Esta es una presentación sobre las adaptaciones de los artrópodos hematófagos contra la toxicidad del hemo

1. Adaptaciones de los artrópodos
hematófagos contra la toxicidad
del hemo
Ana Elvira Farfán García

2.  Agregación del hemo
 Enzimas antioxidantes
 Proteínas de unión al hemo
 Antioxidantes de bajo peso molecular
 Degradación del hemo
 Efectos regulatorios del hemo
 Relación hospedero-parásito y toxicidad del hemo
CONTENIDO

3. INTRODUCCION
 Artrópodos son los más exitosos del grupo de los metazoa
 Gran diversidad genética: 14.000 especies en 400 géneros
diferentes han desarrollado la capacidad de alimentarse sobre
vertebrados
 Evolución a partir del escenario cretáceo (65 millones de años)
en paralelo con la división de mamíferos y aves
 Ancestros de los modernos hematófagos tenían precondiciones
para la hematofagia

4.  Pre-adaptaciones hematofágicas
– Ecológicas: Convivencia con vertebrados
– Morfológicas: boca: estructuras para cortar y perforar
– Fisiológicas: contra la respuesta del hospedero vertebrado
en la picadura (homeostasis, inmunidad, inflamación).
Intestino: morfología, excreción agua, actividad hemolítica y
actividad de proteinasas
 La mayoría de los insectos hematófagos ingieren
cantidades elevadas de sangre en una única
alimentación
– Mosquitos y triatominos ingieren entre 3-10 veces el peso de su
cuerpo, garrapatas (100)

5.  La hemoglobina (Hb), la proteína más abundante en la sangre de
los mamíferos, alcanza concentraciones hasta de 150 mg/ml
(corresponde al 60% de las proteínas de la sangre).
 Su degradación en el sistema digestivo del artrópodo liberará altas
concentraciones de hemo, el grupo prostético de la Hb. Los otros
péptidos libres son útiles para modular procesos metabólicos.
 En los artrópodos hematófagos varios mecanismos son utilizados
para contrarrestar la toxicidad de los radicales libres producidos
por el hemo.
 En eucariotas superiores, se conocen proteínas que se unen al
hemo: ferritina, transferrina, haptoglobina y hemopexina, las
cuales evitan la formación de radicales libres tóxicos.

6. Hemoglobina
 Transporte de oxígeno
 Fuente de péptidos
 Hemo se une de forma no
covalente en una hendidura
hidrófoba

7. Hemo
Molécula forma da por
Protopororfirina IX y Fe+2.
Grupo prostético de
mioglobina, hemoglobina
y citocromos

8. Hierro ferroso (Fe+2),
coordinación
Octaédrica-6
ligandos-
4 ocupados por el N.
El 5º lo ocupa la
histidina 64
En la desoxiHb el
otro lugar lo
ocupa el H2O
En el entorno
hidrófobo el hierro no
se oxida con facilidad
Protoporfirina
IX
O2
Fe+2

9. Ruta succinato-glicina. Glicina + Succinil CoA: Biosíntesis del grupo hemo
Citosol
Mitocondria
2
2
decarboxilasa
deshidrogenasa

10. Formación de
radicales libres
tóxicos
o
Transportado por
la ferritina
(reciclaje)
Degradación del hemo
Su degradación por una oxidasa,
produce biliverdina, CO y Fe+2
Hemo oxigenasa

11.  Hemo: molécula tóxica especies reactivas de oxígeno
(ROS). Asociados a degradación de
proteínas, lípidos, carbohidratos y DNA
 Implicaciones en la lisis de Trypanosoma brucei (Meshnick et
al., 1977), Plasmodium 10uM hemo al medio de cultivo (Orjih et
al., 1981)
 de estrés oxidativo o denaturación natural de la Hb, inhibe
crecimiento de Plasmodium: anemia de células
falciformes, deficiencia de G6PDH
 Cloroquina se une al hemo la agregación del hemo en
hemozoina (Hz)
 Mamíferos daño oxidativo del
LDL, hemólisis, arterioesclerosis
Bases moleculares de la
toxicidad del hemo
Gutteridge and Smith, 1988; Schmitt et al., 1993; Kalyanaraman et al., 1983

