1. La importancia de la replicación del ADN
REPLICACIÓN en la medicina
La replicación del material genético es
Propiedades generales esencial a la vida
del proceso de mitosis
replicación
Errores en la replicación son el origen de las
Biosíntesis del ADN enfermedades hereditarias
meiosis
El mecanismo de la
replicación
Errores en la replicación son causa primaria
La maquinaria de la de canceres
replicación
La Replicación en Existen patologías por incapacidad de
Eucariotas reparar errores cometidos en la replicación
Telómeros y mitosis
Telomerasas Los patógenos tambien replican. Entender
Transcriptasas Reversas estos procesos permite establecer terapias
especificas
Muchos antibioticos inhiben la replicación
de microorganismos
1 2
El experimento de Meselson y Stahl
Tres posibles modelos de replicación
•La replicación es semiconservativa
•Cada hebra se usa como molde para sinte tizar otra
• Los nucleótidos se unen por complementariedad
• Se sintetiza una cadena nueva a partir de cada hebra vieja
• Se respeta la disposición antiparalela de las hebras
3 4

2. Direccionalidad de la replicación Origenes, burbujas y horquillas de replicación
Origenes,
La replicación se inicia en sitios
particulares (orígenes de replicación)
Cada origen define un replicón
(unidad de replicación independiente)
A partir de cada origen la replicación
avanza bidireccionalmente
Se forma una burbuja de replicación
formada por dos horquillas que
avanzan en direcciones opuestas
horquilla 1 horquilla 2
5 6
Replicación de ADN circular y lineal Replicones simples o múltiples
1. Theta Cromosoma bacteriano 3. Lineal Cromosoma eucariota
2. Círculo rodante Bacteriófagos
7 8

3. Reacción de Síntesis
La replicación es semidiscontinua
Todas las polimerasas catalizan la elongación de cadena in dirección 5´-3´
Las dos hebras están orientadas en dirección antiparalela
Solo una hebra avanza continuamente leyendo una hebra molde en
dirección 3´ 5´
La hebra complementaria se debe sintetizar en fragmentos discontinuos
En la síntesis de la nueva
cadena se generan:
• enlaces fosfodiester
(covalentes)
• puentes de H
entre las bases
complementarias
9 La síntesis ocurre en dirección 5´ 3´ 10
La hebra retrasada se
sintetiza en fragmentos
de Okazaki
La replicación es
semi-discontinua
semi-
11 12

4. La replicación es un proceso complejo
El mecanismo de la replicación
Señales:
Ori C
INICIACION
Ter
Reconocimiento de origenes de replicación
separación de hebras
Enzimas principales:
Posicionamiento de maquinaria transcripcional
ELONGACION
ADN polimerasas
Crecimiento bidireccional de las horquillas de
Primasas
replicación
Ligasas Replicación semiconservativa, semidiscontinua,
Helicasas coordinada
Topoisomerasas TERMINACION
Reconocimiento de señales de terminación
Desensamble de replisomas
Mapa de genes involucrados con la replicación y reparación en E. coli
13 14
Inicio de la replicación en procariotas:
Separacíon de las hebras Ensamblaje del replisoma
Proteína DnaA
Proteína DnaA se une a
Repetidos 13 pb ricos en AT
Repetidos 9 pb AND superenrrollado en
OriC.
Genera tensión disociando
repetidos adyacentes
La helicasa comienza
disociación de hebras
Se asocian proteínas de
unión a cadena simple
15 16

5. Elongación Resolución de la replicación en la hebra retardada
17 18
ADN Polimerasa I
Terminación Kornbnberg, 1957
Secuencias ACTIVIDAD POLIMERASA
terminadoras • Necesita Mg++ como cofactor
Retienen las horquillas • La energía es provista por la liberación de PPi
de replicación
• El ADN actúa como molde
Contienen secuencias
• Necesita un cebador que ofrezca un exrtremo
que facilitan la 3´OH libre para agregar nucleótidos
decatenación y
• La elongación ocurre en dirección 5´ 3´
separación de los
cromosomas resultantes
Requieren elementos de
terminación particulares
19 20

