona-vancomicina)
Corynebacterium diphtheriae Agar de Tinsdale
Agar sangre con cistina-telurito
Medio sérico coagulado de Löffler
Escherichia coli o patógenos enterohemorrágicos (productores
de toxina Shiga, incluso O157-H7)
Agar MacConkey-sorbitol
Francisella tularensis Agar sangre o chocolate-cistina
Legionella Agar carbón tamponado y extracto de levadura
Leptospira Medio de Fletcher o Stuart con suero de conejo, o medio
para Leptospira con albúmina sérica bovina-Tween 80
Neisseria gonorrhoeae o N. meningitidis Agar modificado de Thayer-Martin
Agar de Nueva York
Salmonella y Shigella Pueden crecer en agar estándar de MacConkey o azul de
metileno-eosina
Alternativa: Hektoen o xilosa-lisina-desoxicolato, agar
para Salmonella-Shigella, caldo de enriquecimiento para
gramnegativos o seleniuro
Vibrio Agar sacarosa con tiosulfato-citrato-sales biliares
Yersinia Agar con cefsulodina, irgasan-novobiocina

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 La toma de la muestra es importante. Para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas, la regla
general es tomar la muestra donde está la infección En las lesiones, se deben tomar muestras de los
bordes, y no del centro.
 Se desaconseja el uso de hisopos. Sin embargo, si se utiliza un hisopo, se prefiere uno flocado, ya que
permite recolectar más muestra. Los hisopos utilizados para los ensayos moleculares (ver Métodos de
identificación de las enfermedades infecciosas basados en ácidos nucleicos) deben ser compatibles con el
ensayo molecular específico que se desea realizar. Un tipo erróneo de torunda o un mal hisopado
pueden producir un resultado falso negativo. Los hisopos con aplicador de madera son tóxicos para
algunos virus. Los hisopos de algodón son tóxicos para algunas bacterias, como Chlamydias.
 Los hemocultivos requieren la descontaminación y desinfección de la piel (con yodopovidona, secado y
eliminación con alcohol al 70%). Por lo general se usan varias muestras, cada una obtenida de un sitio
diferente; se las toma simultáneamente con los picos de fiebre si es posible. La flora normal de la piel y
de las mucosas que crece en una sola muestra de hemocultivo generalmente se interpreta como
contaminación. Si se obtiene una muestra de sangre de una vía central, debe obtenerse también una
muestra de sangre periférica para ayudar a diferenciar una bacteriemia de una infección del catéter. Los
cultivos de los catéteres infectados suelen dar resultados positivos más rápidamente y contienen una
mayor carga microbiana que las muestras de sangre periférica obtenidas al mismo tiempo. Algunos
hongos, sobre todo los filamentosos (p. ej., especies Aspergillus), en general no pueden cultivarse en la
sangre.
 La muestra debe transportarse rápidamente, en el medio correcto y en condiciones que limiten el
crecimiento de cualquier flora normal que la haya contaminado. Para una cuantificación precisa del
patógeno debe impedirse su crecimiento excesivo; las muestras deben llevarse al laboratorio
inmediatamente, o refrigerarse si este transporte se ve demorado (como ocurre en la mayoría de los
casos).
Recolección de muestras

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 Algunos cultivos requieren consideraciones especiales.
 Las bacterias anaerobias no deben cultivarse en muestras de
sitios donde son flora normal, porque puede ser imposible la
diferenciación entre patógenos y flora. Las muestras deben
protegerse del aire, lo que puede ser complicado. Existen
medios de transporte anaeróbicos para muestras de
hisopados. Sin embargo, las muestras líquidas (por ejemplo,
el contenido de abscesos) son superiores a las muestras por
hisopado para la recuperación de bacterias anaerobias. Las
muestras líquidas deben recogerse con una jeringa a la cual se
ha extraído todo el aire (para minimizar el contacto de la
muestra con el oxígeno) y enviarse al laboratorio en la jeringa
(tapada, sin la aguja), o transferirse a un vial de transporte
anaeróbico.
Consideraciones especiales para la cultura

