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Harper Bioquímica ilustrada, 31e
Capítulo 4: Proteínas: determinación de la estructura primaria
Peter J. Kennelly; Victor W. Rodwell
OBJETIVOS
OBJETIVOS
Después de estudiar este capítulo, usted deberá ser capaz de:
Citar tres ejemplos de modificaciones postraduccionales que comúnmente ocurren durante la maduración
de un polipéptido recién sintetizado.
Nombrar cuatro métodos cromatográficos comúnmente empleados para el aislamiento de proteínas de
materiales biológicos.
Describir cómo se puede usar la electroforesis en geles de poliacrilamida para determinar la pureza, la
composición de la subunidad, la masa relativa y el punto isoeléctrico de una proteína.
Describir la base sobre la cual los espectrómetros de cuadrupolo y tiempo de vuelo (TOF, time-of-flight)
determinan la masa molecular.
Comparar las fortalezas y debilidades respectivas de la clonación de DNA y la espectrometría de masas (MS,
mass spectrometry) como herramientas para determinar la estructura primaria de la proteína.
Explicar qué se entiende por “el proteoma” y citar ejemplos de su importancia potencial.
Describir las ventajas y limitaciones de los chips de genes como una herramienta para controlar la expresión
de proteínas.
Describir tres estrategias para resolver proteínas individuales y péptidos a partir de muestras biológicas
complejas para facilitar su identificación por MS.
Comentar sobre las contribuciones de la genómica, los algoritmos informáticos y las bases de datos a la
identificación de los marcos abiertos de lectura (ORF, open reading frames) que codifican una proteína
determinada.
IMPORTANCIA BIOMÉDICA
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Las proteínas son macromoléculas complejas física y funcionalmente que desempeñan múltiples funciones
de suma importancia. Una red interna de proteínas, el citoesqueleto (véase capítulo 51) mantiene la forma y
la integridad física de una célula.
Los filamentos de actina y miosina forman la maquinaria contráctil del músculo (véase capítulo 51). La
hemoglobina transporta oxígeno (véase capítulo 6), mientras que los anticuerpos circulantes nos defienden
de los invasores externos (véase capítulo 52). Las enzimas catalizan reacciones que generan energía,
sintetizan y degradan biomoléculas, replican y transcriben genes, procesan mRNA, etc. (véase capítulo 7).
Los receptores permiten a las células detectar y responder a las hormonas y a otras señales extracelulares
(véanse capítulos 41 y 42). Las proteínas están sujetas a cambios físicos y funcionales que reflejan el ciclo de
vida de los organismos en los que residen. Una proteína típica “nace” en la traducción (véase capítulo 37),
madura a través de eventos de procesos postraduccionales como la proteólisis (véanse capítulos 9 y 37),
alterna entre estados de trabajo y descanso mediante la intervención de factores reguladores (véase capítulo
9), envejece por oxidación, desamidación, etc. (véase capítulo 58) y “muere” cuando se degrada a su
componente aminoácido (véase capítulo 29).
Un objetivo importante de la medicina molecular es identificar biomarcadores tales como proteínas y/o
modificaciones a proteínas cuya presencia, ausencia o deficiencia se asocia con estados o enfermedades
fisiológicas específicas (figura 4–1).
FIGURA 4–1
Representación diagramática del ciclo de vida de una proteína hipotética. (1) El ciclo de vida comienza con la
síntesis en un ribosoma de una cadena polipeptídica, cuya estructura primaria está dictada por un mRNA. (2)
A medida que avanza la síntesis, el polipéptido comienza a plegarse en su conformación nativa (azul). (3) El
plegamiento puede estar acompañado por eventos de procesos tales como la escisión proteolítica de una
secuencia del extremo N-terminal (Met-Asp-Phe-Gln-Val) o la formación de enlaces disulfuro (S—S). (4) Las
modificaciones covalentes posteriores pueden, por ejemplo, unir una molécula de ácido graso (amarillo)
para (5) la translocación de la proteína modificada a una membrana. (6) La unión de un efector alostérico
(rojo) puede desencadenar la adopción de una conformación catalíticamente activa. (7) Con el tiempo, las
proteínas se dañan por ataque químico, desamidación o desnaturalización, y (8) pueden ser “etiquetadas”
por la unión covalente de varias moléculas de ubiquitina (Ub, ubiquitin). (9) La proteína ubiquitinada se
degrada posteriormente a sus componentes aminoácidos, que están disponibles para la síntesis de nuevas
proteínas.

