Parámetros cromatográficos en CLAE

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Trabajo Práctico Simulado II.
301102 – Química Analítica e Instrumental
Grupo_21
Elaborado por
Vicky Cárdenas Colorado – Cód. 21533391
Jenny Paola Ortega
Tutora
Universidad Nacional Abierta y a Distancia – UNAD
Escuela de Ciencias Básicas, Tecnología e Ingeniería
Noviembre de 2014

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CONTENIDO
Introducción..........................................................................................................................2
Sección A: ............................................................................................................................4
Factor de separación................................................................................................4
Resolución..................................................................................................................4
Eficiencia....................................................................................................................5
Factor de retención o factor de capacidad: .........................................................6
Tiempo de retención (tR) ..........................................................................................7
Tiempo muerto (tM) ...................................................................................................8
Ancho de banda (sigma total) .................................................................................8
Cromatografía líquida en fase normal ...................................................................8
Cromatografía líquida en fase reversa ..................................................................8
Gradiente de elución ................................................................................................9
Elución isocrática ....................................................................................................10
Sección B: ..........................................................................................................................12
Sección C:..........................................................................................................................28
Conclusiones .....................................................................................................................42
Referencias Bibliográficas ...............................................................................................43

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Desarrollo Práctica Simulador II
Sección A: Reconocimiento de los parámetros cromatográficos en
cromatografía líquida de alta eficiencia (CLAE)
1. Defina y explique cómo se relacionan los siguientes conceptos. Incluya, cuando
corresponda, el símbolo y ecuación que representa al concepto:
 Factor de separación
Define que tan selectiva es una columna para separar dos picos. La
columna puede ser selectiva a una separación, que se identifica por un
valor alto de este factor. El factor de selectividad α de una columna para
dos especies A y B se define como:
𝜶 =
𝑲 𝑩
𝑲 𝑨
𝜶 =
𝑲´ 𝑩
𝑲´ 𝑨
𝜶 =
( 𝒕 𝑹) 𝑩 − 𝒕 𝑴
( 𝒕 𝑹) 𝑨 − 𝒕 𝑴
Donde KB es el coeficiente de distribución para la especie más fuertemente
retenida B, y KA es el coeficiente de distribución para la menos retenida, o
que eluye con más rapidez, la especie A. Según esta definición α siempre
es mayor que la unidad, porque B es el compuesto más retenido (de > tR).
Donde k’B y k’B son los factores de capacidad de B y de A, respectivamente.
 Resolución
Es el parámetro que expresa el grado de separación que se puede obtener
en un sistema cromatográfico para dos componentes dados. Relaciona la

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capacidad separadora de un sistema cromatográfico para dos componentes.
Se define como:
𝑹 𝒔 =
𝒕 𝑹𝑩 − 𝒕 𝑹𝑨
𝟏
𝟐
( 𝒂 𝑨 + 𝒂 𝑩)
Donde Rs es la resolución, tRA y tRB son los tiempos de retención de los
componentes A y B, y aA y aB son las anchuras de los picos del
cromatograma de los anteriores componentes.
La resolución puede observarse directamente sobre el cromatograma de
picos. Se tendrá una buena resolución si los picos no se solapan, y está
perfectamente delimitado cada pico, sin que coincida el final de uno con el
principio del siguiente.
 Eficiencia
Para definir la eficacia se utiliza el concepto de piso teórico, y se define éste
como la sección teórico-transversal en la cual se realiza el equilibrio de
partición durante el flujo de fase móvil. Cuanto mayor se el número de
platos teórico (N) mayor será la eficiencia de la columna.
El número de platos teóricos mide la capacidad de la columna para separar
los componentes, no la retención de los mismos. La eficiencia o el número
de platos se puede observar directamente a partir del cromatograma,
observando la agudeza de los picos.
𝑵 =
𝑳
𝑯
= 𝟏𝟔 (
𝒕´ 𝑹
𝒂𝒊
)
𝟐