12. Hemo promueve la formación de radicales
libres que conducen a la oxidación de lípidos
OHº: Radicales
hidroxilo
RH: Acidos
grasos
insaturados
Rº: radical alquil
ROOH:
Hidroperóxidos
orgánicos poco
reactivos
ROº: Radicales
alcoxil altamente
reactivos
ROOº: Radicales
peroxil altamente
reactivos
1
2
3
Hemo libre, en solución o unido a Hb
Sadrzadeh et al., 1984; Gutteridge and Smith, 1988; Schmitt et al., 1993; Kalyanaraman et al., 1983

13.  Deterioro en la organización ultraestructural
de las membranas celulares: disminución de
fluidez, permeabilidad, inactivación de
receptores y enzimas
 El daño oxidativo del hemo en las
membranas fosfolipídicas es máximo en el
rango de 50-100uM
 La formación de superóxidos pueden ser
iniciados por NADPH oxidasa o por la
respiración mitocondrial los cuales amplian la
cadena de radicales libres

14. Radical superóxido O2
- es formado (Q), dona electrones al O2. Glutatión
reducido dona electrones para la reducción del H2O2 y oxida residuos
Cys -S-S en proteínas. Reacciones azules (defensa).

15. Estrategias de defensa de los
organismos hematófagos
contra la toxicidad del hemo

16. 1. Agregación del hemo
Proteólisis desestabiiza
la estructura terciaria
Hemoglobina
Hemo
Inserción en sitios hidrofóbicos
de bicapas fosfolipídicas o en
bolsillos expuestos de proteínas
Mantenerse en el exterior en
solución formando agregados.
Reduce la formación de radicales
Baja solubilidad en
soluciones acuosas
Slater et al., 1991; Francis et al., 1997; Oliveira et al., 1999,2000 a-b, 2004,2005,2007; Pagola et al., 2000

17. Hemozoína
 Dímeros de hemo unidos por puentes
de hierro-carboxilato (solubles en NaOH
0.1M). Estos interactúan con otros
dímeros a través de puentes de
hidrógeno entre las cadenas de
propionato del anillo porfirínico
 Varios organismos hematófagos hacen
uso de esta estrategia para disponer de
manera eficiente grandes cantidades de
hemo y reducir la producción de
radicales libres
 Se forma en condiciones ácidas pH<5.0
 Se consideró único por mucho tiempo
en Plasmodium (Brown, 1911).
Actualmente es reconocida en Rhodnius
prolixus (Oliveira et al, 1999),
Schistosoma mansoni (Oliveira et al.,
2000b), Haemoproteus columbae
(Chen et al., 2001)

18. Hemozoína en Plasmodium
Utiliza 80% de la Hb del eritrocito
Más del 95% del Fe está en la hemozoína
En malaria severa con 20% de parasitemia, el consumo de Hb
puede llegar a 100gr
¿Hemopolimerasa?¿Proceso autocatalítico?¿Asociación con
fracciones lipídicas de la membrana vacuolar?
Vacuola digestiva
pH ácido. Electromicrografía
Goldberg et al., 1990; Egan et al., 2000

19. Hemozoína en Rhodnius prolixus
Asociada a las
membranas
Intestinales
perimicro-
villares.
Membranas
fosfolipídicas
extracelulares
que separan las
células epiteliales
intestinales del
contenido.
Contiene 70% del
hemo intestinal
Medio
Hidrofóbico
Microscopía de transmisión
electrónica TEM intestino
coloreado con uranil acetato
TEM intestino no coloreado
PMV
0.6 um 0.6 um

20. Hemozoína de R. prolixus. Microanálisis
de cristales por Rayos X
Análisis espectroscópico
FITR. Espectrofotómetro
de transmisión infraroja de Fourier

21. Cristales de hemozoína (Hz) de R. prolixus. Microscopía electrónica de
emisión de campo

22. Aedes aegypti
 Asociación con la matriz
peritrófica (capa extracelular
con compleja composición
de proteínas y polisacáridos)
 Solubilidad del hemo a pH
neutro o débilmente alcalino
(tracto digestivo)
 Agregados de hemo no
cristalinos insolubles
 Espectro diferente a Hz