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LAS PROTEÍNAS Y LOS PÉPTIDOS DEBEN SER PURIFICADOS ANTES DEL
ANÁLISIS
La proteína altamente purificada es esencial para el examen detallado de sus propiedades físicas y
funcionales. Las células contienen miles de proteínas diferentes, cada una en cantidades ampliamente
variables. El aislamiento de una proteína específica en cantidades suficientes para el análisis de sus
propiedades presenta así un reto formidable que puede requerir la aplicación sucesiva de múltiples técnicas
de purificación. La precipitación selectiva explota las diferencias en la solubilidad relativa de las proteínas
individuales en función del pH (precipitación isoeléctrica), la polaridad (precipitación con etanol o acetona)
o la concentración de sal (salificación con sulfato de amonio). Las técnicas cromatográficas separan una
proteína de otra basándose en la diferencia de su tamaño (cromatografía de exclusión por tamaño), carga
(cromatografía de intercambio iónico), hidrofobicidad (cromatografía de interacción hidrófoba) o la
capacidad de unirse a un ligando específico (cromatografía de afinidad).
Cromatografía en columna
En la cromatografía en columna, la matriz de fase estacionaria consiste en pequeñas perlas cargadas en un
recipiente cilíndrico de vidrio, plástico o acero llamado columna. Los soportes permeables a los líquidos
confinan las cuentas dentro de este espacio mientras permiten que el líquido de fase móvil fluya o se filtre a
través de la columna. Las perlas de fase estacionaria pueden ser derivatizadas químicamente para recubrir
su superficie con los grupos ácidos, básicos, hidrófobos o ligandos requeridos para el intercambio iónico, la
interacción hidrófoba o la cromatografía de afinidad. A medida que el líquido de la fase móvil emerge de la
columna se recoge automáticamente como una serie de pequeñas porciones llamadas fracciones. La figura
4–2 representa la preparación básica de un sistema simple de cromatografía de banco.
FIGURA 4–2

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Componentes de un típico equipo de cromatografía líquida. Como muestra, aparecen los componentes clave
de un sistema programable de cromatografía líquida que consiste en A: envase de líquidos en la fase móvil
(amarillo, azul claro), B: bombas controladas por microprocesadores (púrpura), C: cámara mezcladora (rojo),
D: puerto de inyección para cargar el analito (azul oscuro); E: columna de cristal, plástico o metal que
contiene matriz en fase estacionaria (gris), F: indicador refractivo, fluorométrico, espectrofotométrico, o
detector electroquímico (naranja) y G: colector de fracción para colectar porciones, llamadas fracciones,
líquido eluyente (verde) en una serie de tubos de ensayos separados, viales o pozos en una placa
microtituladora. Los microprocesadores pueden ser programados para bombear líquidos de un solo envase
(elución isocrática) para cambiar los envases en algún punto predeterminado para generar un gradiente por
etapa, o para mezclar líquidos desde los dos envases en proporciones que varían con el tiempo para generar
tanto una multifase como un gradiente continuo.
Cromatografía líquida de alta presión (HPLC, high-pressure liquid chromatography)

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Las matrices de cromatografía en columna de primera generación consistían en polímeros de oligosacáridos
largos entrelazados formados en cuentas esféricas de alrededor de un décimo de milímetro de diámetro. Por
desgracia, su tamaño relativamente grande perturbó el flujo de la fase móvil y limitó el área superficial
disponible para acomodar grupos cargados añadidos o similares al ligando. La resolución se puede
aumentar reduciendo el tamaño de partícula. Sin embargo, la resistencia creada por una matriz más
compacta requería el uso de presiones muy altas que aplastarían las cuentas hechas de materiales blandos y
esponjosos como polisacáridos o acrilamida. De manera eventual se desarrollaron métodos para fabricar
partículas de silicio del tamaño y la forma necesarios, para derivatizar su superficie con diversos grupos
funcionales y empacarlas en columnas de acero inoxidable capaces de resistir presiones de varios miles de
psi. Debido a su mayor poder de resolución, los sistemas de HPLC han desplazado en gran medida a las
columnas de vidrio que alguna vez fueron familiares en el laboratorio de purificación de proteínas.
La cromatografía de exclusión por tamaño
La exclusión por tamaño o, como a veces todavía se hace referencia, la cromatografía de filtración en gel
separa las proteínas en función de sus radios de Stokes. El radio de Stokes es una medida del volumen
efectivo ocupado por una proteína, a medida que desciende libremente en una solución. Por tanto, los
radios de Stokes son una función de masa molecular y forma. Como la hélice en un avión, cuando cae, una
proteína alargada ocupa un volumen efectivo mayor que una proteína globular de la misma masa. La
cromatografía de exclusión por tamaño emplea perlas porosas (figura 4–3) cuyos poros son análogos a las
hendiduras de la ribera de un río. A medida que los objetos avanzan, el movimiento de cualquier objeto que
penetre en una hendidura se retarda hasta que se reincorpore a la corriente fluida. Las proteínas con radios
de Stokes tan grandes que no entran en los poros (proteínas excluidas) permanecen en la fase móvil y
emergen primero que las proteínas que penetran en los poros (proteínas incluidas). Por tanto, las proteínas
emergen desde una columna de filtración en gel en el orden descendente de sus radios de Stokes.
FIGURA 4–3
Cromatografía de exclusión por tamaño. A: una mezcla de moléculas grandes (carmelita) y moléculas
pequeñas (rojo) es aplicada en la parte superior de una columna de filtración en gel. B: en la entrada de la
columna, las pequeñas moléculas penetran los poros en la matriz de fase estacionaria (gris). Mientras que en
la fase móvil (azul) corren por la columna, dejan atrás las moléculas grandes, las cuales son excluidas.