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Donde N es el número de platos teóricos, L es la longitud de la
columna, H es la altura de cada plato, t'R es el tiempo corregido de
retención de un componente y ai es la anchura del pico cromatográfico. Y:
𝑯 =
𝑳
𝟏𝟔
(
𝒕´ 𝑹
𝒂𝒊
)
𝟐
Si H tiene un valor pequeño, la distancia entre platos es menor y por tanto la
eficiencia será mayor. Por el contrario, si H es grande la columna es poco
eficiente para separar ese componente ya que sus moléculas estarán muy
difundidas.
La velocidad de la fase móvil influye en la eficiencia del sistema
cromatográfico, ya que si la velocidad es pequeña los componentes tendrán
más tiempo parta que se pueda realizar el equilibrio de reparto, por lo que
el número de platos será mayor y la altura de los platos menor.
 Factor de retención o factor de capacidad:
Es un parámetro que describe la velocidad de migración de los solutos
(analitos) en la columna. Para una especie A, el factor de capacidad k’A se
define como:
𝑲´ʌ =
𝑲ʌ 𝑽 𝑺
𝑽 𝑴
𝑲´ʌ =
𝒕 𝑹 − 𝒕 𝑴
𝒕 𝑴
Donde KA es el coeficiente de distribución de la especie A, VS es el volumen
de la fase estacionaria y VS es el volumen de la fase móvil. Cuando el factor
de capacidad para una especie es mucho menor que la unidad, la elución
tiene lugar tan rápidamente que es difícil determinar con exactitud los
tiempos de retención, estos son demasiado cortos. En cambio cuando el

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factor de retención es del orden de 20 o 30 o tal vez mayor, los tiempos de
retención son excesivamente largos.
 Tiempo de retención (tR)
Tiempo transcurrido desde la introducción de la muestra hasta que el
componente alcanza el detector.
Tiempo de retención de un componente: El tiempo de retención (ti o tR)
es el tiempo transcurrido entre el instante en que se introduce la mezcla y el
instante en que se detecta la señal propia del componente en su máxima
intensidad. Los tiempos de retención no son reproducibles, ni siquiera en
una misma columna cromatografía.
Tiempo de retención corregido de un componente (t'i): Es el tiempo que
transcurre entre la aparición de la señal que corresponde a un componente
inerte y a la del componente considerado:
𝒕´𝒊 = 𝒕𝒊 − 𝒕 𝒐
Tiempo de retención relativa (rip): Es la razón entre los tiempos de
retención corregidos del componente considerado, i, y de otro, p, que se
toma como patrón de referencia:
𝒓𝒊𝒑 =
𝒕´𝒊
𝒕´ 𝒑

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 Tiempo muerto (tM)
Tiempo requerido para que una especie no retenida alcance el detector. Es
el tiempo de migración de la especie no retenida; es el tiempo necesario
para que, por término medio una molécula de la fase móvil pase a través
de la columna.
 Ancho de banda (sigma total)
Corresponde al intervalo de longitudes de onda comprendido entre los
puntos en donde la transmitancia (de la radiación emitida por la fuente y
que llega a la rendija de salida) alcanza la mitad de su máximo de
transmisión o el intervalo de 6 longitudes de onda que contiene el 75% de
la energía radiante que proviene del monocromador. La anchura de banda
se puede expresar en términos de la apertura o amplitud de las rendijas, S,
y la dispersión lineal recíproca del monocromador como:
𝑆𝐵𝑊 = 𝑆. 𝐷 − 1
 Cromatografía líquida en fase normal
Se basa en la hidrofilia y la lipofilia usando una fase estacionaria polar y
una fase móvil menos polar. Así, los compuestos hidrofóbicos eluye más
rápidamente que los hidrofílicos. La fase está constituida por una matriz de
sílica a la que se unen grupos silanol, amino y nitrilo que le confieren
polaridad relativa respecto a la fase móvil.
 Cromatografía líquida en fase reversa
También se basa en la hidrofilia y la lipofilia. La fase estacionaria consiste
en una matriz de sílica empacada que lleva unida covalentemente una