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 Las micobacterias son difíciles de cultivar. Las muestras que contienen flora normal (como
el esputo) deben primero descontaminarse y concentrarse. Mycobacterium tuberculosis y
algunas otras micobacterias crecen lentamente. El crecimiento de M.
tuberculosis típicamente es más rápido en medios líquidos que en medios sólidos; el uso
rutinario de sistemas automatizados con medios líquidos puede producir el crecimiento
dentro de las 2 semanas, en comparación con ≥ 4 semanas necesarias para medios sólidos
como el agar de Lowenstein-Jensen. Además, puede haber pocos microorganismos
presentes en la muestra. La obtención de varias muestras del mismo sitio puede ayudar a
aumentar el rendimiento. Las muestras deben cultivarse durante 8 semanas antes de
descartarse. Si se sospecha una micobacteria atípica, el laboratorio debe ser notificado.
 Los virus generalmente se cultivan a partir de hisopados y muestras de tejidos, que suelen
ser transportados en medios que contienen agentes antibacterianos y antifmicóticos. Las
muestras se inoculan en cultivos de tejidos que permitan el crecimiento del virus
sospechado e inhiban a otros microorganismos. Los virus que son muy lábiles (como el
varicela-zóster) deben inocularse en cultivos de tejidos dentro de la hora de haber sido
obtenidos. Los cultivos en tejidos estandarizados son más sensibles. Los cultivos tisulares
rápidos (viales protegidos) pueden brindar resultados más rápidos. Algunos virus
comunes no se pueden detectar usando métodos de cultivo de rutina y requieren métodos
alternativos para el diagnóstico (ver Pruebas diagnósticas para los virus comunes que no
crecen en los medios de cultivo de rutina), como los siguientes:
 Enzimoinmunoensayo enzimático para el virus de Epstein-Barr, los virus de la hepatitis B
y E, el HIV y el virus linfotrópico T humano
 Pruebas serológicas para los virus de la hepatitis A y D
 Métodos basados en ácidos nucleicos para el HIV

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Cuadros comunes Virus Pruebas de diagnóstico
Cuadros comunes Virus Pruebas de diagnóstico
Enfermedad febril aguda, meningoencefalitis Alfavirus, flavivirus, bunyavirus (virus de la encefalitis de St. Louis, virus de la encefalitis de La
Crosse)
EIA, métodos basados en los ácidos nucleicos
Diarrea Rotavirus, calicivirus (norovirus), astrovirus ME o IME; métodos basados en ácidos nucleicos
Mononucleosis infecciosa Virus Epstein-Barr EIA, métodos basados en los ácidos nucleicos
Fiebres hemorrágicas, coriomeningitis linfocítica Filovirus, arenavirus (fiebre de Lassa, virus Ébola) EM, Métodos basados en ácidos nucleicos
Hepatitis Hepatitis A, hepatitis D Pruebas serológicas, métodos basados en ácidos nucleicos
Hepatitis B, hepatitis E EIA, métodos basados en los ácidos nucleicos
Hepatitis C, hepatitis G Métodos basados en los ácidos nucleicos, EIA
Roséola, sarcoma de Kaposi, infecciones diseminadas Herpesvirus 6, 7, 8 Métodos basados en los ácidos nucleicos, EIA
Sida HIV Métodos basados en ácidos nucleicos, EIA, inmunotransferencia de Western
Condiloma acuminado, cáncer de piel genital Papilomavirus humanos Métodos basados en los ácidos nucleicos, EIA
Quinta enfermedad Parvovirus humano B19 Métodos basados en los ácidos nucleicos, EIA
Leucemia de células T adultas Virus linfotrópico T humano EIA, métodos basados en los ácidos nucleicos
Leucoencefalopatía multifocal progresiva , infección
renal
Poliomavirus (JC y BK) Métodos basados en ácidos nucleicos
Viruela, viruela de los simios, vaccinia, molusco
contagioso
Poxvirus Métodos basados en ácidos nucleicos, ME, cultivo de acuerdo con el virus
Rabia Virus de la rabia EM, IFA, métodos basados en ácidos nucleicos
Rubéola Virus de la rubeola EIA, IF, métodos basados en los ácidos nucleicos
EIA = enzimoinmunoensayo; ME = microscopia electrónica; MIE = microscopia inmunoelectrónica; IF = ensayos por inmunofluorescencia.