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Cromatografía de intercambio iónico
En la cromatografía de intercambio iónico, las proteínas interactúan con la fase estacionaria por las
interacciones carga-carga. Las proteínas con una carga neta positiva y un pH dado se adhieren con fuerza a
las partículas con grupos funcionales negativamente cargados, tales como carboxilatos o sulfatos
(intercambiadores de cationes). Al igual que las proteínas con una carga neta negativa se adhieren de modo
fuerte a las partículas con grupos funcionales positivamente cargados, en general aminas terciarias o
cuaternarias (intercambiadores de aniones). Las proteínas sin adherencia fluyen a través de la matriz y son
arrastradas. Luego, las proteínas unidas son desplazadas de manera selectiva elevando de modo gradual la
fuerza iónica de la fase móvil, por tanto las interacciones carga-carga se debilitan. Las proteínas se eluyen en
orden inverso a la fuerza de sus interacciones con la fase estacionaria.
Cromatografía de interacción hidrófoba
La cromatografía de interacción hidrófoba separa las proteínas basada en su tendencia de asociarse con una
matriz de fase estacionaria cubiertas con grupos hidrófobos (p. ej., sefarosa fenilo, sefadex octilo). Las
proteínas con superficie hidrófoba expuesta se adhieren a la matriz mediante las interacciones hidrófobas
que son mejoradas por el empleo de una fase móvil de alta fuerza iónica. Posteriormente las proteínas que
no se adhieren son arrastradas y la polaridad de la fase móvil decrece por la disminución gradual de la
concentración de sal. Si la interacción entre la proteína y la fase estacionaria es fuerte, el etanol o el glicerol
puede ser agregado a la fase móvil para disminuir su polaridad y debilitar con posterioridad las interacciones
hidrófobas.

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Cromatografía por afinidad
La cromatografía por afinidad explota la alta selectividad expuesta por muchas proteínas para sus ligandos.
Las enzimas pueden ser purificadas por la cromatografía por afinidad usando sustratos inmovilizados,
productos, coenzimas o inhibidores. En teoría, solamente se purifican las proteínas que interactúan con la
adherencia de ligandos inmóviles. Las proteínas unidas luego se eluyen por competición con ligando libre
soluble o, de forma menos selectiva, por disrupción de las interacciones proteína-ligando usando urea,
hidrocloruro de guanidina, pH levemente ácido o altas concentraciones de sal. Las matrices de fase
estacionaria que contienen análogos de ligandos frecuentemente encontrados, tales como NAD+ o ATP, están
disponibles de modo comercial. Las proteínas expresadas recombinantemente se purifican con frecuencia
mediante el uso de vectores que añaden un dominio de fusión a la proteína codificada diseñada para
interactuar con una matriz de afinidad específica (véase capítulo 7).
La pureza proteica se evalúa mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE,
polyacrylamide gel electrophoresis)
El método más ampliamente utilizado para determinar la pureza de una proteína es SDS-PAGE —la
electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)— en presencia del detergente aniónico dodecilsulfato sódico
(SDS, sodium dodecyl sulfate). La electroforesis separa las biomoléculas cargadas en función de las
velocidades a las que migran en un campo eléctrico aplicado. Para SDS-PAGE, la acrilamida se polimeriza y
se reticula para formar una matriz porosa. El SDS se une a las proteínas en una proporción de una molécula
de SDS por dos enlaces peptídicos, lo que provoca que el polipéptido se despliegue o se desnaturalice.
Cuando se usa junto con 2-mercaptoetanol o ditiotreitol para reducir y romper los enlaces disulfuro (figura 4–
4), la SDS-PAGE separa los componentes polipeptídicos de las proteínas multiméricas. El gran número de
moléculas de SDS aniónicas, cada una con una carga de –1, supera las contribuciones de carga de los grupos
endógenos de aminoácidos funcionales a un polipéptido típico. Dado que esto hace que la proporción de
carga a masa de cada complejo de SDS-polipéptido sea aproximadamente igual, la resistencia física que
encuentra cada péptido a medida que se mueve a través de la matriz de acrilamida determina su velocidad
de migración. Los complejos grandes encuentran mayor resistencia, lo que hace que los polipéptidos se
separen en función de su masa molecular relativa (Mr, relative molecular mass). Los polipéptidos
individuales atrapados en el gel de acrilamida después de la eliminación del campo eléctrico se visualizan
mediante tinción con colorantes tales como azul de Coomassie (figura 4–5).
FIGURA 4–4
La escisión oxidativa de cadenas polipeptídicas adyacentes unidas por enlaces disulfuro (resaltados en azul)
por ácido perfórmico (izquierda) o escisión reductiva por betamercaptoetanol (derecha) forma dos péptidos
que contienen residuos de ácido cisteico o residuos cisteinilo, respectivamente.