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cadena alquílica de n-carbonos (por ejemplo, C-8 significa que se incorpora
una cadena octil y C-18 una octadecil). La más hidrofóbica es, en este caso,
la fase estacionaria, eluyendo los compuestos hidrofílicos más rápidamente
que los hidrofóbicos, que interaccionan con la fase estacionaria. También
hay empaquetamientos poliméricos alternativos a la sílice que ofrecen
similares características con mayor resistencia dinámica y más amplio
rango de estabilidad de pH. Existen dos variantes de la cromatografía en
fase reversa:
Supresión iónica, se utiliza modificando el pH de la fase móvil para ácidos
y bases débiles, de forma que el analito pasa a ser más lipófilo y se mejora
la separación porque se establece más interacción con la columna.
Formación de pares iónicos, se utiliza para compuestos que tienen
grupos funcionales biológicos que serán unidos a un contraión. El contraión
se asocia al analito y lo desplaza del par iónico normal (corrientemente Na
+
o Cl
-
) mejorando su hidrofobicidad. Para analitos catiónicos se utilizan
grupos alquil o aril sulfonatos y para analitos aniónicos aminas cuaternarias.
 Gradiente de elución
Este tipo de elución se utiliza cuando se tiene una mezcla compleja de
componentes con polaridad diferente.
Los diferentes compuestos son eluidos modificando gradualmente la
composición de la fase móvil durante el transcurso de la cromatografía
(aumentando la fuerza iónica, modificando la polaridad, etc.). El resultado
sobre la elución es un acortamiento de los tiempos de retención, el factor de
retención disminuye conforme aumenta la variación de flujo del gradiente y
el compuesto eluye. Este gradiente puede llevarse a cabo de forma lineal o
escalonada o linealmente escalonada.

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La predicción mediante ecuaciones que describan la separación de
componentes por elución en gradiente es muy compleja, por lo que se parte
de las ecuaciones empleadas para la isocrática y se adaptan casi
empíricamente. La relación del cambio de la composición de la fase móvil
durante el transcurso de la elución en gradiente puede ser descrita por la
pendiente del gradiente como (∆∅/𝑡 𝐺 )dónde (G) simboliza la progresión del
gradiente: 𝐺 =
∆∅
𝑡 𝐺
𝑡0. 𝑠
Siendo (∅) el volumen de fase del modificador, (tG) el tiempo del gradiente,
(S) la pendiente del (ln k') frente a (∅) (o la relación lineal de fuerza del
solvente).
 Tiempo de retención: 𝒕 𝑮 = 𝒕 𝟎. 𝒌̅. 𝐥𝐨𝐠(𝟐, 𝟑 . 𝒌 𝟎/𝒌̅)
 Factor de capacidad: 𝒌̅ =
𝒕 𝑮
∆
∅𝑺𝒕 𝟎 = 𝒕 𝑮 𝑭/∆∅𝑺𝑽 𝒎
 Resolución: 𝑹 = [( 𝟏/𝟒).( 𝜶 − 𝟏)/( 𝜶). 𝑵 𝟏/𝟐
].⌊𝒌̅/(𝟏 + 𝒌̅)⌋
En el caso de que converjan diferentes solutos, los valores de gradientes
(G) para los diferentes solutos no serán idénticos, ya que (G) es
proporcional a (S). Cuando la concentración de gradiente es lineal, el
gradiente (G) es constante durante toda la elución.
 Elución isocrática
Los compuestos eluyen usando una fase móvil de composición constante
durante toda la cromatografía. Todos los compuestos acaban migrando a
través de la columna hasta el final. Sin embargo, cada uno migra con una
velocidad diferente, resultando en una relación de elución más rápida o más
lenta. Este tipo de elución es bastante simple y barato, pero la resolución de

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algunos compuestos es cuestionable y el eluido puede no ser obtenido en
un plazo de tiempo adecuado.
La separación de los compuestos mediante elución isocrática puede
describirse utilizando las siguientes ecuaciones:
 Tiempo de retención: 𝒕 𝑹 = 𝒕 𝒐 . 𝒌´+ 𝒕 𝒐
 Factor de capacidad: 𝒌´ = ( 𝒕 𝑹 − 𝒕 𝒐)/𝒕 𝟎
 Resolución: 𝑹 𝑺 = [(
𝟏
𝟒
). (( 𝜶 − 𝟏)/𝜶)𝑵 𝟏/𝟐
]. [ 𝒌´/( 𝟏 + 𝒌´)]
Fuente: Castillo, A. Castro, F. (2014) Recuperado de http://es.slideshare.net/AdrianCLoa/high-
performance-liquid-chromatography-37260950