23. La matriz peritrófica (PM)
es una capa acelular que
separa el material ingerido
del epitelio absortivo/secretorio
Intestinal
Producida por todas las
células epiteliales del intestino
en respuesta a la alimentación
sanguínea
Microscopía de luz: Sección
Intestino. 20 h después de la
alimentación

24. Microscopía de luz,
coloración peroxidasa,
DAB/azul de toluidina.
Localización de la
actividad peroxidasa
del hemo en el intestino
A. 11 horas post alim.
B. 22 h
C. 30 h
D. 48 h
E. Control 12 h
F. Control 30 h

25. Boophilus microplus: hemosoma
Digestión intracelular de la hemoglobina en
vacuolas de la célula digestiva (endocitosis
mediada por receptores)
Luego el hemo es transferido al hemosoma
agregados no cristalinos de 40nm. Espectro
diferente al de la Hz

26. Células digestivas después del tercer día de la alimentación, aisladas y observadas por
microscopia de contraste de interferencia diferencial (DIC). (A) Células digestivas separadas
del intestino. Flechas muestran el sitio de adhesión al epitelio intestinal. Escala 55·um. (B)
Células digestivas, a mayor magnificación. Los hemosomas están concentrados en el área
perinuclear (flechas). Asteriscos indican vacuolas digestivas. Escala 5·um. NU, núcleo.

27. Actividad hemoperoxidasa (DAB) en el intestino de la garrapata
BC: célula basofílica
DC: célula digestiva
BL: Base de la membrana

28. Hemoxisomas: nuevas estructuras en
Rhodnius prolixus
 Lugar en donde se almacena hierro cuando
hay pocos elementos nutricionales disponibles
en el lumen del intestino
 Presentes en las células epiteliales del
intestino posterior, rodeadas por RER
 El hemo presente en estas estructuras
procede el pool de hemo que no se agregó
en forma de hemozoína
 Aspecto granular (electro-denso), contenidos
dentro de una membrana
 R. prolixus sintetiza su propio hemo ya que en
las hembras el hemo exógeno no es suficiente
para la oogénesis
(Silva et al., 2006; Braz et al., 2001)

29. 2. Enzimas antioxidantes
 Superóxidos dismutasas (SOD) de Cu, Zn o Mn
(citoplasma y matriz mitocondrial)
O2
- + O2
- +2H+ H2O2+O2
 Catalasas
2H2O2 2H2O +O2
 Glutatión peroxidasa (GPx)
2GSH + H2O2 GSSG + 2H2O
 Glutatión reductasa (GR)
GSSG + NADPH +H+ 2GSH + NADP +
 Anopheles
gambiae
 Aedes aegypti
 Rhodnius
prolixus
Glutatión reducido Glutatión oxidado

30. Tioredoxina reductasa (TrxR)
Anopheles gambiae
Aedes aegypti

31. Ferritina
– Acción preventiva antioxidante
– Poderoso quelante del hierro
– Mayor proteína de unión al hierro
intracelular
– Ampliamente distribuida en los tejidos
de los insectos, incluso en la hemolinfa

32. 3. Proteínas de unión al hemo
 Son utilizadas para las pequeñas cantidades de hemo
que alcanza la hemolinfa
 Se han observado en R. prolixus y en Boophilus
 Controlan la peligrosa reactividad del grupo hemo libre y
atenúan su toxicidad
 Evitan la peroxidación lipídica cuando el hemo está
unido a ellas
RHBP
Proteína de unión al hemo de
Rhodnius
HeLp
Hemolipoproteína de las
garrapatas
Dansa-Petretski et al., 1995; Oliveira et al, 1995;
Paiva-Silva et al., 2002; Braz et al., 2002
Maya-Monteiro et al., 2004