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FIGURA 4–5
Uso de SDS-PAGE para observar la purificación sucesiva de una proteína recombinante. El gel se tiñó con azul
de Coomassie. Se muestran patrones de proteínas (carril S) del Mr indicado, en kDa, extracto de células

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crudas (E), citosol (C), líquido sobrenadante de alta velocidad (H) y la fracción de DEAE-Sefarosa (D). La
proteína recombinante tiene una masa de aproximadamente 45 kDa.
Enfoque isoeléctrico (IEF, isoelectric focusing)
Los tampones iónicos llamados anfolitos y un campo eléctrico aplicado se utilizan para generar un gradiente
de pH dentro de una matriz de poliacrilamida. Las proteínas aplicadas migran hasta que alcanzan la región
de la matriz donde el pH coincide con su punto isoeléctrico (pI), el pH al cual la carga neta de una molécula
es 0. El IEF se usa con frecuencia junto con SDS-PAGE para electroforesis bidimensional, que separa
polipéptidos basados en pI en una dimensión y en Mr en la segunda (figura 4–6). La electroforesis
bidimensional es particularmente adecuada para separar los componentes dentro de mezclas complejas de
proteínas.
FIGURA 4–6
IEF-SDS-PAGE bidimensional. El gel se tiñó con azul de Coomassie. Un extracto bacteriano crudo se sometió
primero a enfoque isoeléctrico (IEF) en un gradiente de pH 3–10. El gel de IEF se colocó entonces
horizontalmente en la parte superior de un gel de SDS-PAGE, y las proteínas se resolvieron luego mediante
SDS-PAGE. Observe la resolución muy mejorada de distintos polipéptidos en relación con el gel de SDS-PAGE
ordinario (figura 4–5).

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SANGER FUE EL PRIMERO EN DETERMINAR LA SECUENCIA DE UN
POLIPÉPTIDO
La insulina madura consiste en la cadena A de 21 residuos y la cadena B de 30 residuos unida por enlaces
disulfuro. Frederick Sanger redujo los enlaces disulfuro (figura 4–4), separó las cadenas A y B, y dividió cada
cadena en péptidos más pequeños usando tripsina, quimotripsina y pepsina. Los péptidos resultantes luego
fueron aislados e hidrolizados en una mezcla de péptidos más pequeños por tratamiento con ácido. Cada
péptido en la mezcla se aisló y se trató con 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (reactivo de Sanger), que reacciona
con los grupos α-aminos expuestos de los residuos amino terminales. Luego fue determinado el contenido
de aminoácidos de cada péptido e identificado el aminoácido amino terminal. El grupo ε-amino de lisina
también reacciona con el reactivo Sanger; pero como una lisina amino terminal reacciona con 2 mol de
reactivo Sanger, se distingue fácilmente de una lisina del interior de un péptido. Trabajando desde di y
tripéptidos hasta fragmentos progresivamente más grandes, Sanger pudo reconstruir la secuencia completa
de insulina, un logro por el cual recibió el Premio Nobel en 1958. Sanger, quien recibió su segundo Premio
Nobel por su desarrollo de técnicas para la secuenciación de DNA, murió en 2013 a la edad de 95 años.
LA REACCIÓN DE EDMAN PERMITE DETERMINAR LA SECUENCIA DE
PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS

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Pehr Edman introdujo isotiocianato de fenilo (reactivo de Edman) para marcar selectivamente el residuo
amino terminal de un péptido. A diferencia del reactivo Sanger, el derivado de feniltiohidantoína (PTH,
phenylthiohydantoin) puede eliminarse en condiciones moderadas para generar un nuevo residuo amino
terminal (figura 4–7). Las sucesivas rondas de derivatización con reactivo de Edman pueden, por tanto,
usarse para secuenciar muchos residuos de una sola muestra de péptido. Incluso con el beneficio del
reactivo Edman, la determinación de la secuencia completa de una proteína por métodos químicos sigue
siendo un proceso que exige mucho tiempo y mano de obra.
FIGURA 4–7
La reacción de Edman. El isotiocianato de fenilo derivatiza el residuo amino terminal de un péptido como un
ácido feniltiohidantoico. El tratamiento con ácido en un disolvente no hidroxílico libera una
feniltiohidantoína, que posteriormente se identifica por su movilidad cromatográfica, y un péptido con un
residuo más pequeño. Luego el proceso se repite.