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Sección B: Efecto de la estructura de los compuestos (solutos) y de la
composición de la fase móvil sobre la retención y la resolución.
1. Dibuje estructuras de los siguientes compuestos utilizando las convenciones de
cuña/slash representando los ángulos de enlace adecuados:
Nombre
Compuesto
Estructura
molecular
Propiedades Formula
Acetofenona Densidad:
1030 kg/m3;
1,03 g/cm3
Punto de Fusión:
293,15 K (20 °C)
Punto de fusión:
475,15 K (202 °C)
C8H8O1
Benzofenona Apariencia: Sólido
blanco
Densidad:
1110 kg/m3;
1,11 g/cm3
Masa molar:
182.217 g/mol
C13H10O
Butilparabeno
Masa molar: 194.227
g/mol
C11H14O3
Propiofenona Apariencia: líquido
incoloro a amarillo
pálido
Densidad: 1,01
g·cm-3
Punto de Fusión:
18 °C
Masa molar: 134.18
g/mol
C9H10O

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Etilparabeno Masa molar: 166,16
g mol -1
Punto de fusión: 115-
118 ° C
Punto de ebullición:
297-298 ° C
C9H10O3
Propilparabeno Apariencia: sólido
Masa molar: 180,18
g mol -1
Densidad:
01:28 g cm -3 (25 °
C, sólido)
1.063 g cm -3 (102 °
C, líquido)
Punto de fusión:
369,2 K
C10H12O3
Ketoprofeno
Masa molecular:
254.28 g/mol
Punto de fusión: 94 -
97 ºC
C16H14O3
3-nitrofenol
Masa molecular:
139,11 g/mol
194 ° C / 70 mmHg
(Lit).
Punto de fusión: 93-
103 ° C
C6H5NO3
4-nitrofenol Apariencia: Pilares
incoloros o amarillos
Masa molar: 139,11
g mol -1
279 ° C (534 ° F; 552
K)
C6H5NO3

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2. Sobre la base de sus estructuras:
a) Prediga el orden de elución de los compuestos, partiendo del menos al
más retenido en RPLC (Cromatografía líquida en fase reversa). Justifique su
respuesta.
b) ¿Cuáles son los principales usos de cada uno de estos compuestos?
 Acetofenona
Acetofenona comercial puede ser obtenido a partir de benceno con
anhídrido acético o cloruro de acetilo de Friedel-Crafts proceso. Se puede
también obtenerse por medio de una oxidación de etilbenceno ir, como un
subproducto decumeno o de acrilonitrilo.
Se utiliza como un catalizador de polimerización para la fabricación
deolefinas. Se utiliza como producto intermedio para los productos
farmacéuticos, agroquímicos y otros compuestos orgánicos.
También se ha utilizado como una droga para inducir el sueño. Se utiliza en
su gas lacrimógeno (sobre todo en la forma de acetofenona cloro) y la
guerra. Se utiliza como un disolvente de plásticos, resinas, éteres de
celulosa y ésteres. El dímero (dipnone) se utiliza como
plastificante. Actophenone y sus derivados, además de haber sustituido
saturados alquilos, oxigenada grupos alquilo, tioéter grupos, más los grupos
aromáticos, alifáticos insaturados cadenas laterales, y otros grupos
funcionales, son los ingredientes de sabor fragancia en jabones,
detergentes, cosméticos y perfumes y como en los alimentos, bebidas y
tabaco.

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 Benzofenona
Se puede utilizar como un iniciador de foto en aplicaciones de curado UV,
tales como tintas, imágenes, y barnices de acabado en la industria de la
impresión. Benzofenona evita que la luz ultravioleta de los olores nocivos y
los colores en los productos tales como perfumes y jabones. También se
puede añadir a los envases de plástico como un bloqueador de UV. Su uso
permite a los fabricantes para empaquetar el producto en vidrio
transparente o de plástico. Sin ella, sería necesario envases opacos u
oscuros.
En aplicaciones biológicas, benzofenonas se han utilizado ampliamente
como sondas fotofísicas para identificar y mapear las interacciones péptido-
proteína.
 Butilparabeno
El butilparabeno es un polvo cristalino inodoro y incoloro a temperatura
ambiente, muy utilizada como conservante en alimentación, medicina y
cosmética. Lo encontraréis muy a menudo; se utiliza muchísimo en muchos
productos del cuidado de la piel e incluso en medicinas tan comunes como
el ibuprofeno. Es el antifúngico más potente de entre los parabenos. De
hecho, su potencial microbiano es mayor que el del metilparabeno, el
propilparabeno o el etilparabeno. Es particularmente eficaz contra mohos y
levaduras, y menos contra bacterias.
 Propiofenona
Reactivos comunes, productos farmacéuticos, perfumes y la industria de
síntesis orgánica.