 Por qué realizar un antibiograma?
 El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad
de una cepa bacteriana que se sospecha es la responsable de una
infección a uno o varios antibióticos. En efecto, la sensibilidad in
vitro es uno de los requisitos previos para la eficacia in vivo de un
tratamiento antibiótico. El antibiograma sirve, en primer lugar,
para orientar las decisiones terapéuticas individuales.
 El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolución
de las resistencias bacterianas. Gracias a este seguimiento
epidemiológico, a escala de un servicio, un centro de atención
médica, una región o un país, es como puede adaptarse la
antibioterapia empírica, revisarse regularmente los espectros
clínicos de los antibióticos y adoptarse ciertas decisiones sanitarias,
como el establecimiento de programas de prevención en los
hospitales.
El antibiograma


 Examen fecal (de las heces), también llamado análisis de
huevos y parásitos
 Este análisis se usa para detectar parásitos que provocan
diarrea, heces blandas o líquidas, cólicos, flatulencias
(gases) y otras enfermedades abdominales. Los CDC
recomiendan contar con tres o más muestras fecales,
obtenidas en días diferentes, para el análisis. En este
análisis se buscan huevos o los parásitos.
Su proveedor de atención médica puede indicarle que
coloque las muestras fecales en recipientes especiales con
líquido conservante. Las muestras que no se guarden en
líquido conservante deben estar refrigeradas pero no
congeladas hasta que se las entregue al laboratorio o al
consultorio del proveedor de atención médica.
El proveedor de atención médica puede solicitar al
laboratorio el uso de tinciones especiales o análisis
especiales para buscar parásitos que no se analizan de
manera rutinaria.


Diagnóstico de las
enfermedades
infecciosas


 Las pruebas de laboratorio pueden identificar a los
microorganismos de manera directa (visualmente, usando un
microscopio, cultivando al microorganismo) o indirecta
(mediante la identificación de los anticuerpos generados
frente a éste). Los tipos generales de pruebas incluyen
 Microscopia
 Cultivo
 Pruebas inmunológicas (pruebas de aglutinación como la
aglutinación en látex, enzimoinmunoensayos,
inmunoelectrotransferencia, pruebas de precipitación y
pruebas de fijación del complemento)
 Métodos de identificación basados en ácidos nucleicos
 Métodos de identificación no basados en los ácidos nucleicos


 En general, el cultivo es el patrón de referencia para la identificación
de los microorganismos, pero los resultados pueden demorar varios
días o semanas, y no todos los patógenos pueden cultivarse, lo que
hace útiles las pruebas alternativas. Cuando se cultiva e identifica
un patógeno, las pruebas de laboratorio también permiten
determinar su susceptibilidad frente a los fármacos
antimicrobianos. A veces pueden usarse métodos moleculares para
detectar genes de resistencia específicos.
 Algunas pruebas (p. ej., la tinción de Gram, el cultivo de rutina de
anaerobios) permiten detectar una gran variedad de patógenos y se
realizan habitualmente para muchas enfermedades que se sospecha
infecciosas. Sin embargo, como algunos patógenos no se detectan
con estas pruebas, los médicos deben conocer las limitaciones de
cada una de ellas para cada patógeno bajo sospecha. En estos casos,
el médico debe solicitar pruebas específicas para el microorganismo
sospechado (p. ej., tinciones especiales o medios de cultivo
determinados) o recomendar al laboratorio que seleccione análisis
más específicos.


Microscopia
 Puede ser necesario el examen microscópico del tejido
para distinguir la enfermedad invasiva de la colonización
superficial, una distinción que no se logra fácilmente
mediante métodos de cultivo.
 La mayoría de las muestras se tratan con tinciones que
colorean a los microorganismos, destacándolos así del
fondo, aunque pueden usarse preparados en fresco sin
tinción para detectar hongos y algunos otros patógenos.


 La mayoría de las muestras se tratan con una tinción de
Gram, y si se sospecha la presencia de micobacterias, con
una acidorresistente (tinción de Ziehl-Neelsen). Sin
embargo, algunos patógenos no se observan fácilmente
con estas técnicas; si se sospecha su presencia, se
requieren otras tinciones u otros métodos de
identificación.
 Como la detección microscópica en general requiere una
concentración de microorganismos de al menos
aproximadamente 1 × 104-5/mL, la mayoría de las
muestras de líquidos (como LCR) deben concentrarse (p.
ej., por centrifugación) antes de ser observadas.