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Las propiedades químicas heterogéneas de los aminoácidos significaron que cada paso en el procedimiento
representaba un compromiso entre la eficiencia para cualquier aminoácido o conjunto de aminoácidos en
particular y la flexibilidad necesaria para acomodar a todos los 20. Por consiguiente, cada paso en el proceso
opera a menos de 100% de eficiencia, que conduce a la acumulación de fragmentos de polipéptidos con
diferentes N-terminales. Eventualmente, se hace imposible distinguir el aminoácido PTH correcto para esa
posición en el péptido de los contaminantes fuera de fase. Como resultado, la longitud de lectura para la
secuenciación de Edman varía de 5 a 30 residuos de aminoácidos dependiendo de la cantidad y pureza del
péptido.
Para determinar la secuencia completa de un polipéptido de varios cientos de residuos de longitud, primero
se debe escindir una proteína en péptidos más pequeños, usando una proteasa o un reactivo como bromuro
de cianógeno. Después de la purificación por HPLC de fase inversa, estos péptidos son analizados por la
secuenciación de Edman. Con el objetivo de ensamblar estas secuencias peptídicas cortas para resolver la
secuencia completa del polipéptido intacto, es necesario analizar los péptidos cuyas secuencias se
superponen entre sí. Esto se logra generando múltiples conjuntos de péptidos utilizando más de un método
de escisión. Las grandes cantidades de proteína purificada requeridas para probar la fragmentación de
proteínas múltiples y las condiciones de purificación de péptidos constituyen el segundo gran inconveniente
de las técnicas químicas directas de secuenciación de proteínas.
LA BIOLOGÍA MOLECULAR REVOLUCIONÓ LA DETERMINACIÓN DE LA
ESTRUCTURA PRIMARIA

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Mientras que las reacciones que derivan secuencialmente y segmentan los aminoácidos PTH del extremo
amino terminal de un péptido típicamente son conducidas en un secuenciador automático, la secuenciación
del DNA es mucho más rápida y económica. Las técnicas recombinantes permiten a los investigadores
fabricar un suministro prácticamente infinito de DNA a partir de cantidades mínimas de molde presentes en
la muestra original (véase capítulo 39). Los métodos de secuenciación del DNA, cuya química subyacente
también fue desarrollada por Sanger, logran de manera rutinaria secuenciadores automáticos para “leer”
secuencias de varios miles de desoxirribonucleótidos de longitud. La secuencia del polipéptido codificado se
determina de modo simple traduciendo la secuencia de tripletes de nucleótidos codificados por su gen. Por
el contrario, los primeros biólogos moleculares diseñaron sondas oligonucleotídicas complementarias para
identificar el clon de DNA que contiene el gen de interés al invertir este proceso y utilizar un segmento de
secuencia de aminoácidos determinada químicamente como molde. El advenimiento de la clonación del
DNA marcó el comienzo del uso generalizado de un enfoque híbrido en el que se empleó la química de
Edman para secuenciar una pequeña porción de la proteína y luego explotar esta información para
determinar la secuencia restante mediante clonación de DNA y secuenciación de polidesoxirribonucleótidos.
LA GENÓMICA PERMITE QUE LAS PROTEÍNAS SE IDENTIFIQUEN A PARTIR
DE PEQUEÑAS CANTIDADES DE DATOS DE SECUENCIA
Hoy en día, la cantidad de organismos para los que la secuencia completa de DNA de sus genomas ha sido
determinada y se encuentra disponible, a los números de la comunidad científica, es de miles. Por tanto,
para la mayoría de los científicos investigadores, en particular aquellos que trabajan en “organismos
modelos” comúnmente utilizados como Homo sapiens, ratón, rata, Escherichia coli, Drosophila
melanogaster, Caenorhabditis elegans, levadura, etc., la secuencia genéticamente codificada de la(s)
proteína(s) con las que están trabajando ya ha sido determinada y está a la espera de ser incluida en una
base de datos como GenBank. Todo lo que un científico necesita para hacer una identificación inequívoca es
la secuencia de aminoácidos para algún segmento, a veces tan sólo como cinco o seis residuos consecutivos,
de la proteína de interés. Mientras que la información de la secuencia de aminoácidos una vez se obtuvo
usando la técnica de Edman, hoy en día la espectrometría de masas (MS, mass spectrometry) se ha
convertido en el método de elección para la identificación de proteínas.
LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS PUEDE DETECTAR MODIFICACIONES
COVALENTES
La sensibilidad, velocidad y versatilidad superiores de la MS han reemplazado a la técnica de Edman como el
método principal para determinar las secuencias de péptidos y proteínas. La MS es significativamente más
sensible y tolerante a las variaciones en la calidad de la muestra. Además, dado que la masa y la carga son
propiedades comunes de una amplia gama de biomoléculas, la MS puede usarse para analizar metabolitos,
carbohidratos y lípidos y detectar modificaciones postraduccionales como la fosforilación o la hidroxilación
que agregan incrementos de masa fácilmente identificables a una proteína (cuadro 4–1). Estas