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 Etilparabeno
Son utilizados como conservadores protegiendo a los productos de las
levaduras y los hongos. No obstante, no son muy efectivos contra las
bacterias. Su actividad es independiente de la acidez, y adicionalmente, son
poco solubles, lo que limita sus aplicaciones (antimicrobianos y ciertas
propiedades antioxidantes) en formas farmacéuticas liquidas como jarabes,
soluciones, suspensiones e inyectables. Son usados en una gran variedad
de alimentos y cosméticos.
 Propilparabeno
Usa como conservador para cosméticos (es el segundo producto de este
tipo más utilizado) y en combinación con metilparabeno se utiliza en
formulaciones farmacéuticas parentales. Para productos de cuidado para la
piel y comida. Tiene una toxicidad generalmente baja por ingestión. Puede
irritar los ojos, la piel, el tracto intestinal y el respiratorio con el contacto, la
ingestión y la inhalación, respectivamente. También es combustible.
 Ketoprofeno
Es un antiinflamatorio no esteroideo dotado de potente actividad analgésica,
muy eficaz en el tratamiento de enfermedades reumáticas, traumatológicas
y procesos inflamatorios en general. El principio activo ketoprofeno se
utiliza en el tratamiento de la artritis reumatoide, osteoartrosis, espondilitis
anquilosante y episodios agudos de gota.
 3-nitrofenol
Usa principalmente para manufacturar tinturas, pigmentos, productos de
caucho y sustancias funguicidas.

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 4-nitrofenol
Es usado principalmente en la manufactura de medicamentos, fungicidas,
tinturas y para oscurecer el cuero. Es un producto de la degradación de
plaguicidas como el paratión y el fluoridifen. Puede producir enfermedades
de la sangre. Los fenómenos observados en personas por inhalación del
4‐nitrofenol son sensación de quemazón, vértigo y debilidad. La inhalación
en altas concentraciones puede originar un aumento del metabolismo.
También puede absorberse por la piel. En contacto con los ojos produce
enrojecimiento y dolor.
3. Abra el HPLC simulator (http://www.hplcsimulator.org/ ).
4. Configure el simulador así:

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c) Posteriormente, registre para cada compuesto: el tiempo de retención (tR),
el factor de retención (k’) y el ancho de banda (sigma total). Adjunte una
imagen del cromatograma obtenido.
Compuesto Conc.(𝝁𝑴) Tiempo de
retención (tR)
factor de
retención (k’)
Ancho de banda
(sigmatotal)
3-nitrofenol 20,0 1,3493 1,5371 0,7562
Acetofenona 30,0 1,3431 1,5254 0,7528
Etilparabeno 30,0 2,007 2,7739 1,1154
Benzofenona 40,0 6,6901 11,5799 3,6941
Butilparabeno 50,0 7,494 13,0915 4,1375
Propilparabeno 50,0 3,8315 6,2047 2,1185
4-nitrofenol 50,0 1,2619 1,3728 0,7088
Propiofenona 60,0 2,4337 3,5762 1,3495
Ketoprofeno 100,0 3,5642 5,702 1,9712

19
Acetofenona
Benzofenona
Butilparabeno
Propiofenona

20
Etilparabeno
Propilparabeno
Ketoprofeno
3-nitrofenol

21
4-nitrofenol
d) Calcule el tiempo muerto (tM o t0).
5. Cambie la composición de la fase móvil de metanol a acetonitrilo:
e) Posteriormente, registre para cada compuesto: el tiempo de retención (tR),
el factor de retención (k’) y el ancho de banda (sigma total), obtenidos con el
cambio de disolvente. Adjunte una imagen del cromatograma obtenido.

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Compuesto Conc.(𝝁𝑴) Tiempo de
retención (tR)
factor de
retención (k’)
Ancho de banda
(sigmatotal)
3-nitrofenol 20,0 0,4345 0,7629 0,385
Acetofenona 30,0 0,5208 0,8088 0,4055
Etilparabeno 30,0 0,4012 0,7452 0,3771
Benzofenona 40,0 3,6878 2,493 1,1888
Butilparabeno 50,0 2,0296 1,6112 0,7749
Propilparabeno 50,0 0,9498 1,0369 0,5089
4-nitrofenol 50,0 0,376 0,7317 0,3711
Propiofenona 60,0 1,3452 1,2472 0,6056
Ketoprofeno 100,0 1,0948 1,114 0,5442