Tinción de Gram
 La tinción de Gram permite lo siguiente:
 Clasifica a las bacterias de acuerdo con si son capaces de
retener el colorante cristal violeta (grampositivas se ven
de color azul) o no (gramnegativas se ven rojas)
 Destaca la morfología de las células (p. ej, se observa si
son bacilos o cocos) y su ordenamiento (en grupos,
cadenas, diploides).
 Identifica los leucocitos polimorfonucleares, que indican
una infección bacteriana en lugar de una colonización


Tinciones ácido-alcohol resistentes
tradicionales y modificadas
 Estas tinciones se utilizan para identificar los siguientes:
 Microorganismos ácido alcohol resistentes (especies de Mycobacterium)
 Microorganismos moderadamente ácido alcohol resistentes
(principalmente, especies de Nocardia)
 Rhodococcus y géneros relacionados
 Ovocistos de algunos parásitos (p. ej., Cryptosporidium, microsporidia,
Cystoisospora [Isospora] belli, Cyclospora, Balantidium coli)
 Aunque la detección de micobacterias en el esputo requiere de al menos
10.000 microorganismos/mL, las micobacterias suelen estar en cantidades
menores, por lo que su sensibilidad es limitada. En general, se usan varios
mL de esputo que se descontaminan con hidróxido de sodio y se
concentran por centrifugación para una tinción de este tipo. La
especificidad mejora, aunque algunos microorganismos moderadamente
acidorresistentes son difíciles de distinguir de las micobacterias.


Tinciones fluorescentes
 Estas tinciones fluorescentes permiten la detección con menores
concentraciones (< 1 × 104 células/mL). Algunos ejemplos son
 Naranja de acridina (bacterias y hongos)
 Auramina-rodamina y auramina O (micobacterias)
 Calcoflúor blanco (hongos, especialmente dermatofitos)
 En teoría, el acoplamiento de un colorante fluorescente con un
anticuerpo dirigido contra el patógeno (inmunofluorescencia
directa o indirecta) debe aumentar la sensibilidad y la
especificidad. Sin embargo, estas pruebas son difíciles de leer e
interpretar, y pocas se encuentran disponibles comercialmente
y se usan con frecuencia (p. ej., las pruebas de anticuerpos
fluorescentes directos para Pneumocystis y Legionella).


Preparados húmedos
 Se pueden usar preparados húmedos de muestras sin teñir para
detectar los siguientes elementos a través de microscopia de
campo oscuro:
 Hongos
 Parásitos (incluyendo huevos de helmintos y larvas)
 Células clave vaginales (clue cells) presentes en la vaginosis
bacteriana).
 Organismos móviles (p. ej., Trichomonas)
 Espiroquetas de Treponema (presentes en la sífilis)
 La visualización de los hongos puede incrementarse aplicando
una solución de hidróxido de potasio (KOH) al 10% para
disolver los tejidos circundantes y los microorganismos no
micóticos.


 Tinción con tinta china (carbón coloidal)
 La tinción con tinta china se usa principalmente para detectar
Cryptococcus neoformans y otros hongos encapsulados en una
suspensión de células (p. ej., en una suspensión de LCR). Se tiñe el
fondo del campo, en lugar del microorganismo en sí mismo, lo que
hace que las cápsulas que rodean a los patógenos se vean como un
halo. En el LCR, la prueba no es tan sensible como la detección de
antígenos del criptococo. La especificidad también es limitada; los
leucocitos pueden parecer encapsulados.
 Tinción de Warthin-Starry y tinción de Dieterle
 Estas tinciones de plata se utilizan para visualizar bacterias tales
como
 Espiroquetas
 Helicobacter pylori
 Microsporidia
 Bartonella henselae (la causa de la enfermedad por arañazo del
gato)
 Tinción de Wright y tinción de Giemsa
 Estas tinciones se utilizan para detectar los siguientes:


 Parasitemia
 Histoplasma capsulatum en los fagocitos y las células de los
tejidos
 Inclusiones intracelulares formadas por virus y Chlamydia
 Trofozoítos de Pneumocystis jirovecii
 Algunas bacterias intracelulares
 Tinción tricrómica (tinción de Gomori-Wheatley) y tinción de
hierro-hematoxilina
 Estas tinciones se utilizan para detectar protozoos intestinales.
 La tinción de Gomori-Wheatley se usa para detectar
microsporidios. Puede ser incapaz de detectar la presencia de
huevos de helmintos y no identifica al Cryptosporidium en
forma fiable. Los hongos y las células humanas se tiñen.
 La técnica con hierro y hematoxilina tiñe en forma diferencial
células, inclusiones celulares y núcleos. Los huevos de helmintos
pueden adquirir un color tan oscuro que no permita su
identificación.