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modificaciones son difíciles de detectar usando la técnica de Edman y son indetectables en la secuencia de
aminoácidos derivada de DNA.
CUADRO 4–1
Aumentos masivos resultantes de las modificaciones postraduccionales comunes
Modificación Aumento de la masa de (Da)
Fosforilación 80
Hidroxilación 16
Metilación 14
Acetilación 42
Miristilación 210
Palmitoilación 238
Glucosilación 162
LOS ESPECTRÓMETROS DE MASA SE PRESENTAN EN DIFERENTES
CONFIGURACIONES
En un espectrómetro de masas cuadrupolo simple, se coloca una muestra al vacío y se deja evaporar en
presencia de una fuente de protones para suministrar una carga positiva. Un campo eléctrico luego impulsa
los cationes hacia un tubo de vuelo curvo donde se encuentran con un campo magnético, que los desvía en
ángulo recto a su dirección original (figura 4–8). La corriente que alimenta el electroimán que genera este
campo se incrementa de manera gradual hasta que la trayectoria de cada ion se doble lo suficiente como
para golpear un detector montado en el extremo del tubo de vuelo. Para iones de carga neta idéntica, la
fuerza requerida para doblar su trayectoria en la misma medida es proporcional a su masa.
FIGURA 4–8
Componentes básicos de un espectrómetro de masas simple. Una mezcla de moléculas, representada por un
círculo rojo, un triángulo verde y un diamante azul, se vaporiza en un estado ionizado en la cámara de
muestra. Estas moléculas se aceleran por el tubo de vuelo mediante un potencial eléctrico aplicado a la
rejilla del acelerador (amarillo). Un electroimán de intensidad de campo ajustable aplica un campo
magnético que desvía el vuelo de los iones individuales hasta que golpean el detector. Mientras mayor sea la
masa del ion, mayor será el campo magnético requerido para enfocarlo en el detector.

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Los espectrómetros de masas de tiempo de vuelo (TOF) emplean un tubo de vuelo lineal. Después de la
vaporización de la muestra en presencia de una fuente de protones, se aplica brevemente un campo
eléctrico para acelerar los iones hacia un detector al final del tubo de vuelo. Para moléculas de carga
idéntica, la velocidad a la que se aceleran, y por tanto, el tiempo requerido para alcanzar el detector, es
inversamente proporcional a su masa.
Los espectrómetros de masas cuadrupolos se usan por lo general para determinar las masas de moléculas
de 4 000 Da o menos, mientras que los espectrómetros de masas TOF se usan para determinar las grandes
masas de proteínas completas. Varias combinaciones de cuadrupolos múltiples, o reflexión de iones hacia
atrás en el tubo de vuelo lineal de un espectrómetro de masas TOF, se utilizan para crear instrumentos más
sofisticados.
Los péptidos pueden volatilizarse para el análisis mediante ionización por electroespray o
desorción láser asistida por la matriz
El análisis de péptidos y proteínas por parte de la MS inicialmente se vio obstaculizado por las dificultades
para volatilizar estas grandes moléculas orgánicas. Mientras que las pequeñas moléculas orgánicas podrían
vaporizarse fácilmente por calentamiento en una aspiradora (figura 4–9), las proteínas, oligonucleótidos,
etc., se descomponen al calentarse. Sólo cuando se idearon técnicas confiables para dispersar péptidos,
proteínas y otras biomoléculas grandes en la fase de vapor, fue posible aplicar MS para su análisis estructural

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y determinación de la secuencia. Tres métodos comúnmente utilizados para la dispersión en la fase de vapor
son ionización por electroespray, desorción y ionización láser asistida por matriz (MALDI, matrix-assisted
laser desorption and ionization) y bombardeo rápido de átomos (FAB, fast atom bombardment). En la
ionización por electroespray, las moléculas para analizar se disuelven en un disolvente volátil y se introducen
en la cámara de muestra en un flujo pequeño a través de un capilar (figura 4–9). A medida que la gota de
líquido emerge en la cámara de muestra, el solvente se dispersa rápidamente, dejando la macromolécula
suspendida en la fase gaseosa. La sonda cargada sirve para ionizar la muestra. La ionización por
electroespray se usa con frecuencia para analizar péptidos y proteínas a medida que eluyen de una columna
de HPLC u otra columna de cromatografía, ya disuelta en un disolvente volátil. En MALDI, la muestra se
mezcla con una matriz líquida que contiene un tinte que absorbe la luz y una fuente de protones. En la
cámara de muestra, la mezcla se excita utilizando un láser, lo que hace que la matriz circundante se disperse
en la fase de vapor tan rápidamente como para evitar el calentamiento de péptidos o proteínas incrustados
(figura 4–9). En el bombardeo rápido de átomos, las grandes macromoléculas dispersas en glicerol u otra
matriz protónica son bombardeadas por una corriente de átomos neutros, por ejemplo, xenón, que se han
acelerado a una alta velocidad. La ionización “suave” por FAB se aplica con frecuencia para volatilizar
grandes macromoléculas intactas.
FIGURA 4–9
Tres métodos comunes para vaporizar moléculas en la cámara de muestra de un espectrómetro de masas.
Los péptidos dentro del espectrómetro de masas se pueden descomponer en unidades más pequeñas
mediante colisiones con helio neutro o átomos de argón (disociación inducida por colisión) y se determinan
las masas de los fragmentos individuales. Dado que los enlaces peptídicos son mucho más lábiles que los
enlaces carbono-carbono, los fragmentos más abundantes se diferenciarán entre sí por incrementos de uno
o dos aminoácidos. Dado que, con la excepción de (1) leucina e isoleucina y (2) glutamina y lisina, la masa