23
Acetofenona
Benzofenona
Butilparabeno
Propiofenona

24
Etilparabeno
Propilparabeno
Ketoprofeno
3-nitrofenol

25
4-nitrofenol
f) Explique por qué se da el cambio en los tiempos de retención y en la
separación de los compuestos cuando el metanol es sustituido por el
acetonitrilo. ¿En qué caso se obtiene una mejor separación?
El mecanismo de separación en cromatografía de fase reversa se basa en la
distribución del soluto entre la fase móvil y la estacionaria. La elución o el arrastre
del soluto mediante la fase móvil, se inicia con un eluyente de elevada polaridad
como es el caso de una solución acuosa; a esta fase móvil inicial se le denomina
fase A. Hay que tomar en cuenta que la polaridad de la fase móvil A debe ser
suficientemente baja como para disolver al soluto de carácter hidrofóbico y
suficientemente alta como para permitir que el soluto se una a la matriz hidrofóbica.
Para lograr la desorción secuencial de los solutos unidos a la matriz, se disminuye
la polaridad de la fase móvil. Esto se hace mediante la adición gradual de
solventes orgánicos a la fase móvil A como son el metanol o el acetonitrilo. La fase
móvil final, denominada fase B, es la que presenta menor polaridad y tiene el
mayor poder de elución. La fuerza del solvente está definida cuantitativamente por
el parámetro εº. (Tabla 1)

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Fuente: Esquivel, E. (2004). Cromatografía de Fase Reversa. Recuperado de
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/cromatografia_de_fase_reversa.pdf
Falta justificar
g) ¿Cuál es la importancia del agua en la composición de la fase móvil?
El agua es un compuesto de alta polaridad que se adsorberá fuertemente sobre la
superficie, evitando la adsorción de los solutos, por lo que estos no se retendrán.
La presencia de moléculas de agua en la fase móvil conduce a una desactivación
de la superficie de la fase estacionaria.
El agua es el disolvente menos fuerte para la elución de solutos en cromatografía
de la fase reversa, dando origen a tiempos de retención muy elevados.

27
h) Calcule la diferencia en los cambios de energía libre (ΔΔG) para la
retención de los solutos en las fases móviles MeOH/Agua, 50/50 y ACN/Agua,
50/50, de acuerdo con:
i) ¿Cuáles solutos poseen las diferencias más grandes y más pequeñas en la
energía libre asociada a la retención comparando las fases móviles
MeOH/Agua (50/50) y ACN/Agua (50/50)? Explique la naturaleza de esos
cambios.
j) Con los hallazgos realizados hasta ahora, elabore una conclusión sobre el
efecto de la estructura de los solutos y la composición de la fase móvil sobre
la retención y la resolución.

28
Sección C: Efecto del porcentaje del modificador en la composición de la
fase móvil sobre la retención y la resolución.
a) Registre el tiempo de retención, el factor de retención y el sigma total
para los dos compuestos. Adjunte una imagen del cromatograma
obtenido.
Revisando la información de la gráfica obtenemos los siguientes datos:
𝑡 𝑅𝐴 = 1,185 𝑚𝑖𝑛
𝑘 𝐴
′
= 0,0516
𝜎 𝑇𝐴 = 0,5485 𝑠
𝑡 𝑅𝐵 = 1,196 𝑚𝑖𝑛
𝑘 𝐵
′
= 0,0526
𝜎 𝑇𝐵 = 0,5490 𝑠

29
b) Calcule el tiempo muerto.
Usamos la siguiente ecuación:
𝑘′
=
𝑡 𝑅 − 𝑡 𝑚
𝑡 𝑚
𝑘′
∗ 𝑡 𝑚 = 𝑡 𝑅 − 𝑡 𝑚
𝑘′
∗ 𝑡 𝑚 + 𝑡 𝑚 = 𝑡 𝑅
(𝑘′
+ 1) ∗ 𝑡 𝑚 = 𝑡 𝑅
𝑡 𝑚 =
𝑡 𝑅
𝑘′ + 1
𝑡 𝑚𝐴 =
1,185 𝑚𝑖𝑛
0,0516 + 1
𝑡 𝑚𝐴 = 1,127 𝑚𝑖𝑛
𝑡 𝑚𝐵 =
1,196 𝑚𝑖𝑛
0,0526 + 1
𝑡 𝑚𝐵 = 1,136 𝑚𝑖𝑛
c) Calcule la resolución, α, para los dos compuestos.
Calculamos la retención relativa o selectividad α mediante la siguiente
ecuación:
𝛼 =
𝑡 𝑅𝐵 − 𝑡 𝑚𝐵
𝑡 𝑅𝐴 − 𝑡 𝑚𝐴
𝛼 =
1,196 − 1,136
1,185 − 1,127
=
0,06
0,058
𝛼 = 1,0345

