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- 1. Medios de cultivo: diseño y optimización. Balance de materia, diseño de medios de cultivo Ing. C. Mabel Luna Chávez UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA Ingeniería de los Bioprocesos
- 2. Criterios utilizados en la formulación del medio • Elementos en el medio: Similar a la composición elemental de los microorganismos. • La cantidad de carbono necesaria en condiciones aerobias, se determina por el coef. de rendimiento de biomasa: • Factores de crecimiento: aminoácidos, vitaminas o nucleótidos.(Por necesidad p para aumentar la velocidad de crecimiento). • Disponibilidad C H O N S 45 7 33 10 2,5 Cu, Mn,Co,Mo,B.... Trazas ) ( ) ( g utilizado carbono Substrato g producida Biamasa c
- 3. La nutrición microbiana consiste en aportar a las células los ingredientes químicos que necesitan para la síntesis de monómeros, que son los componentes de las macromoléculas, que a su vez construyen las estructuras celulares.
- 4. Medio de cultivo Macronutrientes Micronutrientes Factores de crecimiento
- 10. Tipos de medios de cultivo Los Medios Complejos Los Medios Definidos (Medio Mínimo) Se prepara añadiendo cantidades precisas de compuestos orgánicos e inorgánicos puros a un volumen conocido de agua destilada. Se conoce su composición exacta. Se utilizan hidrolizados de proteínas y otras sustancias muy nutritivas pero no definidas químicamente que se pesan y se añaden a un volumen conocido de agua. No se conoce la composición exacta del medio complejo
- 11. Componentes de medios complejos industriales Componente Origen Melaza Licor de maceración de maíz Licor de sulfito Suero y permeado de suero Vinazas Harinas de soja y pescado Extracto de levadura Industria azucarera Subproducto del procesamiento del maíz Desecho de la industria de pulpa y papel Subproducto de la producción de queso Subproducto de la producción de etanol Industrialización de la soja y pescado Industria productora de levadura
- 12. Ejemplos de medios definidos A B Glucosa (NH4)2SO4 MgSO4. 7H2O KH2PO4 NaCl FeSO4./H2O CuSO4.5H2O ZnSO4./H2O CaCl2 CoCl2.6H2O 18.0 g/L 2.12 0.39 0.68 0.008 0.002 0.001 0.003 0.028 0.0002 Glucosa (NH4)2SO4 MgSO4. 7H2O KH2PO4 NaCl FeSO4./H2O CH3-COONa 19 aminoácidos 5 nucleótidos 10 vitaminas 50.0 g/L 6.0 0.4 1.2 0.02 0.02 40.0 0.08 – 0.6 c/u 0.02 2.10-6 – 1.10-3 c/u A: Medio mínimo calculado para 6 g/l, con (NH4)2SO4 como nutriente limitante y biomasa con 7.5% N. B: Medio para ensayo de lisina con Leuconostoc mesenteroides, Difco Laboratories Inc.
- 18. Disponibilidad de los nutrientes Los nutrientes además de estar presentes en el medio de cultivo, deben estar disueltos para estar disponibles para ser usados por la célula. ¿POR QUÉ PUEDEN NO ESTAR DISPONIBLES? • La esterilización por calor . • Se debe tener en cuenta la temperatura, tiempo de calentamiento, pH del medio • reacciones entre componentes antes, durante o después de la esterilización
- 19. Disponibilidad de los nutrientes Los HPO4 utilizados como fuente de P y buffer deben esterilizarse separados de las sales de Mg, Na, K y NH4 NaMgPO4 NH4MgPO4 poseen baja solubilidad KMgPO4 Los PO4 deben esterilizarse separadamente de las sales de Mg y NH4
- 20. Disponibilidad de los nutrientes • Los azúcares pueden descomponerse por la acción del calor en presencia de sales inorgánicas y compuestos amínicos. sales, H+ sacarosa hidroliza • Los grupos carbonilos de los azúcares con los grupos amino de las proteínas, aminoácidos, etc., dan productos de condensación (reacción de Maillard), los cuales disminuyen significativamente las cantidades de carbohidratos y N amínico disponible. azúcares reductores + -NH2 condensación Los carbohidratos se deben esterilizar por separado de los compuestos nitrogenados orgánicos.
- 21. Disponibilidad de los nutrientes Aminoácido, Factores de crecimiento y Vitaminas son lábiles al calor Se los prepara disolviéndolos separadamente en pequeños volúmenes de agua, en soluciones muy concentradas. Se los esteriliza por filtración. Se los incorpora a los medios de cultivo ya esterilizados (en general 1ml de solución por cada litro de medio) en condiciones de asepsia. Fuente de N: Fuente de N utilizada son sales de NH4+ Esterilizar a un pH < 7 para evitar su volatilización como NH3. Si ésta es urea debe esterilizarse por filtración Al del calor se descompone en NH3 y CO2,
- 22. Disponibilidad de los nutrientes Es aconsejable entonces, esterilizar los componentes de los medios de cultivo en fracciones separadas: • Fracción 1: Fte. de C, micronutrientes, sales de Mg, Ca, etc. • Fracción 2: Fte. de N en caso que se descomponga por calor (urea) debe esterilizarse por filtración, o en caso de que reaccione con la fuente de C puede esterilizarse por calor pero separadamente. • Fracción 3: Vitaminas y factores de crecimiento. Se preparan soluciones 1000 veces mas concentradas y se esterilizan por filtración. • Fracción 4: Fosfatos, se esterilizan por calor.
- 23. Diseño, Formulación, Optimización de medios de cultivo Diseño: Elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos Formulación: Proporciones, concentraciones de cada componente. Optimización: Encontrar la mejor formulación para lograr el objetivo (máx biomasa, producto, etc.)
- 24. Diseño de Medios de cultivo Aplicación Rango (g/L) Investigación en matraces Investigación en fermentadores de laboratorio Producción, rango usual Producción, rango alto Control computarizado, recirculación de células 0.5 – 2.0 1 – 8 10 – 25 30 – 50 100 - 250 S X 0 f f 0 Y ) X (X S S Valores típicos de concentraciones celulares Cálculo: Yx/s 0 0 . 2 5 . 1 0 S f S
- 25. Método de cálculo o estimación de los rendimientos para el diseño de medios biomasa en elemento nutriente en elemento Y S X % % f % % biomasa en elemento nutriente en elemento Y S X
- 26. Ejercicio
- 27. Optimización
- 28. ¿y……. Si hubiera 2 fuentes de nutriente Crecimiento diauxico