6. ADN Polimerasa I FIDELIDAD DE LA REPLICACIÓN
ACTIVIDAD EXONUCLEASA • Esta dada por la actividad exonucleasa 3´-´5´
•3´ 5´ “Proofreading” • Requerimiento de primers
corrección de síntesis • Imposibilidad de la polimerasa de agregar nucleótidos si no hay
apareamiento exacto en los nucleótidos previos
• Implica la imposibilidad de replicación en dirección 3´-5´.
•5´ 3´ “Nick Translation”
reemplazo de cebadores
21 22
ADN Polimerasa III El anillo corredizo y la procesividad
La DNA Pol III es la enzima principal en la replicación
Multimérica, con varias subunidades El core de DNA Pol III es poco procesivo
??? El anillo corredizo asegura una muy alta
procesividad
3’ 5’ exonucleasa
core
Pol C: polimerasa
dimerización Anillo corredizo
clamp loader
(cargador del anillo)
23 24

7. Avance de la horquilla Coordinación de hebras
de replicación
La DNA Pol III funciona
como dímero
Las hebras crecen de
modo coordinado,
avanzando en la
dirección de la horquilla
25 26
27 28

8. ADN polimerasas procariotas Primasa: síntesis del cebador
Primasa:
Polimerasas
Características I II III
Subunidades 1 >4 >10
Peso Molecular 103.000 88.000 830.000
Exonucleasa 3´ 5´ si si si
Exonucleasa 5´ 3´ si no no
Vel.Polimerización (nt/seg) 16-20 40 250-1.000
Procesividad (*) 3-200 1.500 >500.000
* Nucleótidos incororados antes de disociarse del ADN
Las DNA Polimerasas son enzimas elongadoras
Necesitan un cebador 3´OH
29 30
Helicasa: Separación de las hebras de ADN
Helicasa:
Girasa (topoisomerasa II )
Eliminación de tensión durante la replicación
QUINOLONAS
QUINOLONAS
(ácido nalidíxico)
(ácido nalidíxico)
Se une a la subunidad A de la
Se une a la subunidad A de la
DNA girasa (topoisomerasa)
DNA girasa (topoisomerasa)
espectro: Gram-positivos e
espectro: Gram-positivos e
infecciones urinarias
infecciones urinarias
31 32

9. Resolución de los cromosomas duplicados ADN Polimerasas Eucariotas
alfa delta Beta epsilon gama
Localización nuclear nuclear nuclear nuclear mitocondrial
replicación
replicación
Función retardada reparación reparación? replicación
continua
Cebado
Funcíón similar en E.coli DNA Pol I DNA Pol III DNA Pol II
Polimerización 5´ 3´ + + + + +
Exonucleasa 3´ 5´ - + - + +
Asociada a DNA primasa + - - - -
Acepta primer de ARN + + - ? -
Acepta primer de ADN + + + + +
Sensible a afidicolina + + - + -
33 34
La replicación en los eucariotas La replicación en los eucariotas
es similar a la bacteriana es similar a la bacteriana
La unión de PCNA (proteína tipo
Reconocimiento de origenes y anillo corredizo) desplaza a la
unión de helicasa (antigeno T) polimerasa α y recluta a la
polimerasa δ que continua la
sintesis de la hebra continua
La helicasa comienza la
disociación de hebras
Se une el complejo formado por la
Se asocian proteínas de unión a primasa y polimerasa α, a la hebra
cadena simple que mantienen las retardada, se sintetiza el cebador
hebras en condiciones para la
replicacion (RPA) Se une la proteína RFC a la he bra
retardada y la polimerasa α
Se une un complejo formado por la procede a la síntesis de los
primasa y polimerasa α, y se fragmentos de Okazaki
sintetiza el cebador
Se une la proteína RFC y comienza
la síntesis por la polimerasa α
35 36

10. La horquilla de replicación eucariota
El problema de replicar los extremos de moléculas
de ADN lineales
Como se inicia la replicación en el extremo 5´?
37 38
Replicación en los telómeros REPLICACIÓN DE LA CROMATINA
Telomerasa
•Enzima que cataliza la síntesis de los extremos
•Ribozima que contiene una molécula de ARN
que sirve como molde
•El ARN guía la adición de los nucleótidos
correctos
•Niveles variables de actividad de la telomerasa
•regulan la división celular y el envejecimiento
39 40