30
Calculamos la resolución mediante la siguiente ecuación:
𝑅 𝑠 = (2∆𝑡 𝑅)/( 𝑤𝐴 + 𝑤 𝐵)
Dónde:
∆𝑡 𝑅 = 𝑡 𝑅𝐵 − 𝑡 𝑅𝐴 = 1,196 𝑚𝑖𝑛 − 1,185 𝑚𝑖𝑛 = 0,011 𝑚𝑖𝑛 = 0,66 𝑠
𝑤𝐴 = 4𝜎 𝑇𝐴 = 4 ∗ 0,5485 𝑠 = 2,194 𝑠
𝑤 𝐵 = 4𝜎 𝑇𝐵 = 4 ∗ 0,5490 = 2,196 𝑠
Sustituyendo los valores obtenidos calculamos 𝑅 𝑠
𝑅 𝑠 = (2 ∗ 0,66 𝑠)/(2,194 𝑠 + 2,196 𝑠)
𝑅 𝑠 = 0,3
3. Cambie gradualmente el porcentaje de metanol en intervalos de 10%
iniciando en 95% y terminando en 5% (95%, 85%, 75%, …, 5%). ¡Para cada
una de las composiciones obtenidas!:
d) Registre el tiempo de retención, el factor de retención y el sigma total para
los dos compuestos. Adjunte una imagen del cromatograma obtenido.
Porcentaje de metanol (85%):

31
De la gráfica obtenemos los siguientes datos:
𝑡 𝑅𝐴 = 1,1802 𝑚𝑖𝑛
𝑘 𝐴
′
= 0,1096
𝜎 𝑇𝐴 = 0,5654 𝑠
𝑡 𝑅𝐵 = 1,1987 𝑚𝑖𝑛
𝑘 𝐵
′
= 0,1270
𝜎 𝑇𝐵 = 0,5739 𝑠

32
𝑡 𝑅𝐴 = 1,3109 𝑚𝑖𝑛
𝑘 𝐴
′
= 0,2325
𝜎 𝑇𝐴 = 0,6243 𝑠
𝑡 𝑅𝐵 = 1,3897 𝑚𝑖𝑛
𝑘 𝐵
′
= 0,3066
𝜎 𝑇𝐵 = 0,6601 𝑠

33
𝑡 𝑅𝐴 = 1,5885 𝑚𝑖𝑛
𝑘 𝐴
′
= 0,4935
𝜎 𝑇𝐴 = 0,7571 𝑠
𝑡 𝑅𝐵 = 1,8506 𝑚𝑖𝑛
𝑘 𝐵
′
= 0,7399
𝜎 𝑇𝐵 = 0,8785 𝑠

34
𝑡 𝑅𝐴 = 2,1774 𝑚𝑖𝑛
𝑘 𝐴
′
= 1,0472
𝜎 𝑇𝐴 = 1,0401 𝑠
𝑡 𝑅𝐵 = 2,9628 𝑚𝑖𝑛
𝑘 𝐵
′
= 1,7856
𝜎 𝑇𝐵 = 1,4101 𝑠

35
𝑡 𝑅𝐴 = 3,4272 𝑚𝑖𝑛
𝑘 𝐴
′
= 2,2222
𝜎 𝑇𝐴 = 1,6380 𝑠
𝑡 𝑅𝐵 = 5,6471 𝑚𝑖𝑛
𝑘 𝐵
′
= 4,3094
𝜎 𝑇𝐵 = 2,6934 𝑠

36
𝑡 𝑅𝐴 = 6,0793 𝑚𝑖𝑛
𝑘 𝐴
′
= 4,7157
𝜎 𝑇𝐴 = 2,8960 𝑠
𝑡 𝑅𝐵 = 12,1254 𝑚𝑖𝑛
𝑘 𝐵
′
= 10,4002
𝜎 𝑇𝐵 = 5,7717 𝑠