33. RHBP
– Hemolinfa de R. prolixus
– Proteína monomérica 12
Kda
– Une una única molécula de
hemo (similar a la
hemopexina de
vertebrados)
– Inhibe la peroxidación
lipídica
– Transporte de lípidos
interórganos
– Es regulada por las
concentraciones de hemo
HeLp
– Garrapatas
– 354 Kda
– 2 apoproteínas de 103 y 92 Kda
33% lípidos, Carbohidratos <
– Une hasta 6 hemo
– Pertenece grupo de
lipoproteínas de alta densidad
– Transportador de hemo
interórganos para su
reutilización
– Hemosoma

34. 4. Antioxidantes de bajo peso
molecular
 Son co-sustratos en reacciones detoxificantes:
urato, glutatión, ascorbato
 Radicales recolectores que convierten especies
reactivas en componentes menos peligrosos
 Se han encontrado en baja cantidad en hemolinfa de
R. prolixus y en garrapatas
 Urato en insectos: es producido en las células
grasas. Secuestrado por los túbulos de Malpighi
(orina). En R. prolixus su nivel es 10 veces más alto
que en el plasma humano
Graca-Souza et al., 1999

35. 5. Degradación del hemo
 Degradación enzimática por la vía de HO (hemo-
oxigenasa) microsomal:
– R. prolixus y Aedes aegypti. La biliverdina se asocia a a.a,
lo cual aumenta su solubilidad para la excreción
– Biliverdina relacionada con los pigmentos de los insectos y
tiene propiedades antioxidantes
– Protección contra el daño oxidativo generado por la luz
Hemo Derivados de biliverdina + CO + Fe+2 Ferritina
HO
La degradación del hemo es
protectora, sólo cuando el Fe
es eficientemente removido por
la ferritina
Oliveira et al., 2006

37. 6. Efectos regulatorios del grupo
hemo
 Regula importantes procesos fisiológicos
– Proliferación celular
– Diferenciación
– Apoptosis
– Modulan la respuesta inmune innata por sus
productos en la degradación (biliverdina, CO -anti-
inflamatorio-)
– Biliverdina, CO y Hierro regulan la expresión de
genes

38. 7. Relación hospedero-parásito y
toxicidad del hemo
 Los parásitos deben contrarrestar los
efectos tóxicos de las altas
concentraciones de hemo y el estrés
oxidativo
 Evidencia de respuesta inmune de tipo
inflamatorio

39. Ciclo biológico de Trypanosoma cruzi
en el vector

40. Factores presentes en el intestino del
vector
Entrada T. cruzi al intestino
del vector
Alimentación sanguínea del
vector
Factores
fisiológicos
Factores
bioquímicos
Factor
hemólítico, CP, lis, péptid
os derivados de alfa-D-
globina y lectinas
Competencia del
parásito por nutrientes
disminuye su población
Factores sistema
inmune humoral
Defensina A: antimicrob
péptido:cuerpo
graso, intestino

41. Influencia del control neuroendocrino en el desarrollo
de T. cruzi en el intestino del vector.
PTTH -Hormona protoracicotrópica

42. Gonzalez et al., 2006; Garcia et al., 2007

43. Conclusiones y perspectivas
 El efecto deletéreo del hemo ha ejercido una fuerza
en la evolución de los artrópodos hematófagos
 Adaptaciones contra la toxicidad del grupo hemo
también son compartidas por otros animales no
hematófagos, con gran distancia filogenética
 El origen polifilético de los hábitos de alimentación
sanguínea en los diferentes grupos de artrópodos ha
generado gran diversidad en la naturaleza molecular
de los mecanismos protectores

44.  Todos estos mecanismos de una u otra forma
pueden modular la inmunidad innata en los
insectos, que puede constituir un papel importante
para la interacción vector-parásito
 El conocimiento de los mecanismos que involucran la
toxicidad del hemo, orientan el diseño de posibles
estrategias para el control de los vectores
 Se amplia el conocimiento de la biología vectorial y
su relación con el parásito

45.  Estos estudios podrían conducir al
descubrimiento de blancos para el diseño de
medicamentos, vacunas y estrategias de
control vectorial
 Permitirían el desarrollo de insecticidas
altamente específicos y/o la manipulación
de la habilidad de los vectores para transmitir
parásitos

46. GRACIAS