 Enzimoinmunoensayo para el virus de Epstein-Barr, el
virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis E, el HIV y
el virus linfotrópico T humano
 Pruebas serológicas para el virus de la hepatitis A y el
virus de la hepatitis D
 Métodos basados en ácidos nucleicos para el HIV
 Las muestras de hongos obtenidas de sitios no estériles
deben inocularse en medios que contengan agentes
antibacterianos. Debe permitirse el crecimiento durante 3
a 4 semanas antes de descartar la muestra.


Pruebas inmunológicas para las
enfermedades infecciosas
 Las pruebas inmunológicas usan uno de los
siguientes:
 Antígeno para detectar anticuerpos contra un
patógeno en una muestra del paciente
 Anticuerpo para detectar un antígeno del patógeno
en una muestra del paciente
 El procesamiento de las muestras varía, pero si es
necesario retrasar el análisis, deben refrigerarse o
congelarse para impedir la proliferación de
contaminantes bacterianos.


 Pruebas de aglutinación
 En las pruebas de aglutinación (p. ej., aglutinación con
látex, coagregación), partículas muy pequeñas (cuentas
de látex, partículas de gelatina, bacterias) se acoplan con
un reactivo antigénico o un anticuerpo. La partícula
compleja formada se mezcla con la muestra (como LCR
o suero); si el anticuerpo o el antígeno buscados están
presentes en la muestra, producirán el entrecruzamiento
de las partículas, lo que se observa como una
aglutinación.


 Fijación del complemento
 La fijación del complemento mide la cantidad de
anticuerpos consumidores de complemento (o que lo
fijan) de una muestra de suero o LCR. Se usa para el
diagnóstico de algunas infecciones virales o micóticas,
especialmente para la coccidioidomicosis.


 Enzimoinmunoensayos
 Los enzimoinmunoensayos utilizan anticuerpos unidos
a enzimas para detectar antígenos, y para detectar y
cuantificar anticuerpos. Algunos ejemplos son
 Enzimoinmunoensayo (EIA)
 Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA)


 Prueba de inmunotransferencia de Western
 La prueba de Western blot detecta anticuerpos contra el
microorganismo en una muestra del paciente (que
puede ser suero u otro líquido corporal) mediante su
reacción con antígenos blanco (p. ej., componentes
virales) que se hallan inmovilizados en una membrana
mediante electrotransferencia.
 La inmunotransferencia de Western suele tener una
buena sensibilidad, aunque menor a la de las pruebas de
cribado como el ELISA, y generalmente su especificidad
es elevada. Por ello, suele utilizársela para confirmar un
resultado positivo obtenido con una prueba de cribado.


Métodos de identificación de las enfermedades
infecciosas basados en ácidos nucleicos
 La identificación basada en ácidos nucleicos (molecular) es cada vez más común en el
diagnóstico clínico; la identificación rápida resultante permite que el paciente reciba
la terapia antimicrobiana específica y evita el tratamiento prolongado con fármacos
empíricos, potencialmente inadecuados.
 Los métodos basados en ácidos nucleicos detectan secuencias de DNA o RNA
específicas, extraídas del microorganismo. Las secuencias pueden o no amplificarse
in vitro.
 Por lo general, los métodos basados en los ácidos nucleicos son específicos y muy
sensibles, y pueden usarse para todas las categorías de microorganismos. Los
resultados se obtienen con rapidez. Dado que cada prueba es específica para un solo
microorganismo, el médico debe conocer los posibles diagnósticos y solicitar los
análisis de acuerdo con ellos. Por ejemplo, si un paciente presenta síntomas que
apuntan a una influenza pero la estación de ésta ya ha pasado, es mejor realizar una
prueba de diagnóstico viral más general (p. ej., un cultivo viral) que una prueba
específica para la influenza, ya que las causas podrían ser otros virus (como el
parainfluenza o los adenovirus).

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