37
𝑡 𝑅𝐴 = 11,7073 𝑚𝑖𝑛
𝑘 𝐴
′
= 10,0070
𝜎 𝑇𝐴 = 5,5334 𝑠
𝑡 𝑅𝐵 = 27,7601 𝑚𝑖𝑛
𝑘 𝐵
′
= 25,0997
𝜎 𝑇𝐵 = 13,1177 𝑠

38
𝑡 𝑅𝐴 = 23,6504 𝑚𝑖𝑛
𝑘 𝐴
′
= 21,2358
𝜎 𝑇𝐴 = 11,0663 𝑠
𝑡 𝑅𝐵 = 65,4928 𝑚𝑖𝑛
𝑘 𝐵
′
= 60,5755
𝜎 𝑇𝐵 = 30,6429 𝑠

39
𝑡 𝑅𝐴 = 48,9946 𝑚𝑖𝑛
𝑘 𝐴
′
= 45,0642
𝜎 𝑇𝐴 = 22,7749 𝑠
𝑡 𝑅𝐵 = 156,5566 𝑚𝑖𝑛
𝑘 𝐵
′
= 146,1926
𝜎 𝑇𝐵 = 72,7735 𝑠

40
A continuación se presentan dos tablas donde se resumen el tiempo de retención,
el factor de retención y sigma total para los dos compuestos:
Acetofenona (Compuesto A)
Porcentaje
Metanol
(% V/V)
Tiempo retención
(min)
Factor de
retención
Sigma total
(s)
95 1,185 0,0516 0,5485
85 1,1802 0,1096 0,5654
75 1,3109 0,2325 0,6243
65 1,5885 0,4935 0,7571
55 2,1774 1,0472 1,0401
45 3,4272 2,2222 1,6380
35 6,0793 4,7157 2,8960
25 11,7073 10,0070 5,5334
15 23,6504 21,2358 11,0663
5 48,9946 45,0642 22,7749
Etilparabeno (Compuesto B)
Porcentaje
Metanol
(% V/V)
Tiempo retención
(min)
Factor de
retención
Sigma total
(s)
95 1,196 0,0526 0,5490
85 1,1987 0,1270 0,5739
75 1,3897 0,3066 0,6601
65 1,8506 0,7399 0,8785
55 2,9628 1,7856 1,4101
45 5,6471 4,3094 2,6934
35 12,1254 10,4002 5,7717
25 27,7601 25,0997 13,1177
15 65,4928 60,5755 30,6429
5 156,5566 146,1926 72,7735

41
e) Calcule el tiempo muerto.
f) Calcule la resolución, α, para los dos compuestos.
4. Repita el mismo proceso cambiando el metanol por acetonitrilo.
5. Con los hallazgos realizados en esta sección, elabore una conclusión
sobre el efecto del porcentaje del modificador en la composición de la fase
móvil sobre la retención y la resolución. Si fuera contratado en un
laboratorio para separar, por medio de cromatografía líquida, de una mezcla
los compuestos acetofenona y etilparabeno ¿cuál sería la mejor
composición de fase móvil a emplear? Justifique su respuesta.

43
Referencias Bibliográficas
Rincón, S. (2013). Acetofenona. Recuperado de
http://es.scribd.com/doc/123401090/Acetofenona
E-Centro. (2014). Benzofenona, Utiliza, Síntesis, La química orgánica. Recuperado de
http://centrodeartigo.com/articulos-utiles/article_100005.html
Rebeautys (2014). Butilparabeno o Butylparaben. Recuperado de
http://rebeautys.com/2013/04/22/butilparabeno-borrador/
Comité de Medicamentos de la Asociación Española de Pediatría. Pediamécum.
Edición 2012. Ketoprofeno. Recuperado de http://pediamecum.es/wp-
content/farmacos/Ketoprofeno.pdf
Alcazares, J. (2009). Disminución del contenido en p-nitrofenol de disoluciones
acuosas mediante membranas líquidas en emulsión utilizando un mecanismode
transporte facilitado tipo I. Recuperado de
http://repositorio.bib.upct.es/dspace/bitstream/10317/1775/1/pfm67.pdf
Cosmos Online (2014). Información Técnica y Comercial del Propilparabeno.
Recuperado de http://www.cosmos.com.mx/wiki/3tvf/propilparabeno
http://www.med.ufro.cl/Recursos/Bioquimica-
offline/Apuntes/clinica1/espectrofotometria_imp.pdf

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