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molecular de cada aminoácido es única, la secuencia del péptido se puede reconstruir a partir de las masas
de sus fragmentos.
Espectrometría de masas en tándem
Las mezclas de péptidos complejos se pueden analizar, sin purificación previa, mediante MS en tándem, que
emplea el equivalente de dos espectrómetros de masas unidos en serie. Por esta razón, el análisis por
instrumentos en tándem a menudo se denomina MS-MS o MS2. El primer espectrómetro de masas separa los
péptidos individuales en función de sus diferencias en masa. Al ajustar la intensidad de campo del primer
imán se puede dirigir un único péptido al segundo espectrómetro de masas, donde se generan fragmentos y
se determinan sus masas. Alternativamente, pueden mantenerse en una trampa de iones electromagnéticos
localizada entre los dos cuadrupolos y administrarse de modo selectivo al segundo cuadrupolo en lugar de
perderse cuando el primer cuadrupolo se establece para seleccionar iones de una masa diferente.
El MS en tándem se puede utilizar para detectar muestras de sangre de recién nacidos en busca de la
presencia y concentración de aminoácidos, ácidos grasos y otros metabolitos. Las anormalidades en los
niveles de metabolitos pueden servir como indicadores diagnósticos para una variedad de trastornos
genéticos, como la fenilcetonuria, la encefalopatía etilmalónica y la acidemia glutárica tipo 1.
LA PROTEÓMICA Y EL PROTEOMA
El objetivo de la proteómica es identificar el complemento completo de las proteínas
elaboradas por una célula en diversas condiciones
Aunque se conoce la secuencia del genoma humano, la imagen proporcionada por la genómica es estática e
incompleta. A medida que los genes se encienden y apagan, las proteínas se sintetizan en tipos de células
particulares en momentos específicos de crecimiento o diferenciación y en respuesta a estímulos externos.
Las células musculares expresan proteínas no expresadas por las células neuronales, y el tipo de
subunidades presentes en el tetrámero de hemoglobina experimentan cambios antes y después del parto.
Muchas proteínas sufren modificaciones postraduccionales durante la maduración en formas
funcionalmente competentes o como un medio para regular sus propiedades. Con el fin de obtener una
descripción molecular más completa y dinámica de los organismos vivos, los científicos están trabajando
para determinar el proteoma, un término que se refiere a la identidad, abundancia y estado de modificación
de todo el conjunto de proteínas expresado por una célula individual en un momento particular. Dado que el
proteoma de cada célula componente de un organismo es distinto y cambia con el tiempo y las
circunstancias, el último proteoma humano completo constituye un objetivo de tamaño y complejidad
formidables.
La determinación simultánea de cientos de proteínas es técnicamente desafiante
Un objetivo clave de la proteómica es la identificación de proteínas cuyos niveles de expresión o
modificación se correlacionan con eventos médicamente significativos. Además de su potencial como

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indicadores de diagnóstico, estos biomarcadores de proteínas pueden proporcionar pistas importantes
sobre las causas y los mecanismos de una condición o enfermedad fisiológica específica. La proteómica de
primera generación empleó SDS-PAGE o electroforesis bidimensional para analizar las proteínas en una
muestra biológica de otra, seguido de la determinación de la secuencia de aminoácidos de su extremo amino
por el método de Edman. Las identidades se determinaron buscando las secuencias polipeptídicas
disponibles para proteínas que contenían una secuencia N-terminal correspondiente y se predijo que
poseían un Mr similar y, para geles 2D, pI.
Estos primeros esfuerzos se vieron restringidos por el número limitado de secuencias polipeptídicas
disponibles y las dificultades para aislar polipéptidos de los geles en cantidades suficientes para el análisis
de Edman. Los intentos de aumentar el poder de resolución y el rendimiento de la muestra al aumentar el
tamaño de los geles sólo fueron marginalmente exitosos. De manera eventual, el desarrollo de técnicas de
espectrometría de masas proporcionó un medio para la determinación de la secuencia de proteínas cuya
sensibilidad era compatible con los enfoques de separación electroforética.
El conocimiento de la secuencia del genoma del organismo en cuestión facilitó en gran medida la
identificación proporcionando un conjunto completo de secuencias polipeptídicas codificadas por DNA.
También proporcionó los datos de la secuencia de nucleótidos para construir conjuntos de genes, a veces
denominadas chips de DNA, que contienen cientos de distintas sondas de oligonucleótidos. Estos chips
podrían usarse para detectar la presencia de mRNA que contienen secuencias de nucleótidos
complementarias. Aunque los cambios en la expresión del mRNA que codifica una proteína no reflejan
necesariamente cambios comparables en el nivel de la proteína correspondiente, los conjuntos de genes
fueron menos exigentes técnicamente y más sensibles que los enfoques proteómicos de primera generación,
en particular con respecto a proteínas de baja abundancia.
La proteómica de segunda generación acopla las técnicas cromatográficas recientemente desarrolladas con
MS a la nanoescala. Las proteínas en una muestra biológica se tratan primero con una proteasa para
hidrolizarlas en péptidos más pequeños que luego se someten a una cromatografía de fase inversa, de
intercambio iónico o de exclusión por tamaño para distribuir la gran cantidad de péptidos en pequeños
subconjuntos más susceptibles para el análisis. Estos subconjuntos se analizan inyectando el eluyente de la
columna directamente en un cuadrupolo doble o un espectrómetro de masas TOF. La tecnología de
identificación de proteínas multidimensional (MudPIT, multidimensional protein identification technology)
emplea sucesivas rondas de cromatografía para determinar los péptidos producidos a partir de la digestión
de una muestra biológica compleja en varias fracciones más simples que pueden analizarse por separado
por MS.
Hoy en día, la suspensión de mezclas de péptidos complejos dentro del espectrómetro de masas en sí y la
posterior exportación de subconjuntos pequeños para el análisis final, utilizando trampas de iones, a
menudo permite que mezclas incluso complejas sean analizadas directamente por MS sin un
fraccionamiento cromatográfico previo. Los esfuerzos también continúan refinando los métodos para el
análisis de la expresión de mRNA y proteína en células individuales.

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La bioinformática ayuda a la identificación de las funciones de proteínas
Las funciones de una gran proporción de las proteínas codificadas por el genoma humano son desconocidas
en la actualidad. Los esfuerzos continúan desarrollando conjuntos de proteínas o chips para probar
directamente las funciones potenciales de las proteínas en una escala masiva. Sin embargo, aunque algunas
funciones de proteínas son relativamente fáciles de analizar, como la actividad de proteasa o esterasa, otras
son mucho menos tratables. La extracción de datos a través de la bioinformática permite a los investigadores
comparar las secuencias de aminoácidos de proteínas desconocidas con aquellas cuyas funciones que se
han determinado. Esto proporciona un medio para descubrir pistas sobre sus propiedades potenciales,
funciones fisiológicas y mecanismos de acción. Los algoritmos explotan la tendencia de la naturaleza a
emplear variaciones de un tema estructural para realizar funciones similares en varias proteínas [p. ej., el
pliegue de unión al nucleótido de Rossmann para unirse a NAD(P)H, secuencias de dirección nuclear y manos
de EF para unirse a Ca2+]. Estos dominios por lo general se detectan en la estructura primaria mediante la
conservación de aminoácidos particulares en posiciones clave. Por tanto, se puede inferir una comprensión
de las propiedades y el papel fisiológico de una proteína recién descubierta comparando su estructura
primaria con la de las proteínas conocidas.
RESUMEN
Los polímeros o polipéptidos de aminoácidos largos constituyen la unidad estructural básica de las
proteínas, y la estructura de una proteína proporciona una idea de cómo cumple sus funciones.
Las proteínas sufren alteraciones postraduccionales durante su vida que influyen en su función y determinan
su destino.
Al generar un nuevo terminal amino, el reactivo Edman permitió la determinación de segmentos largos de la
secuencia de aminoácidos.
Los geles de poliacrilamida proporcionan una matriz porosa para separar proteínas en función de su
movilidad en un campo eléctrico aplicado de corriente continua.
Es casi constante la proporción a la cual el detergente aniónico SDS se une a proteínas que permiten a SDS-
PAGE separar polipéptidos predominantemente sobre la base del tamaño relativo.
Debido a que la masa es una propiedad universal de todas las biomoléculas y sus derivados, la MS se ha
convertido en una técnica versátil aplicable a la determinación de la estructura primaria, la identificación de
modificaciones postraduccionales y la detección de anomalías metabólicas.
La clonación de DNA junto con la química de proteínas proporcionó un enfoque híbrido que aumentó en
gran medida la velocidad y la eficacia para la determinación de estructuras primarias de proteínas.
La genómica, la determinación de secuencias completas de polinucleótidos, proporciona a los
investigadores un modelo para cada macromolécula genéticamente codificada en un organismo.

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El análisis proteómico utiliza datos genómicos para identificar el complemento completo de proteínas en
una muestra biológica a partir de datos de secuencias de aminoácidos parciales obtenidos mediante el
acoplamiento de proteínas y métodos de separación de péptidos con la secuenciación por MS.
Un objetivo principal de la proteómica es la identificación de proteínas y sus modificaciones
postraduccionales cuya aparición o desaparición se correlaciona con fenómenos fisiológicos, envejecimiento
o enfermedades específicas.
La bioinformática se refiere al desarrollo de algoritmos informáticos diseñados para inferir las propiedades
funcionales de las macromoléculas mediante la comparación de secuencias de proteínas nuevas con otras
cuyas propiedades se conocen.
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